本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雌激素是女性體內(nèi)關(guān)鍵性的激素，女性進(jìn)入更年期后，隨著卵巢功能的衰退和體內(nèi)雌激素水平的下降，女性患骨質(zhì)疏松、老年癡呆、心血管等疾病的發(fā)病率也隨之上升。雖然雌激素替代療法可以有效預(yù)防上述疾病的發(fā)生與發(fā)展，但長期應(yīng)用雌激素易產(chǎn)生高血壓、水腫、高血凝狀態(tài)等副作用，并增加女性患乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤的發(fā)病危險。植物雌激素是來源于植物，與哺乳動物的類固醇激素-17β-雌二醇有相似結(jié)構(gòu)的多羥基化合物。因植物雌激素?zé)o人工合成雌激素替代療法所引起的副作用而引起人們的廣泛關(guān)注。
辛夷為木蘭科植物望春花magnoliabiondiipamp的干燥花蕾。性溫味辛，歸肺與胃經(jīng)，具有發(fā)散風(fēng)寒，通鼻竅的功效。臨床常用于風(fēng)寒感冒，鼻塞，鼻淵。且辛夷的揮發(fā)油常用于化妝品中，具有良好的美容功效，但辛夷提取過揮發(fā)油之后剩余的藥材被當(dāng)作藥渣丟棄，造成了資源的浪費(fèi)，目前對辛夷水提物雌激素的研究還未見公開報道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，可有效解決辛夷水提物的制備及其治療雌激素缺乏癥的用藥問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的辛夷水提物是，將辛夷每次加10倍藥物重量的水煎煮3次，第一次先加10倍重量的水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加藥物10倍重量的水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加藥物10倍重量的水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得辛夷水提物。
本發(fā)明辛夷水提物具有雌激素樣活性，作為唯一活性成分有效用于制備雌激素類藥物，開拓了辛夷的藥用價值和商業(yè)價值，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的辛夷水提物是，將辛夷100g每次加1000ml的水煎煮3次，第一次先加1000ml的水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加1000ml的水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加1000ml的水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得辛夷水提物，提取率7.9％。
實(shí)施例2
本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的辛夷水提物是，將辛夷50g每次加500ml的水煎煮3次，第一次先加500ml的水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加500ml的水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加500ml的水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得辛夷水提物，提取率7.7％。
實(shí)施例3
本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的辛夷水提物是，將辛夷200g每次加2000ml的水煎煮3次，第一次先加2000ml的水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加2000ml的水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加2000ml的水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得辛夷水提物，提取率8.1％。
本發(fā)明提取物作為唯一活性成分經(jīng)實(shí)驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用，具有雌激素樣活性和有效用于制備雌激素藥物，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：
本發(fā)明首先通過小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)對辛夷水提物進(jìn)行雌激素樣活性的篩選，接著采用mcf-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對辛夷水提物進(jìn)行體外雌激素樣活性的篩選，并且分析辛夷水提物對未成熟雌性小鼠的體重增長率、血清e2(雌二醇)、lh(促黃體生成素)、fsh(卵泡刺激素)的影響，初步探討其作用特點(diǎn)。
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1實(shí)驗(yàn)藥物
本發(fā)明辛夷水提物。
1.2實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞株
清潔級昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9～12g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證號：scxk(京)2016-0011)。人乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。
1.3試劑
dmem高糖培養(yǎng)基(gibcoinvitrogen)；去雌激素胎牛血清(廣州四季青)；無酚紅dmem高糖培養(yǎng)基、葡聚糖-活性炭去激素胎牛血清(hyclone)；17β-雌二醇(17β-estrogen，e2)、氨芐青霉素、tris堿(sigma)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥)；edta、mtt及dmso(amresco)；e2、fsh、lhelisa試劑盒(r&d)。
1.4儀器
倒置顯微鏡(nikoneclipsets100)；二氧化碳培養(yǎng)箱(stik)；sorvallst16rcentrifuge高速低溫冷凍離心機(jī)(thermofisherscientific公司)；酶標(biāo)儀(bio-rad680)；超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán))；90-3磁力攪拌器(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；rd-7080全自動新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(nichipetexplus)；ab204-n電子讀數(shù)分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)；10cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、凍存管(corning)；普通手術(shù)器械。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)
將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組，持續(xù)給藥7天。正常組每日蒸餾水0.02ml/g灌胃；陽性對照組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；辛夷水提物按藥典規(guī)定人用藥量的20倍量×提取率，配成混懸液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次給藥24h后，摘眼球取血，脫頸椎處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)(子宮濕重×(體重)-1×100％)。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與正常組相比，計算p值，考察有無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2mcf-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
mcf-7細(xì)胞經(jīng)含5％去雌激素胎牛血清的無酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，pbs洗兩次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入無酚紅dmem培養(yǎng)基吹打均勻，以2×104個/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490nm下測定各孔吸光度值(a)，計算平均a值和細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。
細(xì)胞活力＝各組od值/正常組od值
2.3elisa法檢測血清e2、lh、fsh
小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1h后，3000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。按照elisa試劑盒說明書仔細(xì)操作。
2.4統(tǒng)計處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1辛夷水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響
與正常組相比，辛夷水提物能顯著誘導(dǎo)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的增加(p<0.05)。提示辛夷水提物在體內(nèi)具有雌激素樣作用。見表1。
表1辛夷水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響(
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.0
3.2辛夷水提物對mcf-7細(xì)胞促增殖作用
辛夷水提物在10-2mg/ml時與正常組比，對mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用(p<0.05)。提示辛夷水提物在體外具有雌激素樣作用。見表2。
表2辛夷水提物對mcf-7細(xì)胞增殖的影響(
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01
3.3辛夷水提物對血清e2、lh、fsh的影響
與正常組相比，辛夷水提物能顯著增加小鼠血清e2、lh的水平，但基本不影響血清fsh的水平(p<0.05)。提示辛夷水提物在體具有雌激素樣作用，可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。見表3。
表3辛夷水提物對血清e2、lh、fsh的影響(
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01
四結(jié)論
子宮中含有大量的雌激素受體(ers)，雌激素類物質(zhì)通過與該受體結(jié)合，可誘導(dǎo)子宮靶蛋白(ips)含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生等，因此可以通過測定外源雌激素對性未成熟小鼠子宮促增長作用來評價藥物的雌激素樣活性。本實(shí)驗(yàn)采用性未成熟雌性小鼠子宮濕重與體重之比(子宮系數(shù))作為評價雌激素樣活性的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辛夷水提物可顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)，提示辛夷水提物在體內(nèi)具有雌激素樣作用。
mcf-7細(xì)胞是雌激素受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞株，能特異地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)而增殖，是最常用的檢測雌激素樣活性的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛夷水提物在濃度為0.01mg/ml時對mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用。提示辛夷水提物在體內(nèi)、體外均有一定的雌激素樣作用。
雌二醇是體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進(jìn)和調(diào)節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。促黃體生成素由垂體產(chǎn)生的一種激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種激素，主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，促進(jìn)整個卵巢長大。研究發(fā)現(xiàn)，辛夷水提物可以顯著性增加未成熟雌性小鼠的血清e2以及l(fā)h的水平，但對fsh的影響不大。推測辛夷水提物增加小鼠子宮系數(shù)發(fā)揮雌激素樣活性可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。
實(shí)驗(yàn)證明，辛夷水提物作為唯一活性成分有效用于制備雌激素藥物，實(shí)現(xiàn)辛夷水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，開拓了制備雌激素類藥物的新途徑，提高了辛夷的藥用價值和商業(yè)價值，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。