本發(fā)明屬于功能性醫(yī)用敷料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型可吸收的擔載中藥和生長因子的中藥納米紡絲復合纖維膜敷料及其制備方法，該敷料適用于創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)及急性或慢性損傷等不同傷口的覆蓋，在保護傷口、吸收分泌物的同時減少創(chuàng)面感染、促進傷口愈合方面具有廣泛應(yīng)用。

背景技術(shù)：

日常生活中皮膚在受到外界刺激如創(chuàng)傷、手術(shù)及燒傷等損傷以后會在皮膚表面形成傷口，不及時治療可能引起其它并發(fā)癥。所謂醫(yī)用敷料，即指用于包扎傷口用的覆蓋物。其主要作用是保護創(chuàng)傷皮膚、為傷口愈合提供良好的環(huán)境。

傳統(tǒng)醫(yī)用敷料的材質(zhì)主要使用脫脂棉紗布、紗布條、棉球和棉膜等天然纖維性材料，可以干燥傷口，具備物理隔離功能。雖然傳統(tǒng)敷料具有吸收性好、制作簡單、價格便宜等特點，但是傳統(tǒng)敷料存在一些問題，例如：傳統(tǒng)敷料與滲出物結(jié)痂后造成傷口黏連，在進行換藥時可引起新的創(chuàng)傷、且伴隨疼痛，同時傳統(tǒng)的敷料不具備加速愈合的能力，病原體易通過易引起細菌滋生，換藥工作量大等等。

隨著材料科學和醫(yī)學的不斷發(fā)展，越來越多新材料的研制及應(yīng)用，促進了現(xiàn)代敷料的發(fā)展，彌補了傳統(tǒng)敷料的不足，同時為滿足不同患者的需要，具有特殊功能性的醫(yī)用敷料也應(yīng)運而生。按照其材料的來源及用途不同可分為三大類：膠原型敷料、藻酸鹽類輔料和水膠體敷料。

膠原型敷料的特點是低抗原性、可降解及具有生物相容性，但是容易被細菌污染變質(zhì)，對滲出和感染性傷口創(chuàng)面不適用。

藻酸鹽類輔料的原材料是從棕藻中提煉出的藻酸，加工成藻酸鈣，于創(chuàng)面接觸時，通過離子交換，使不溶性藻酸鈣變?yōu)榭扇苄栽逅徕c。優(yōu)點為提供濕潤環(huán)境、止血功能、吸收性好、緩解疼痛、防水等，但也同時伴隨凝膠易被誤認為膿液或創(chuàng)面腐肉、干燥或有結(jié)痂的創(chuàng)面不宜使用的缺點。

水膠體敷料是有彈性的聚合水凝膠與合成橡膠和粘性物質(zhì)混合加工而成的敷料，水凝膠敷料有雙重粘性、可控制性吸收、能形成濕潤的愈合環(huán)境加速傷口愈合等，但是其高度的閉合性有時會導致過度濕潤及周圍皮膚的浸漬，膠層吸收大量滲出物后對創(chuàng)面會產(chǎn)生污染，應(yīng)用在大量滲出液的傷口時，需要經(jīng)常更換敷料否則滲出液會外漏。

因此，尋找一種新型的敷料成為目前研究的重點。新型敷料應(yīng)滿足以下幾點要求：首先，生物相容性好，不會對人體產(chǎn)生刺激、中毒和病變等不良反應(yīng)；其次，具有保濕、稀釋的作用，在有效保留滲出液的同時不積液；不易與傷口滲出物黏連，盡量減少對新生組織的損傷，換藥時疼痛感輕；最后應(yīng)具有預(yù)防傷口感染的作用，抗菌性較好。

隨著科技的進步，對敷料除了上述幾點要求之外還應(yīng)包括能否生物降解以及降低環(huán)境的污染等。而聚乳酸纖維作為醫(yī)用敷料有著良好的生物相容性、生物降解性，并且對于生物體不會引起異物反應(yīng)，是一種綠色醫(yī)用高分子材料。聚乳酸纖維敷料與傳統(tǒng)敷料進行比較，其覆蓋的創(chuàng)面愈合速度增快。

