本發(fā)明涉及序列肽rgdf修飾的釕多吡啶配合物(4’-甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酰胺-rgdf)雙(2,2’-聯(lián)吡啶)二氯化釕(ru-co-rgdf)的制備及ru-co-rgdf/survivin-sirna基因遞送系統(tǒng)的構(gòu)建，并且對其進行了體內(nèi)外抗腫瘤活性和基因沉默效率的評價。本專利主要是通過rgdf修飾，增強釕多吡啶配合物的靶向性，使在靶部位的濃度增加，從而減小副作用，提高了治療指數(shù)；

背景技術(shù)：

目前，癌癥已經(jīng)成為世界第一位致死疾病，治療癌癥是目前科學(xué)研究者們的主要目標(biāo)之一。隨著醫(yī)藥和納米技術(shù)的發(fā)展，基因治療癌癥成為可能?；蛑委熓菍⑼庠茨康幕蛲ㄟ^載體或其它途徑導(dǎo)入體內(nèi)并在靶組織和靶細胞中顯示出相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)從而達到治療疾病的一種方法。

rnai(rnainterference)即rna干涉，是近年來發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象,是由雙鏈rna(dsrna)介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。但是sirna存在很多缺點，如本身帶有負電荷導(dǎo)致不能穿過細胞膜進入細胞，這類問題的解決成為實現(xiàn)利用rnai達到基因治療目的的關(guān)鍵。

survivin基因編碼產(chǎn)生的survivin蛋白以二聚體的形式存在,是凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosisproteins,iaps)的一種新穎的抗細胞凋亡蛋白因子,也是迄今人們所發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。

釕配合物與核酸的相互作用研究已經(jīng)經(jīng)歷了近三十年的歷史，其研究成果目前主要用于以下幾個方面：核酸結(jié)構(gòu)探針、核酸分子光開關(guān)、ph傳感器、化學(xué)核酸酶、基因治療、抗癌藥物。目前釕多吡啶配合物ru-cooh的制備是通過加熱回流合成的，其粒徑在50-70nm左右，其化學(xué)形狀穩(wěn)定，形狀為較規(guī)則的球形，其具備一般納米材料的特性，其表面有羧基基團，為化學(xué)修飾提供了豐富的反應(yīng)位點，因此可實現(xiàn)釕多吡啶配合物ru-cooh的修飾來增加其靶向性。

rgdf是一種含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”氨基酸序列的多肽，可識別腫瘤細胞表面特異表達的整合素，并與其特異性結(jié)合從而來介導(dǎo)腫瘤的靶向治療。經(jīng)過rgdf序列肽修飾的抗腫瘤藥物及其遞送系統(tǒng)，可增加藥物的主動靶向性，從而達到特異性治療的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有靶向性的基因載體，ru-co-rgdf。

本發(fā)明所述基因載體ru-co-rgdf的制備方法，包括以下步驟：合成4’-甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸與h-r(tos)-g-d(obzl)-f-obzl通過dcc/hobt法縮合后，再經(jīng)過強酸脫保護，最后與雙(2,2’-聯(lián)吡啶)二氯化釕縮合，即得。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種基因遞送系統(tǒng)，由基因載體ru-co-rgdf和抗腫瘤基因治療藥物survivin-sirna制備而成。

本發(fā)明所述的基因遞送系統(tǒng)，基因載體ru-co-rgdf和抗腫瘤基因治療藥物survivin-sirna的重量比為1.66:1。

本發(fā)明所述的基因遞送系統(tǒng)，為納米結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明另一個目的在于提供基因遞送系統(tǒng)的制備方法。

本發(fā)明所述的制備方法，包括以下步驟：基因載體ru-co-rgdf與魚精蛋白在常溫下混合，靜置待用，取抗腫瘤基因survivin-sirna與dna在常溫下混合，室溫待用，將上述兩者溶液混合后，即得ru-co-rgdf/survivin-sirna。

其中，ru-co-rgdf由以下方法制備而成：4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-羧酸與h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl在thf與少量dmf中通過ddc/hobt反應(yīng)，然后再脫掉保護基團，最后與順式-雙(2,2'-聯(lián)吡啶)二氯化釕在加熱回流，氮氣保護下反應(yīng)8小時得到ru-co-rgdf。

優(yōu)選的，ru-co-rgdf由以下方法制備而成:

1)boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl的合成

精氨酸和天冬氨酸主鏈用boc保護氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用obzl保護羧基端，側(cè)鏈用適宜的保護基(叔丁氧羰基)保護的l-氨基酸，液相法接肽，得到兩個全保護的二肽:boc-arg(tos)-gly-obzl和boc-asp(obzl)-phe-obzl。分別用氫解方法脫去obzl保護和酸解方法脫去boc保護后，繼續(xù)用液相法接肽，得到全保護四肽。在冰浴的條件下，用溶有hcl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mgboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl，攪拌反應(yīng)，用tlc板監(jiān)測反應(yīng)。等反應(yīng)結(jié)束后，抽氣，將酸氣抽干。即得h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl。

2)合成4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl

將28mg4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-羧酸與117mgh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl用液相法接肽，制得124mg全保護的中間體4’甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-?；?arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl。