目前在把靜電紡絲材料應(yīng)用到傷口修復方面的研究仍處于初期階段，因此很多理想傷口敷料需具備的條件現(xiàn)在還難以完全滿足，但是靜電紡絲材料因為是納米或者微米纖維膜，具備一定的優(yōu)越性能。因而能基本滿足傷口敷料所必需的條件，且如果在多聚物材料中加入天然多聚物分子，就能提高靜電紡絲纖維膜在傷口愈合中的生物相容性，進而提高其應(yīng)用效果。

目前臨床上燒傷或者慢性難愈性創(chuàng)面等患者多伴有不同程度的皮膚缺失，治療中常遇到創(chuàng)面愈合緩慢，自體皮源不足，皮膚附件破壞，以及皮膚替代物的性能較差等問題，導致皮膚創(chuàng)面愈合后質(zhì)量較差，因此對于慢性創(chuàng)面的治療一直是臨床中的難點。而隨著生長因子在臨床的應(yīng)用，即給這些難愈合創(chuàng)面的治療帶來了新的思路。成纖維細胞生長因子(bfgf)在促進皮膚創(chuàng)面愈合和植皮成活，改善組織工程皮膚替代物的性能，提高皮膚再生質(zhì)量等多方面已有較多應(yīng)用。但是也存在一些缺點，主要是所用劑型易流失、穩(wěn)定性差以及難以控制其釋放。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本研究將可降解高分子聚合物—聚乳酸-乙醇酸(plga)共聚物作為載體，以其擔載姜黃素(cur)和成纖維細胞生長因子(bfgf)，以靜電紡絲的方法制備可降解納米紡絲復合材料。其中，聚乳酸-乙醇酸(plga)具有可降解、無毒的特點，是一種可降解高分子聚合物。與聚乳酸(pla)相比，plga是丙交酯(la)和乙交酯(ga)的共聚物，可通過改變la和ga的摩爾數(shù)比例調(diào)節(jié)plga在生物體內(nèi)的降解速率，降解時間最短數(shù)周，最長可達數(shù)年，且生物相容性好。本發(fā)明所使用的plga由中科院長春應(yīng)用化學研究所提供，n(la)：n(ga)＝80：20。

姜黃素(curcumin，cur)存在于姜黃、郁金等姜科植物干燥根莖中，是一種天然化學成分。姜黃素因其抗氧化、抗炎抗腫瘤等作用在臨床上應(yīng)用非常廣泛。

生長因子在醫(yī)學美容方面的研究成為當今的熱點。成纖維細胞生長因子能夠促進細胞增殖、分化和成熟，還可以通過調(diào)節(jié)膠原的降解、更新，達到減少疤痕形成、縮短創(chuàng)面愈合時間的作用。因此成纖維細胞生長因子在傷口愈合、瘢痕修復過程中起著舉足輕重的作用。

本發(fā)明結(jié)合了上述三種原料的優(yōu)勢，采用靜電紡絲技術(shù)將plga、cur和bfgf結(jié)合到一起，制成可降解的納米紡絲復合纖維膜。通過對納米紡絲復合纖維膜的表征、降解能力、穩(wěn)定性細胞增殖實驗、創(chuàng)面修復實驗以及安全性的研究，綜合評價其作為敷料的價值，進而為新型可降解納米緩釋材料的制備以及應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明的一種中藥納米紡絲復合纖維膜敷料，是通過靜電紡絲技術(shù)，將一種生物可吸收的高分子材料—聚乳酸-乙醇酸(plga)共聚物制成溶液，并以其為載體擔載姜黃素和成纖維細胞生長因子(bfgf)兩種藥物；其中，姜黃素占聚乳酸-乙醇酸共聚物質(zhì)量分數(shù)為1％-3％，成纖維細胞生長因子占聚乳酸-乙醇酸共聚物質(zhì)量分數(shù)為8.33×10^-4％-33.33×10^-4％；所述的plga共聚物，丙交酯la與乙交酯的摩爾比為80：20。