3)合成4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-?；?rgdf

用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液(v:v＝3:1)于冰水浴中反應(yīng)30分鐘，加入冰乙醚終止反應(yīng)后離心，用冰乙醚將產(chǎn)物洗至接近中性，脫去保護基，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-?；?rgdf。

4)ru-co-rgdf的合成

順式-雙(2,2'-聯(lián)吡啶)二氯化釕(48毫克，0.09毫摩爾)和混合物4'-甲基-2,2'-聯(lián)吡啶-4-酰基-rgdf(56毫克，0.08毫摩爾)在乙醇(10ml)和水的混合物中于黑暗中和在氮氣保護下回流進行8小時。將反應(yīng)混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)，后將殘余物溶解在5ml水中，向其中加入2毫升飽和nh4pf6，會形成磚紅色沉淀，離心后收集沉淀。通過過濾，用水洗滌，并真空干燥后得到一種紅橙色粉末。將粉末溶解在2毫升甲醇中，溶液進行過濾，將濾液在真空下蒸發(fā)，并將殘余物重結(jié)晶在甲醇和乙醚的混合溶劑中，并通過c18進行簡單分純，得到50毫克的復(fù)雜的ru-co-rgdf的六氟磷酸鹽,

將終產(chǎn)物溶于較少的乙腈中，加入丙酮溶解的四丁基氯化銨溶液，有磚紅色沉淀析出，離心后收集沉淀，干燥，得到氯代的終產(chǎn)物ru-co-rgdf。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述的基因遞送系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟

1)boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl的合成

精氨酸和天冬氨酸主鏈用boc保護氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用obzl保護羧基端，側(cè)鏈用適宜的保護基(叔丁氧羰基)保護的l-氨基酸，液相法接肽，得到兩個全保護的二肽:boc-arg(tos)-gly-obzl和boc-asp(obzl)-phe-obzl。分別用氫解方法脫去obzl保護和酸解方法脫去boc保護后，繼續(xù)用液相法接肽，得到全保護四肽。在冰浴的條件下，用溶有hcl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mgboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl，攪拌反應(yīng)，用tlc板監(jiān)測反應(yīng)。等反應(yīng)結(jié)束后，抽氣，將酸氣抽干。即得h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl。

2)合成4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl

將28mg4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-羧酸與117mgh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl用液相法接肽，制得124mg全保護的中間體4’甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl。

3)合成4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-?；?rgdf

用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液(v:v＝3:1)于冰水浴中反應(yīng)30分鐘，加入冰乙醚終止反應(yīng)后離心，用冰乙醚將產(chǎn)物洗至接近中性，脫去保護基，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-?；?rgdf。

4)ru-co-rgdf的合成

順式-雙(2,2'-聯(lián)吡啶)二氯化釕(48毫克，0.09毫摩爾)和混合物4'-甲基-2,2'-聯(lián)吡啶-4-?；?rgdf(56毫克，0.08毫摩爾)在乙醇(10ml)和水的混合物中于黑暗中和在氮氣保護下回流進行8小時。將反應(yīng)混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)，后將殘余物溶解在5ml水中，向其中加入2毫升飽和nh4pf6，會形成磚紅色沉淀，離心后收集沉淀。通過過濾，用水洗滌，并真空干燥后得到一種紅橙色粉末。將粉末溶解在2毫升甲醇中，溶液進行過濾，將濾液在真空下蒸發(fā)，并將殘余物重結(jié)晶在甲醇和乙醚的混合溶劑中，并通過c18進行簡單分純，得到50毫克的復(fù)雜的ru-co-rgdf的六氟磷酸鹽,

將終產(chǎn)物溶于較少的乙腈中，加入丙酮溶解的四丁基氯化銨溶液，有磚紅色沉淀析出，離心后收集沉淀，干燥，得到氯代的終產(chǎn)物ru-co-rgdf。

5)ru-co-rgdf/survivin-sirna的制備

首先稱取2mgru-co-rgdf，分散在1mldepc水中，超聲30min，配成2000μg/ml的分散液，再將1odsurvivin-sirna用250μldepc水溶解。將ru-co-rgdf與魚精蛋白按照濃度比1:8，與survivin-sirna/dna按照一定的比例混合，室溫靜置30min，即可得到ru-co-rgdf/survivin-sirna復(fù)合物。

本發(fā)明的另一個目的在于提供基因遞送系統(tǒng)在制備抑制腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的在于涉及以乳腺癌mcf-7細胞株為模型，用mtt法評價基因載體ru-co-rgdf對mcf-7的細胞毒性和ru-co-rgdf/survivin-sirna的體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示ru-co-rgdf對mcf-7細胞表現(xiàn)出低毒性，并且ru-co-rgdf/survivin-sirna具有良好的體外抗腫瘤活性，其ic50為120.6nm。

本發(fā)明的另一個目的在于涉及以乳腺癌mcf-7細胞株為模型，用annexinv-fitc/pi雙染法考察ru-co-rgdf/survivin-sirna誘導(dǎo)乳腺癌細胞mcf-7的凋亡率。annexinv-fitc/pi雙染法結(jié)果顯示ru-co-rgdf/survivin-sirna(濃度為100nm)作用的mcf-7細胞的凋亡率為46.2％。

本發(fā)明的另一個目的在于涉及以乳腺癌mcf-7細胞株為模型，通過elisa測定蛋白水平的基因沉默效率，通過rt-pcr測定mrna水平的基因沉默效率。在mrna水平，ru-co-rgdf/survivin-sirna能夠下調(diào)survivin相應(yīng)mrna的表達，濃度為100nm的抑制率為72.5±2.21％；在蛋白水平，ru-co-rgdf/survivin-sirna能夠下調(diào)survivin蛋白的表達，濃度為100nm的抑制率為71.00±2.76％。

本發(fā)明的另一個目的在于涉及以荷s180腹水瘤小鼠模型進行體內(nèi)抗腫瘤活性評價，ru-co-rgdf/survivin-sirna復(fù)合物中survivin-sirna的給藥劑量為0.3mg/kg，其抑瘤率為55.50％。

對說明書中出現(xiàn)的以下詞語作進一步的解釋：

ru：(4’-甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸)雙(2,2’-聯(lián)吡啶)二氯化釕的縮寫

co：(4’-甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酰胺-rgdf)雙(2,2’-聯(lián)吡啶)二氯化釕上的酰胺鍵的羰基

rgdf：精氨酸(arg)-甘氨酸(gly)-天冬氨酸(asp)-苯丙氨酸(phe)，其作為載體的靶頭。

ru-co-rgdf:(4’-甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-酰胺-rgdf)雙(2,2’-聯(lián)吡啶)二氯化釕

ru-cooh:(4’-甲基-2,2’-聯(lián)吡啶-4-甲酸)雙(2,2’-聯(lián)吡啶)二氯化釕

tos:對甲苯磺酰基

boc:叔丁氧羰基

obzl:芐酯

tbe:電泳緩沖液

pbs:磷酸鹽緩沖液

mtt:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽

dmso:二甲基亞砜

lipo:lipo2000(市售轉(zhuǎn)染試劑)

dox:阿霉素

附圖說明

附圖1為ru-co-rgdf的制備路線。

附圖2為ru-cooh的質(zhì)譜圖。

附圖3為ru-cooh的氫譜圖。

附圖4為boc-r(tos)-g-d(obzl)-f-obzl的質(zhì)譜圖。

附圖5為boc-r(tos)-g-d(obzl)-f-obzl的氫譜圖。

附圖6為ru-co-rgdf的質(zhì)譜圖。

附圖7為ru-co-rgdf的紫外圖。

附圖8為ru-cooh和ru-co-rgdf的紅外譜圖。

附圖9為ru-co-rgdf的熒光圖。

附圖10為ru-co-rgdf/survivin-sirna的電泳圖。

a：1:裸sirna；2-7:不同濃度的ru-co-rgdf/survivin-sirna

b：裸sirna；2-7:不同比例的魚精蛋白修飾ru-co-rgdf后負載survivin-sirna

附圖11為ru-co-rgdf和ru-co-rgdf/survivin-sirna的掃描電鏡和投射電鏡圖。

a：ru-co-rgdf掃描電鏡圖

b：ru-co-rgdf透射電鏡圖

c：ru-co-rgdf/survivin-sirna掃描電鏡圖

d：ru-co-rgdf/survivin-sirna透射電鏡圖

附圖12為ru-co-rgdf、ru-co-rgdf/魚精蛋白復(fù)合物和ru-co-rgdf/

survivin-sirna的zeta電位和水合粒徑圖。

d:ru-co-rgdf的zeta電勢圖

e:ru-co-rgdf的水合粒徑圖

f:ru-co-rgdf/魚精蛋白的zeta電勢圖

g:ru-co-rgdf/魚精蛋白的水合粒徑圖

h:ru-co-rgdf/surviving-sirna的zeta電勢圖

i:ru-co-rgdf/surviving-sirna的水合粒徑圖

附圖13為ru-co-rgdf在mcf-7細胞的轉(zhuǎn)染效果圖。

a：空白對照組

b：載體ru-co-rgdf組

c：實驗組：ru-co-rgdf/surviving-sirna組

附圖14為ru-co-rgdf對mcf-7細胞的細胞毒性。

附圖15為ru-co-rgdf/survivin-sirna的體外抗腫瘤活性。

ru:ru-co-rgdf；nc:nc-sirna；sirna:surviving-sirna；lipo:lipo2000

附圖16為ru-co-rgdf/survivin-sirna的量效關(guān)系。

附圖17為ru-co-rgdf/survivin-sirna對細胞凋亡作用。

a：載體ru-co-rgdf組

b：裸survivin-sirna組

c：實驗組：ru-co-rgdf/surviving-sirna組

附圖18為各組survivin蛋白的含量。

ru:ru-co-rgdf；nc:nc-sirna；sirna:surviving-sirna；lipo:lipo2000

附圖19為各組survivin-mrna的含量。

ru:ru-co-rgdf；nc:nc-sirna；sirna:surviving-sirna；

附圖20為ns、ru-co-rgdf/survivin-sirna、survivin-sirna和dox組的臟體比。

附圖21為ns、ru-co-rgdf/survivin-sirna、survivin-sirna和dox組的瘤重。

附圖22為ns、ru-co-rgdf/survivin-sirna、survivin-sirna和dox組的抑瘤率。

具體實施方式

通過以下具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不作為限制。

實施例1.ru-co-rgdf的制備

ru-co-rgdf制備路線如圖1

boc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl的合成

精氨酸和天冬氨酸主鏈用boc保護氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用obzl保護羧基端，側(cè)鏈用適宜的保護基(叔丁氧羰基)保護的l-氨基酸，液相法接肽，得到兩個全保護的二肽:boc-arg(tos)-gly-obzl和boc-asp(obzl)-phe-obzl。分別用氫解方法脫去obzl保護和酸解方法脫去boc保護后，繼續(xù)用液相法接肽，得到全保護四肽。在冰浴的條件下，用溶有hcl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mgboc-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl，攪拌反應(yīng)，用tlc板監(jiān)測反應(yīng)。等反應(yīng)結(jié)束后，抽氣，將酸氣抽干。即得h-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl。。esi-ms(m/e)：950.63[m+1]⁺如圖4、5質(zhì)譜、氫譜鑒定。