一種中藥納米紡絲復合纖維膜敷料的制備方法，具體步驟如下：

(1)將plga共聚物溶解在氯仿中，配成質(zhì)量分數(shù)為5％-20％的plga靜電紡絲溶液，然后在室溫下磁力攪拌，過夜；

(2)將姜黃素加入到步驟(1)的溶液中，使姜黃素占plga的質(zhì)量分數(shù)為1％-3％，在室溫下磁力攪拌，過夜，得到油相溶液；

(3)將乳化劑加入到上述油相溶液中，乳化劑的質(zhì)量分數(shù)為3％-5％，使乳化劑均勻分散在油相中，在冰水浴條件下，預(yù)乳化溶液1-2分鐘，乳化速率為3000-8000r/min，隨后向該油相溶液中加入bfgf的水溶液，使bfgf占plga的質(zhì)量分數(shù)為8.33×10^-4％-33.33×10^-4％；然后在冰水浴條件下，繼續(xù)乳化2-5分鐘，然后在室溫環(huán)境中靜止，直至溶液中沒有氣泡，從而得到均一、穩(wěn)定的油包水乳液；

(4)將步驟(3)得到的油包水乳液進行靜電紡絲，得到復合納米靜電紡絲材料；

(5)將步驟(4)得到的復合納米靜電紡絲材料于25-30℃下避光，抽濾干燥48-60h，脫去纖維中殘留的氯仿溶劑，從而得到中藥納米紡絲人工敷料復合膜；厚度為1-3mm、纖維直徑為200-400nm。

進一步地，步驟(1)所述的plga共聚物，其中，丙交酯la與乙交酯的摩爾比為80：20。

進一步地，步驟(3)所述的乳化劑為十二烷基硫酸鈉(sds)。

進一步地，步驟(4)所述的靜電紡絲，具體步驟如下：

(a)將玻璃注射器固定在鐵架臺上，調(diào)整注射器高度與接收屏位置，使噴絲口正對接收屏的中心，在注射器推桿及推桿與管筒接合部位用硅脂潤滑、密封；在接收屏上粘貼錫箔紙；

(b)以玻璃注射器的針頭作為靜電場噴絲頭，噴絲口的直徑為0.2-0.41mm，調(diào)整噴絲口與接收屏之間的距離為5-10cm，控制紡絲溫度25-30℃；向注射器中注入步驟(3)中制備的油包水乳液，將推桿放入注射器內(nèi)，控制推桿的推進速度為0.5-1ml/h；此時打開電源，外加靜電場強度為20-30kv/cm，開始靜電紡絲；

(c)紡絲液經(jīng)電場拉伸噴射到錫箔紙上，5-10h后關(guān)閉高壓發(fā)生器，停止噴絲，在收集屏上得到復合納米靜電紡絲材料。

一種中藥納米紡絲復合纖維膜敷料在臨床對皮膚缺損治療方面的應(yīng)用。

本發(fā)明將可降解的高分子聚合物plga作為載體，擔載cur和bfgf，通過靜電紡絲的方法制得的復合緩釋膜具有良好的納米結(jié)構(gòu)，具有維持藥物緩釋效果，能夠促進傷口修復與愈合，且無急性毒性、刺激性和致敏性，有助于細胞的生長與增殖。滿足醫(yī)學臨床對皮膚缺損治療方面的應(yīng)用，在藥物緩控釋領(lǐng)域和可降解納米敷料方面有著潛在的醫(yī)用價值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點如下：

1.采用靜電紡絲技術(shù)將plga、cur和bfgf結(jié)合到一起，制成可降解的復合納米膜。不但具有天然抗菌成分姜黃素的消炎、抗氧化作用還結(jié)合了纖維細胞生長因子能夠促進細胞增殖，調(diào)節(jié)膠原降解減少疤痕的形成作用。

2.具有維持藥物的緩釋作用，可降低成纖維生長因子單獨用藥的穩(wěn)定性差、易流失的特點。

3.利用可降解的高分子聚合物plga作為載體，擔載cur和bfgf，通過靜電紡絲的方法制得的復合薄膜具有良好的納米結(jié)構(gòu)，具有良好的透氣性、防水功性且納米尺寸的孔徑利于細胞的增殖和傷口的愈合。