合成4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl

將28mg4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-羧酸與117mgh-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl用液相法接肽，制得124mg全保護的中間體4’甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-酰基-arg(tos)-gly-asp(obzl)-phe-obzl。esi-ms(m/e)：1023.39[m+1]⁺。

合成4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-?；?rgdf

用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液(v:v＝3:1)于冰水浴中反應(yīng)30分鐘，加入冰乙醚終止反應(yīng)后離心，用冰乙醚將產(chǎn)物洗至接近中性，脫去保護基，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物4’-甲基-(2,2’-聯(lián)吡啶)-4-酰基-rgdf。esi-ms(m/e)：673.72[m+1]⁺。

ru-co-rgdf的合成

順式-雙(2,2'-聯(lián)吡啶)二氯化釕(48毫克，0.09毫摩爾)和混合物4'-甲基-2,2'-聯(lián)吡啶-4-?；?rgdf(56毫克，0.08毫摩爾)在乙醇(10ml)和水的混合物中于黑暗中和在氮氣保護下回流進行8小時。將反應(yīng)混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)，后將殘余物溶解在5ml水中，向其中加入2毫升飽和nh4pf6，會形成磚紅色沉淀，離心后收集沉淀。通過過濾，用水洗滌，并真空干燥后得到一種紅橙色粉末。將粉末溶解在2毫升甲醇中，溶液進行過濾，將濾液在真空下蒸發(fā)，并將殘余物重結(jié)晶在甲醇和乙醚的混合溶劑中，并通過c18進行簡單分純，得到50毫克的復(fù)雜的ru-co-rgdf的六氟磷酸鹽(54.46％)。

將終產(chǎn)物溶于較少的乙腈中，加入丙酮溶解的四丁基氯化銨溶液，有磚紅色沉淀析出，離心后收集沉淀，干燥，得到氯代的終產(chǎn)物。

其比旋光度為[α]²⁶d＝6.562±0.452(c＝0.1g/100ml,h2o)，熔點為133.7±2.36℃，熔程為0.93±0.42℃。鑒定結(jié)果如圖6質(zhì)譜esi-ms(m/e)：551.13[1/2m]²⁺、圖7紫外：最大吸收波長為287.0nm、圖8紅外：ru-cooh的-c＝o基團的伸縮振動變?yōu)閞u-co-rgdf的酰胺鍵-n-h的面內(nèi)彎曲振動、圖9熒光：激發(fā)波長為450nm，發(fā)射波長為：611.5nm。

ru-co-rgdf/survivin-sirna的制備

首先稱取2mgru-co-rgdf，分散在1mldepc水中，超聲30min，配成2000μg/ml的分散液，再將1odsurvivin-sirna用250μldepc水溶解。將ru-co-rgdf與魚精蛋白按照濃度比1:8，與survivin-sirna/dna按照一定的比例混合，室溫靜置30min，即可得到ru-co-rgdf/survivin-sirna復(fù)合物。

實例2測定ru-co-rgdf/survivin-sirna中survivin-sirna的負載量

配制樣品

用rna稀釋緩沖液配制不同濃度的ru-co-rgdf分別為2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125mg/ml，與不同比值魚精蛋白的混合溶液，混勻，室溫靜置10min，分別與2μl的survivin-sirna混合，反復(fù)捶打，靜置10min。再加入適當(dāng)體積的5×loadingbuffer，渦旋混勻后，在已制備好的瓊脂糖凝膠上樣孔中用蛋白上樣槍頭加入上述溶液20μl。

實驗步驟

稱取0.5g瓊脂糖于100ml燒杯中，加入5mltbe(10×)和45ml去離子水，置于微波爐內(nèi)中高火加熱2min將瓊脂糖溶化。稍冷卻后加入8μl溴化乙錠溶液(10mg/ml)，攪勻，倒入模具中(事先洗凈并用無水乙醇潤洗晾干)，插入梳子，凝固后備用。取30mltbe(10×)和270ml超純水，混合均勻后倒入電泳槽中作為電泳液。取出凝固后的瓊脂糖凝膠，置于電泳槽中，每孔加樣20μl。打開電源，將電壓設(shè)置成95v，時間設(shè)置為30min。從電泳槽中取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀觀察并拍照。

實驗結(jié)果

如圖10所示，不同濃度比的ru-co-rgdf/survivin-sirna的熒光條帶均比游離sirna組(對照)弱，說明survivin-sirna被不同程度地阻滯在上樣孔里，表明survivin-sirna成功被部分或完全穩(wěn)定負載在ru-co-rgdf表面。當(dāng)ru-co-rgdf的濃度為0.0625mg/ml時，ru-co-rgdf與魚精蛋白的體積比為1:8時，熒光條帶完全消失，說明此時vegf-sirna被完全阻滯在上樣孔里，即survivin-sirna被完全負載在ru-co-rgdf表面。

實施例2測定ru-co-rgdf和ru-co-rgdf/survivin-sirna的納米結(jié)構(gòu)

實驗方法

取10μl濃度為625μg/ml的ru-co-rgdf水分散液，按照體積比1:8配制ru-co-rgdf/魚精蛋白水分散液，再混合2μlsirna和適當(dāng)?shù)男∨Ｐ叵賒na，各取20μl負載survivin-sirna和未負載的純載體滴加到碳支持膜(銅網(wǎng))上，置于37℃烘箱中干燥。將各樣品置于透射電鏡(tem，jem-1230，jeol，日本)下觀察并獲取照片。再各取20μl滴加到玻璃片上，置于室溫自然風(fēng)干。將各樣品置于掃描電鏡鏡(jsm-6360lv，jeol，japan)下觀察并獲取照片。

實驗結(jié)果

從圖11中的掃描電鏡和透射電鏡圖像我們可以看出ru-co-rgdf是圓球形納米結(jié)構(gòu)，粒徑大小在100nm左右。而負載了survivin-sirna的ru-co-rgdf/survivin-sirna的粒徑增加，部分達到200nm。

實施例3測定ru-co-rgdf、ru-co-rgdf/魚精蛋白和ru-co-rgdf/survivin-sirna的zeta電位和水合粒徑

實驗方法

配制1mg/mlru-co-rgdf的水分散液備用。配制相應(yīng)濃度的ru-co-rgdf和魚精蛋白的水分散液以及ru-co-rgdf/survivin-sirna水分散液。用激光粒度分析儀測定樣品的粒徑分布與zeta電位。

實驗結(jié)果

如圖12所示ru-co-rgdf、ru-co-rgdf和魚精蛋白以及ru-co-rgdf/survivin-sirna的zeta電位值分別是3.42±0.41mv、32.38±2.85mv、0.00±0.00mv。ru-co-rgdf、ru-co-rgdf和魚精蛋白以及ru-co-rgdf/survivin-sirna的水合粒徑分別為163.0±4.1nm、192.4±1.9nm、244.7±6.2nm。zeta電位值由小變大，也進一步說明ru-co-rgdf被魚精蛋白成功修飾。在負載survivin-sirna之后，復(fù)合物ru-co-rgdf/survivin-sirna電位變零，說明負載survivin-sirna成功。

實施例2.ru-co-rgdf/survivin-sirna的體外抗腫瘤活性評價

激光共聚焦顯微鏡考察sirna的轉(zhuǎn)染效果

人類乳腺癌細胞mcf-7是貼壁生長的細胞，以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中,加入含10％胎牛血清,100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的1640完全培養(yǎng)液,置于37℃恒溫、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期mcf-7細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶,消化4min后,離心(1500rpm、3min)，用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×10⁵個/ml，每個激光共聚焦培養(yǎng)小皿中加入2ml，共三組，37℃恒溫、5％co2培養(yǎng)過夜。小心棄掉上清液，pbs洗一次，加入2ml含有100nmru-co-rgdf/fam-survivin-sirna和survivin-sirna的無血清1640培養(yǎng)基，另一個空白組培養(yǎng)皿加入2ml無血清1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4h。吸除上清液，1mlpbs洗3次，每個培養(yǎng)皿加1mlhochest染液(pbs稀釋，工作濃度為4μg/ml),染色15min。之后吸除上清液，用1mlpbs洗3次，最后加入1mlpbs。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

實驗結(jié)果

本實驗中，ru-co-rgdf表面吸附的sirna是fam標(biāo)記的survivin-sirna，從圖13中我們可以看出ru-co-rgdf/survivin-sirna組的細胞核(被hochest33342染成藍色)周圍有綠色熒光(fam)，而blank組和裸的survivin-sirna組細胞核周圍沒有綠色的熒光，可以得出結(jié)論：survivin-sirna被ru-co-rgdf成功遞送進mcf-7細胞內(nèi)，并且分布在細胞核周圍。

ru-co-rgdf的細胞毒作用

將mcf-7細胞以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中,加入含10％胎牛血清,100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的1640完全培養(yǎng)液,置于37℃恒溫、5％co2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期mcf-7細胞，先用pbs洗滌三遍，加1ml胰酶,消化4min后,離心(1500rpm、3min)，用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5×10⁴個/ml。取96孔培養(yǎng)板，pbs液封，設(shè)空白培養(yǎng)基組，其余每孔加入100μl細胞懸液，在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。小心棄去培養(yǎng)液，加入含ru-co-rgdf的1640培養(yǎng)基100μl，濃度依次為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、200μg/ml。每個濃度設(shè)置五個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。每孔加入20μl新鮮配制的濃度為10mg/ml的mtt，37℃，5％co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心后小心棄去上清液，并加入150μldmso，用微型振蕩器震蕩500r，10min?；靹蚝?，在酶標(biāo)儀上以檢測波長為490nm測定吸光度(od)值，計算細胞存活率。細胞存活率(％)＝[(實驗組od值-空白組od值)/(對照組od值-空白組od值)]×100％。上述實驗重復(fù)三次。