附圖說明：

圖1：本發(fā)明實施例1制備的bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅰ的掃描電鏡圖；

圖2：本發(fā)明實施例2制備的bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅱ的掃描電鏡圖；

圖3：本發(fā)明實施例3制備的bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅲ的掃描電鏡圖；

圖4：本發(fā)明實施例4所述的mtt法測試兔背部皮膚成纖維細胞增殖實驗結(jié)果直方圖；

圖5：大鼠術(shù)后貼敷中藥納米紡絲復合纖維膜不同時間的傷口愈合圖；其中，(a)4天、(b)8天、(c)12天；

圖6：創(chuàng)傷后貼服中藥納米紡絲復合纖維膜12天的大鼠傷口he染色切片圖，放大倍數(shù)為40x；其中，(a)：空白組；(b)：plga組，(c)：1％cur/plga組，(d)bfgf-cur/plga納米紡絲膜ⅲ組。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步地說明。

實施例1bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜敷料ⅰ的制備方法，具體步驟如下：

(1)以氯仿為溶劑將相對分子質(zhì)量為15萬的高分子材料聚乳酸-乙醇酸(plga)溶解到氯仿中，配成質(zhì)量分數(shù)為10％的plga靜電紡絲溶液，在室溫下磁力攪拌，過夜；

(2)將姜黃素加入到步驟(1)的溶液中，使姜黃素占plga的質(zhì)量分數(shù)為1％，在室溫下磁力攪拌，過夜；

(3)攪拌均勻后將相對于聚合物質(zhì)量分數(shù)為5％的sds(十二烷基硫酸鈉)作為乳化劑加入到上述油相溶液中，讓sds均勻分散在油相中。將聚合物/sds的油相溶液放置于燒杯中，在冰水浴條件下，使用高剪切混合乳化機預(yù)乳化溶液2分鐘，乳化速率為5000r/min，隨后向該油相溶液中加入質(zhì)量-體積濃度為50ug/ml的bfgf的水溶液，使bfgf占plga的質(zhì)量分數(shù)為8.33×10^-4％，繼續(xù)乳化3分鐘，然后在室溫環(huán)境中靜止，直至溶液中沒有氣泡，從而得到均一、穩(wěn)定的油包水乳液；

(4)將玻璃注射器固定在鐵架臺上，調(diào)整注射器高度與接收屏位置，使噴絲口正對接收屏的中心,在注射器推桿及推桿與管筒接合部位用硅脂潤滑、密封。在接收屏上粘貼面積適宜的錫箔紙，

(5)以玻璃注射器的針頭作為靜電場噴絲頭，噴絲口的直徑為0.35mm，調(diào)整噴絲口與接收屏之間的距離為8cm，控制紡絲溫度30℃。注射器中注入(3)中制備的油包水乳液，將涂抹凡士林的推桿放入注射器內(nèi)，控制溶液下降速度為0.8ml/h。此時打開電源，外加靜電場強度為25kv/cm，開始靜電紡絲電紡。

(6)紡絲液經(jīng)電場拉伸噴射到錫箔紙上，收集7h后關(guān)閉高壓發(fā)生器，停止噴絲，在收集屏上得到復合納米靜電紡絲材料bfgf-cur/plgaⅰ。

(7)將復合納米靜電紡絲材料bfgf-cur/plgaⅰ避光放于30℃真空干燥箱內(nèi)，用真空泵抽濾干燥50h，脫去纖維中殘留的氯仿溶劑，從而得到本發(fā)明所述的bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜敷料ⅰ，厚度2.0mm、纖維直徑256nm。

實施例2bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜敷料ⅱ的制備方法，具體步驟如下：

(1)以氯仿為溶劑將相對分子質(zhì)量為15萬的高分子材料plga溶解到氯仿中，配成質(zhì)量分數(shù)為10％的plga靜電紡絲溶液，在室溫下磁力攪拌，過夜；