實驗結(jié)果

從圖14中我們可以看出隨著濃度的增加，與空白組相比較，細胞存活率沒有明顯性差異(p>0.05)。因此載體ru-co-rgdf對mcf-7細胞是沒有毒性的。

ru-co-rgdf/survivin-sirna的體外抗腫瘤活性

取對數(shù)生長期的mcf-7細胞，胰酶消化后,用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至4×10⁴個/ml。每孔種100μl細胞懸液于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃，5％co2培養(yǎng)過夜。小心棄去培養(yǎng)液，加入100μl含40nm，60nm，80nm和120nm的ru-co-rgdf，survivin-sirna，ru-co-rgdf/nc，ru-co-rgdf/survivin-sirna，lipo-2000/nc,lipo-2000/survivin-sirna的無血清1640培養(yǎng)基。每組每個濃度設(shè)置五個復(fù)孔。為了考察ru-co-rgdf/survivin-sirna的量效關(guān)系，加入100μl含20nm，40nm，60nm，80nm，100nm，120nm，200nmru-co-rgdf/survivin-sirna的無血清1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4h，棄掉上清液，每孔加入100μl含10％fbs的1640培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)44h。每孔加入20μl新配制的濃度為10mg/ml的mtt，37℃、5％co2繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心后小心棄去上清液，并加入150μldmso，用微型振蕩器震蕩500r，10min。混勻后，在酶標(biāo)儀上以檢測波長為490nm測定吸光度(od)值，計算細胞存活率。細胞存活率(％)＝[(實驗組od值-空白組od值)/(對照組od值-空白組od值)]×100％。上述實驗重復(fù)三次。

實驗結(jié)果

從圖15中可以得出以下結(jié)論：

(1)不同濃度的ru-co-rgdf、ru-co-rgdf/nc和陰性對照組survivin-sirna分別與blank(即濃度為0的細胞)比較，無顯著性差異(p>0.05)，說明裸的survivin-sirna和單獨的載體ru-co-rgdf對細胞增殖均無抑制作用。

(2)不同濃度的ru-co-rgdf/survivin-sirna與blank(即濃度為0的細胞)比較，有顯著性差異(p<0.01)；相同濃度的ru-co-rgdf/survivin-sirna與ru-co-rgdf/nc、陰性對照組survivin-sirna相比較，有顯著性差異(p<0.01)，即ru-co-rgdf/survivin-sirna表現(xiàn)出較好的體外抗腫瘤活性。

(3)ru-co-rgdf/survivin-sirna對mcf-7細胞的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，即隨著濃度的增加，其抑制作用表現(xiàn)出增強趨勢。

從圖16中我們可以看出隨著ru-co-rgdf/survivin-sirna的濃度增加，細胞存活率逐漸下降，即其抗腫瘤活性逐漸增強，呈現(xiàn)濃度依賴性。其ic50為120.6nm。

實施例3.ru-co-rgdf/survivin-sirna作用機制研究

annexinv-fitc/pi雙染法考察ru-co-rgdf/survivin-sirna誘導(dǎo)乳腺癌細胞mcf-7的凋亡率

細胞培養(yǎng)

取對數(shù)生長期的mcf-7細胞，先用pbs洗三遍，加1ml胰酶，消化4min后，2000rpm離心3min。用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至2×10⁵個/ml，每孔加2ml于六孔板中，設(shè)三個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜，棄掉培養(yǎng)基，加入2ml含有100nmru-co-rgdf，ru-co-rgdf/survivin-sirna和survivin-sirna的不含血清的1640培養(yǎng)基,空白組加入2ml的不含血清的1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加2ml含有10％fbs的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)44h。

染色

用不含edta的胰酶消化洗脫并與培養(yǎng)基上清的懸浮細胞合并，2000rpm離心3min，然后用預(yù)冷的pbs洗滌2次，將離心的細胞團塊完全懸浮在100μl的bindingbuffer(1×)中，加入5μlannexinv-fitc和1μlpi，避光，室溫孵育15min，然后再補加200μl的bindingbuffer(1×)。上機檢查。

實驗結(jié)果

如圖17所示ru-co-rgdf/survivin-sirna對mcf-7細胞的凋亡率與空白組、ru-co-rgdf組和survivin-sirna組相比較，有明顯區(qū)別，ru-co-rgdf/survivin-sirna組的細胞凋亡率可達到46.2％(早調(diào)：1.3％；晚調(diào)：45.9％)。我們可以得出結(jié)論：ru-co-rgdf/survivin-sirna能夠成功將survivin-sirna遞送到mcf-7細胞內(nèi)，并且促進mcf-7細胞凋亡的作用。這也驗證了survivin蛋白抑制凋亡的機制。

實施例4ru-co-rgdf/survivin-sirna的蛋白水平沉默效率評價

細胞培養(yǎng)

取對數(shù)生長期mcf-7細胞，胰酶消化后，用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×10⁵個/ml，每孔加2ml于六孔板中，設(shè)三個復(fù)孔，培養(yǎng)過夜當(dāng)細胞密度長至80％左右時，棄掉上清，加入2ml含有20nm、40nm、80nm、100nmsurvivin-sirna，ru-co-rgdf/nc，ru-co-rgdf/survivin-sirna，lipo2000/nc，lipo2000/survivin-sirna的無血清1640培養(yǎng)基，空白組加入2ml無血清1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4h后換成新鮮的含10％fbs的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)44h。