(2)將姜黃素的氯仿溶液加入到步驟(1)的溶液中，使姜黃素占plga的質(zhì)量分數(shù)為1％，在室溫下磁力攪拌，過夜；

(3)攪拌均勻后將相對于聚合物質(zhì)量分數(shù)為5％的sds(十二烷基硫酸鈉)作為乳化劑加入到上述油相溶液中，讓sds均勻分散在油相中。將聚合物/sds的油相溶液放置于燒杯中，在冰水浴條件下，使用高剪切混合乳化機預(yù)乳化溶液2分鐘，乳化速率為5000r/min，隨后向該油相溶液中緩慢加入質(zhì)量-體積濃度為100ug/ml的bfgf的水溶液，使bfgf占plga的質(zhì)量分數(shù)為16.67×10^-4％，繼續(xù)乳化3分鐘，然后在室溫環(huán)境中靜止，直至溶液中沒有氣泡，從而得到均一、穩(wěn)定的油包水乳液；

(4)將玻璃注射器固定在鐵架臺上，調(diào)整注射器高度與接收屏位置，使噴絲口正對接收屏的中心,在注射器推桿及推桿與管筒接合部位用硅脂潤滑、密封。在接收屏上粘貼面積適宜的錫箔紙；

(5)以玻璃注射器的針頭作為靜電場噴絲頭，噴絲口的直徑為0.35mm，調(diào)整噴絲口與接收屏之間的距離為8cm，控制紡絲溫度30℃。注射器中注入(3)中制備的紡絲液，將涂抹凡士林的推桿放入注射器內(nèi)，控制溶液下降速度為0.8ml/h。此時打開電源，外加靜電場強度為25kv/cm，開始靜電紡絲電紡。

(6)紡絲液經(jīng)電場拉伸噴射到錫箔紙上，收集7h后關(guān)閉高壓發(fā)生器，停止注射，在收集屏上得到復合納米靜電紡絲材料bfgf-cur/plgaⅱ。

(7)將復合納米靜電紡絲材料bfgf-cur/plgaⅱ避光放于30℃真空干燥箱內(nèi)，用真空泵抽濾干燥50h，脫去纖維中殘留的氯仿溶劑，從而得到本發(fā)明所述bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜敷料ⅱ，厚度2.2mm、纖維直徑301nm。

實施例3bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜敷料ⅲ的制備方法，具體步驟如下：

(1)以氯仿為溶劑將相對分子質(zhì)量為15萬的高分子材料聚乳酸-乙醇酸(plga)溶解到氯仿中，配成質(zhì)量分數(shù)為10％的plga靜電紡絲溶液，在室溫下磁力攪拌，過夜；

(2)將姜黃素的氯仿溶液加入到步驟(1)的溶液中，使姜黃素占plga的質(zhì)量分數(shù)為1％，在室溫下磁力攪拌，過夜；

(3)攪拌均勻后將相對于聚合物質(zhì)量分數(shù)為5％的sds(十二烷基硫酸鈉)作為乳化劑加入到上述油相溶液中，讓sds均勻分散在油相中。將聚合物/sds的油相溶液放置于燒杯中，在冰水浴條件下，使用高剪切混合乳化機預(yù)乳化溶液2分鐘，乳化速率為5000r/min，隨后向該油相溶液中緩慢加入質(zhì)量-體積濃度為200ug/ml的bfgf的水溶液，使bfgf占plga的質(zhì)量分數(shù)為33.33×10^-4％繼續(xù)乳化3分鐘，然后在室溫環(huán)境中靜止，直至溶液中沒有氣泡，從而得到均一、穩(wěn)定的油包水乳液

(4)將玻璃注射器固定在鐵架臺上，調(diào)整注射器高度與接收屏位置，使噴絲口正對接收屏的中心,在注射器推桿及推桿與管筒接合部位用硅脂潤滑、密封。在接收屏上粘貼面積適宜的錫箔紙；

(5)以玻璃注射器的針頭作為靜電場噴絲頭，噴絲口的直徑為0.35mm，調(diào)整噴絲口與接收屏之間的距離為8cm，控制紡絲溫度30℃。注射器中注入(3)中制備的紡絲液，將涂抹凡士林的推桿放入注射器內(nèi)，控制溶液下降速度為0.8ml/h。此時打開電源，外加靜電場強度為25kv/cm，開始靜電紡絲電紡。

(6)紡絲液經(jīng)電場拉伸噴射到錫箔紙上，收集7h后關(guān)閉高壓發(fā)生器，停止注射，在收集屏上得到復合納米靜電紡絲材料bfgf-cur/plgaⅲ。

(7)將復合納米靜電紡絲材料避光放于30℃真空干燥箱內(nèi)，用真空泵抽濾干燥50h，脫去纖維中殘留的氯仿溶劑，從而得到本發(fā)明所述bfgf-cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜敷料ⅲ。這種新型的人工敷料厚度2.2mm、纖維直徑326nm。

實施例4：中藥納米紡絲復合纖維膜敷料細胞增殖實驗，其實驗方法的步驟和條件如下：

采用四唑鹽比色法(mtt法)測試兔背部皮膚成纖維細胞增殖實驗。用打孔器將制備得到的不同纖維膜plga、bfgf-cur/plgaⅰ組、bfgf-cur/plgaⅱ組、bfgf-cur/plgaⅲ組分別制成直徑為6mm的圓片，紫外臭氧進行消毒，用無菌眼科鑷子放置于96孔板底部，備用。然后用質(zhì)量分數(shù)為0.25％的胰蛋白酶水溶液消化第三代成纖維細胞，重懸，計數(shù)，并以細胞密度5×10³個/μl，200μl/孔接種于底部鋪放纖維膜的96孔板中相應(yīng)的孔內(nèi)，置于37℃，體積分數(shù)為5％的co2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、3、7天，取出96孔板，每孔加入質(zhì)量體積分數(shù)為5mg/ml的mtt水溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去孔中的液體，加入200μl鹽酸異丙醇，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，吹打混勻后移入另一96孔板內(nèi)，全自動酶標儀540nm波長檢測各孔吸光度值，結(jié)果見圖4。

從圖4中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，bfgf/plga/cur敷料表面的成纖維細胞數(shù)量多于單純的plga纖維膜表面；而隨著bfgf含量的增大細胞數(shù)量逐漸增加，不同的實驗組在不同時間內(nèi)的細胞增殖能力有顯著性差異(p<0.05)。說明bfgf/cur/plga有助于細胞在敷料表面的生長及增殖，其中bfgf-cur/plgaⅲ組的增殖促進作用最強。

實施例5：中藥納米紡絲復合纖維膜敷料對大鼠創(chuàng)面修復作用實驗，其實驗方法的步驟和條件如下：

(1)動物分組與造模

實驗動物大鼠30只，體重在250g左右、8周齡的雄性wister大鼠，喂飼普通鼠繁育飼料，自由飲水。飼養(yǎng)一周后，隨機分成3組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。

實驗大鼠統(tǒng)一做如下處理：(1)按照300mg/kg的劑量采用腹腔注射的方式注射水合氯醛溶液進行麻醉；(2)將大鼠背部的毛剃凈，無菌處理；(3)打孔器(直徑為1cm)蘸紅色印泥，在大鼠的背部距離脊柱1cm的兩側(cè)分別標記傷口的位置；(4)用手術(shù)剪刀在標記處制作圓形皮膚傷口，直徑為1cm，每側(cè)2個，共4個創(chuàng)口；(5)去除皮膚的表皮、真皮及皮下結(jié)締組織，深至肌層；(6)用醫(yī)用棉簽處理傷口表面的血液，擦干后，采取同體對照的形式貼敷材料。敷料外層用無菌紗布包扎，貼敷至預(yù)定時間。

(2)取組織

分別于傷后第4d、8d、12d共3個時間對上一步驟處理過的實驗動物大鼠進行取材。以質(zhì)量分數(shù)為4％的水合氯酸麻醉，脫臼處死。每個時間點取一組共10只大鼠，40個創(chuàng)面。取材時用脊椎斷裂法處死大鼠后，立即剪取創(chuàng)口及創(chuàng)緣皮膚，將其中5只大鼠的創(chuàng)面肉芽組織放入福爾馬林溶液固定，另外5只大鼠取創(chuàng)面肉芽組織，約為0.2×0.4cm大小，放入凍存管內(nèi)，至于液氮中保存。

(3)大鼠創(chuàng)面修復大體觀察

術(shù)后于每個時間點取材前觀察創(chuàng)面的外表情況，包括創(chuàng)面表面滲出情況，以及創(chuàng)面、創(chuàng)緣新生表皮增生情況。