提取蛋白

冰上操作：棄掉上清液，然后每孔用pbs洗3次，加1mlpbs,用細胞刮刀將細胞刮下來，吸到1.5ml離心管中離心(4000rpm，5min)。棄掉上清液，每個離心管加100μl蛋白裂解液(體積比ripa:cocktail:200mmpmsf＝100:1:1)，冰浴中裂解30min，離心(10000rpm，10min)取上清即可。

bcaproteinassaykit定量裂解液中蛋白濃度

將上一步提取的蛋白裂解液稀釋十倍，每組設(shè)置三個復(fù)孔,根據(jù)bca工作液試劑盒操作步驟,測定每組蛋白濃度，做下記錄,求每組樣品總蛋白濃度平均值。

humansurvivinelisa試劑盒測定樣品蛋白中survivin的含量

蛋白上樣量為30μg，根據(jù)蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的蛋白裂解液并用depc水定容到50μl,根據(jù)試劑盒步驟操作最后在450nm下測定od值。上述實驗重復(fù)三次。

實驗結(jié)果

蛋白定量結(jié)果

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的od值

標(biāo)準(zhǔn)方程為y＝-9e-08x²+0.001x+0.129(r²＝0.999)

各組蛋白樣品中總蛋白量

elisa

各組蛋白樣品中survivin蛋白的相對含量

從圖18中我們可以看出，裸的survivin-sirna組與空白組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，即裸的survivin-sirna不能下調(diào)mcf-7細胞survivin蛋白的表達；ru-co-rgdf/nc和lipo2000/nc與空白組相比較，沒有明顯性差異(p>0.05)，表明載體材料對survivin蛋白的表達沒有影響；而ru-co-rgdf/survivin-sirna分別與ru-co-rgdf/nc、blank組相比均有明顯性差異(p<0.01)，與lipo2000/survivin-sirna陽性對照組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，說明ru-co-rgdf將survivin-sirna遞送進入細胞并成功下調(diào)survivin蛋白的表達。

實施例5.ru-co-rgdf/survivin-sirna的mrna水平沉默效率評價

細胞培養(yǎng)

取對數(shù)生長期mcf-7細胞，細胞密度達到80％左右時，用pbs洗滌三遍，加入1ml胰酶消化4min,離心(1500rpm，3min)，用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至2×10⁵個/ml，每孔加2ml于六孔板中，培養(yǎng)過夜，設(shè)三個復(fù)孔，棄掉上清，加入2ml含有100nmsurvivin-sirna，ru-co-rgdf/nc，ru-co-rgdf/survivin-sirna，lipo/nc，lipo/survivin-sirna的無血清1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4h，換成新鮮含血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)44h。

rna的提取

(1)首先棄掉六孔板的上清液，然后用1mlpbs洗滌三次，每孔加入1mltrizol裂解液(每10cm²加入1mltrizol)。吹打均勻并室溫裂解10min，將裂解液轉(zhuǎn)移至無rnaseep管，靜置5min。

(2)相分離。在每1mltrizol加入0.2ml氯仿，然后劇烈振蕩，室溫放置3分鐘，離心(4℃，12000rpm，15minutes)。液體分成三層，下層的紅色為苯酚-氯仿相，上層是無色的水相。rna存在于水相中，水相約占總體積的50％。

(3)沉淀rna。小心地將上層水相液體轉(zhuǎn)移到另一干凈的無rnaseep管中，然后每管加入0.5ml異丙醇，混勻,室溫靜置10min，然后離心(4℃，12000rpm，10min)。離心后在管的底部可看到絮狀半透明膠樣的rna沉淀。

(4)洗滌rna。小心去除上清，加入1ml配制好的75％乙醇(depc水配制)，洗滌rna沉淀，振蕩器混勻，離心(4℃，12000rpm，10min)，小心棄去上清。

(5)rna的復(fù)溶。將rna沉淀放置10min，待rna沉淀干燥。但是注意不能將rna沉淀完全干燥，因為這會極大地降低它的溶解度。用depc水重懸rna沉淀，并且用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10分鐘，55℃水浴10-15min。-20℃保存；

(6)測rna濃度：用depc水校正nanodrop-1000后，取5μl混勻后的rna溶液樣品，滴加到測量臂上，選擇rna，點擊measure測量。同法依次測量所有rna溶液樣品。

逆轉(zhuǎn)錄

(1)樣品準(zhǔn)備：逆轉(zhuǎn)錄rna上樣量為2μg,根據(jù)上一步測得的rna濃度，計算出我們所需rna體積。

(2)取microamptmoptical96-wellreactionplate，每個反應(yīng)孔加10μl2×rtbuffer,1μl20×rtenzymemix，加入相應(yīng)體積的rna溶液，用depc水補足20μl。用opticaladhesivefilm將板子封口。離心(4℃，1000rmp，3min)，排出聚集在反應(yīng)孔底部的氣泡。

(3)放入pcrsystem9700中,設(shè)置反應(yīng)條件：94℃-5min,9℃-30s,75℃-30s,72℃-25s,72℃-7min,4℃∞，共30個循環(huán)。

(4)測濃度：反應(yīng)結(jié)束后，首先用depc水校正nanodrop-1000，取5μl混勻后的cdna溶液樣品，滴加到測量臂上，蓋上測量臂，選擇dna-50，點擊measure測量。同法依次測量所有cdna溶液樣品，并記錄下測量的結(jié)果。按照上樣量進行稀釋，稀釋后用同樣的方法進行測定。

rt-pcr

cdna的上樣量為20ng，據(jù)此計算所需加入的各cdna樣品的體積。每個反應(yīng)孔加入10μlgeneexpressionmastermix、1μl探針標(biāo)記的引物(survivin或gapdh)、相應(yīng)體積的cdna樣品，以depc水補齊20μl，搖勻。離心(4℃，1000rmp，1min)，使液體聚集于底部并排出氣泡；放入appliedbiosystems7500real-timepcrsystem中,設(shè)置條件。hold:50℃2min,95℃10min，cycle(40cycles)，95℃15s,60℃1min。

數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)ct值以gapdh為內(nèi)參，運用2^-△△ct法相對定量各實驗組mrna的量。上述實驗重復(fù)三次。

實驗結(jié)果

提取的各組rna濃度

提取的各組rna濃度

逆轉(zhuǎn)錄后各組的cdna的濃度

逆轉(zhuǎn)錄后各組的cdna的濃度

rt-pcr

rt-pcr后各組2^-△△ct值如下表所示：

survivin-mrna水平基因沉默效果

從圖19可以看出：

(1)裸的survivin-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的survivin組對survivin-mrna的轉(zhuǎn)錄沒有影響；

(2)ru-co-rgdf/nc組和lipo2000/nc組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明載體材料對survivin-mrna的轉(zhuǎn)錄沒有影響；

(3)ru-co-rgdf/survivin-sirna組分別與空白組和ru-co-rgdf/nc相比較，均有明顯性差異(p<0.01)，而與lipo2000/survivin-sirna組相比，沒有明顯性差異(p>0.05)，可以得出ru-co-rgdf/survivin-sirna能夠下調(diào)survivin-mrna的轉(zhuǎn)錄水平，并且效率和陽性對照組相當(dāng)。

實施例6.ru-co-rgdf/survivin-sirna的體內(nèi)抗腫瘤活性研究

實驗分組

實驗共分為4組，分別是生理鹽水組(ns)，ru-co-rgdf/survivin-sirna組，裸survivin-sirna組，鹽酸阿霉素組(dox)。每組12只小鼠，四組共48只。

給藥劑量

(1)ru-co-rgdf/survivin-sirna組：survivin-sirna劑量為0.3mg/kg，ru-co-rgdf的劑量為0.498mg/kg，魚精蛋白劑量為3.984mg/kg配制藥品并給藥。

(2)survivin-sirna組：劑量為0.3mg/kg

(3)ru-co-rgdf組：ru-co-rgdf的劑量為0.498mg/kg。

(4)dox組：劑量為2μmol/kg

(5)ns：等體積的生理鹽水，即每只0.2ml

給藥方式：尾靜脈注射

實驗動物：icr小鼠，雄性，體重25±2g(x±sd)，由北京維通利華動物實驗技術(shù)有限公司提供。

實驗方案

建立荷s180腹水瘤小鼠模型：取1×10⁷個/ml的s180細胞懸液于健康小鼠腋皮下接種，0.2ml/只，小鼠接種瘤液后養(yǎng)7天至瘤體積(長×寬²/2)為150mm³左右，將全部小鼠隨機分組，分為4組，并編號。測量體重，然后開始給藥，ru-co-rgdf/survivin-sirna和survivin-sirna、ru-co-rgdf組按給藥劑量每天尾靜脈注射給藥一次，每次0.2ml/只，連續(xù)給藥5天；陰性對照以等體積的生理鹽水尾靜脈注射給藥，每天給藥一次，0.2ml/只，連續(xù)給5天；陽性對照dox組以尾靜脈注射給藥，按給藥劑量每天給藥一次，0.2ml/只，連續(xù)給藥5天，每天按編號測量小鼠體重。

實體瘤抑瘤率及臟器指數(shù)的測定

每組連續(xù)給藥5天后，于第6天脫頸椎處死小鼠，處死前稱取體重，然后將小鼠解剖，取出瘤、腦、心、肝、脾、腎，并稱重，按如下公式計算抑瘤率及臟器指數(shù)。

抑瘤率％＝[(生理鹽水組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重]×100％，臟器指數(shù)(％)＝臟器重/處死前體重。數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用t檢驗和方差分析，以(mean±sdg)表示。

從圖20中我們可以看出，ru-co-rgdf/survivin-sirna和裸的survivin-sirna組對動物的心、肝、脾、肺、腎、腦都沒有毒性。從圖21中可以看出，裸的survivin-sirna組與空白組相比，沒有顯著性差異(p>0.05)，說明裸的survivin-sirna對腫瘤的生長無抑制作用；ru-co-rgdf/survivin-sirna與空白組相比較，有顯著性差異(p<0.05)，與dox組相比,沒有顯著性差異(p>0.05)，說明ru-co-rgdf/survivin-sirna明顯抑制腫瘤的生長，抑瘤率接近于陽性藥dox；從圖22中可以看出ru-co-rgdf/survivin-sirna的抑瘤率達到55.5％。