創(chuàng)面修復實驗結(jié)果見圖5。從圖中可以看出，皮膚損傷后數(shù)日，傷口附近的整層皮膚向傷口中心移動。觀察過程中可見傷口逐漸縮小，從而促進傷口愈合。

創(chuàng)傷后第4天觀察到，所有創(chuàng)面的傷口均有收縮。創(chuàng)面有較多的炎性滲出物，并伴有結(jié)痂。但創(chuàng)面周圍無明顯紅腫，空白組炎癥反應(yīng)比較嚴重、傷口收縮不太明顯，貼敷bfgf/cur/plga納米紡絲復合膜ⅲ的傷口收縮明顯，與其他貼敷bfgf/cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅱ和ⅰ的傷口無明顯差異。

創(chuàng)傷后第8天觀察到，傷口大部分結(jié)癡，傷口面積明顯縮小，周圍有鼠毛生長。貼敷bfgf/cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅲ的傷口與1％cur/plga復合納米紡絲復合膜(紡絲液中不加bfgf)的傷口可以看見鮮紅色的肉芽組織。

創(chuàng)傷后第12天，各處理組大鼠傷口面積均比空白對照組小，愈合明顯。通過照片可以觀察到，創(chuàng)面進一步縮小，貼敷bfgf/cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅲ的創(chuàng)面愈合效果尤為明顯，傷口周邊被快速生長的鼠毛所覆蓋；空白創(chuàng)面仍有輕微的發(fā)炎。

(4)組織學觀察

將上述固定好的組織修塊后，逐級經(jīng)過酒精脫水、二甲苯透明30min后，石蠟浸透、包埋，切片，切片厚為5μm，經(jīng)蘇木精、伊紅染色(he染色)，脫水透明后，用中性樹脂封片進行觀察。

he染色

(a)切片脫蠟到水烤干切片后，浸入二甲苯5min脫去石蠟。浸入無水乙醇3min，洗去二甲苯。按順序分別浸入95％、80％、70％、50％乙醇各3min。浸入蒸餾水中5min，洗去酒精。

(b)染色、脫水，切片浸入蘇木精液5min。自來水洗去浮色。1％鹽酸酒精分化約20s。自來水沖洗,使切片藍化。蒸餾水洗。入伊紅染液復染,使細胞質(zhì)染成紅色。按順序經(jīng)95％乙醇中脫水和分化伊紅顏色各1min。入無水乙醇中3min徹底脫水。

(c)透明、封畫

二甲苯透明處理5min。擦去玻片四周的二甲苯，在載坡片上滴加樹膠2滴,加蓋坡片封固。

(d)染色結(jié)果

細胞核被蘇木精染成藍色，細胞質(zhì)、結(jié)締組織和嗜酸性顆粒等被伊紅染成不同程度的紅色。

通過不同時間處理的傷口處組織進行石蠟切片，he染色，觀察其新生組織特征。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：第四天空白創(chuàng)面炎性滲出物痂下軟組織有大量中性粒炎癥細胞浸潤，無肉芽組織形成。與空白對照相比，以1％cur/plga為敷料的創(chuàng)面炎癥細胞較少；以plga為敷料的創(chuàng)面有少量的成纖維細胞出現(xiàn)；而貼敷bfgf/cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅲ的傷口成纖維細胞的數(shù)量較plga有所增多。第8天時創(chuàng)面痂下軟組織中出現(xiàn)了早期的肉芽組織。從而促進傷口的愈合。

從圖6可以觀察到，第12天發(fā)現(xiàn)空白創(chuàng)面初期的肉芽組織中仍有大量中性粒細胞滲出，其下有大量幼稚的新生毛細血管及成纖維細胞，而貼敷bfgf/cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅲ的創(chuàng)面與空白創(chuàng)面及貼敷bfgf/cur/plga中藥納米紡絲復合纖維膜ⅱ和ⅰ相比，具有較多的新生神經(jīng)和成熟的毛細血管，炎細胞明顯減少，表面創(chuàng)面修復較快。

(5)統(tǒng)計學處理

采用spss21.0軟件進行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。組間比較采用one-wayanova分析,方差齊兩兩比較采用lsd檢驗，方差不齊兩兩比較采用t檢驗。