本發(fā)明屬于醫(yī)藥納米材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硒是人體必需的微量元素，亞硒酸鈉制劑在臨床上可用于高血壓、癌癥、心肌炎、冠心病、克山病和大骨節(jié)病等疾病的預(yù)防和治療中。然而，硒及其化合物有劇毒，硒的每日最大安全量為400μg，若過量服用硒可引起中毒。有報(bào)道顯示有機(jī)納米硒的毒性比無機(jī)硒小，生物活性比無機(jī)硒高，從而克服了無機(jī)含硒物質(zhì)有效劑量與中毒劑量相差不大的弱點(diǎn)。故隨著有機(jī)納米硒的研制成功，以及納米硒在生物安全性上面的深入研究，作為一種有效的補(bǔ)硒劑將得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。

可生物降解的聚合物納米粒子，特別是基于多糖的納米微球和納米微囊作為新型藥物輸送和控釋載體，因其具有良好的生物相容性、超細(xì)粒徑、合理的體內(nèi)分布和高效的藥物利用率，近年來日益受到廣泛關(guān)注?？缮锝到饩酆衔锛{米微粒不僅可增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性、提高療效、降低毒副作用，而且可有效地越過許多生物屏障和組織間隙到達(dá)病灶部位，從而更有效地對(duì)藥物進(jìn)行靶向輸送和控制釋。

硫酸軟骨素在美國(guó)已經(jīng)風(fēng)行多年，除了作為藥品外，大多是作為改善關(guān)節(jié)病的補(bǔ)充品和健康食品應(yīng)用。硫酸軟骨素對(duì)改善老年退行性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的效果?，F(xiàn)有技術(shù)中有報(bào)道人工合成化工品硫酸軟骨素，人工合成硫酸軟骨素雖然成本降低，但是由于存在過硫酸化問題，導(dǎo)致生成的硫酸軟骨素產(chǎn)物在體內(nèi)由于缺乏相應(yīng)的代謝酶而無法代謝，有可能產(chǎn)生對(duì)身體不利的影響例如機(jī)體的免疫反應(yīng)、過敏反應(yīng)，胃腸道不適等癥狀，相較于生物活性硫酸軟骨素生物相容性較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子及其制備方法和應(yīng)用，該硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子毒性小，生物活性高。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明公開了一種硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子，以硫酸軟骨素a作為載體，將納米硒通過物理吸附結(jié)合在硫酸軟骨素a上形成納米膠束粒子，其中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％～25％。

所述的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子在水中自組裝形成平均粒徑為85nm、表面電荷為-47mv的納米膠束。

本發(fā)明還公開了一種硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子的制備方法，包括以下步驟：

1)以質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取1份硫酸軟骨素a、將0.1～1份硒化物及2～5份l-抗壞血酸；

2)將硫酸軟骨素a加水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，制得硫酸軟骨素a水溶液，將硒化物加水充分?jǐn)嚢柚寥芙猓频梦锼芤?；?0hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

3)將l-抗壞血酸加水充分?jǐn)嚢柚寥芙猓频胠-抗壞血酸水溶液，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟2)制得的混合溶液中，60hz，30℃超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析處理，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

4)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。

所述硫酸軟骨素a加入其3倍體積的水充分?jǐn)嚢柚寥芙庵频昧蛩彳浌撬豠水溶液；硒化物水溶液的體積為硫酸軟骨素a水溶液體積的1/3；l-抗壞血酸水溶液的體積為硫酸軟骨素a水溶液體積的2/3。

步驟3)所述透析處理是將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出。

所述透析采用截留分子量為3500的透析袋。

所述硒化物為亞硒酸鹽。

所述亞硒酸鹽為亞硒酸鈉或亞硒酸氫鈉。

本發(fā)明還公開了上述的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子在制備預(yù)防/治療骨關(guān)節(jié)病的藥物中的應(yīng)用。

所述的藥物為拮抗t-2毒素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的藥物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明所提供的硫酸軟骨素納米硒是以硫酸軟骨素a為載體，硒通過物理吸附結(jié)合硫酸軟骨素a形成的可生物降解的聚合物納米膠束，該納米膠束在水中溶解性好，可以自組裝形成平均粒徑為85nm、表面帶-47mv左右的穩(wěn)定納米膠束粒子。經(jīng)驗(yàn)證，該膠束粒子能夠展現(xiàn)出丁達(dá)爾效應(yīng)，說明形成了較好的膠體。

本發(fā)明公開的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子細(xì)胞毒性低，生物活性高，可以改善大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)(線粒體、溶酶體)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，并且能夠保護(hù)軟骨細(xì)胞達(dá)到拮抗t-2毒素誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的作用。因而可以用于制備預(yù)防/治療骨關(guān)節(jié)病的藥物，與作為常規(guī)的用于治療大骨節(jié)病的藥物亞硒酸鈉相比，本發(fā)明提供的硫酸軟骨素a納米硒膠束，結(jié)合了硫酸軟骨素a和納米硒雙重藥理活性，降低了無機(jī)硒的毒性，提高其生物利用度的同時(shí)結(jié)合硫酸軟骨素a的生物活性，可以更好的將其發(fā)展成為預(yù)防和改善骨關(guān)節(jié)病的新型納米膠束制劑，膠束制劑相較于納米粒子，一般粒徑在100nm，分散性好，并且凍干粉的充分散性良好，可溶于水中，更適用于注射類藥物制劑，亦作為其他補(bǔ)硒制劑的合成原料之一。

本發(fā)明利用硫酸軟骨素a、亞硒酸鹽原料，在超聲和透析下通過l-抗壞血酸還原制得硫酸軟骨素a納米硒膠束，其工藝簡(jiǎn)潔、操作簡(jiǎn)單，是一種綠色環(huán)保的合成方法。制備時(shí)硫酸軟骨素a和亞硒酸鹽的投料比可以在一個(gè)范圍變動(dòng)，而在加工成藥品或保健品時(shí)需要結(jié)合硒的生理需求量、界限中毒劑量、日建議膳食補(bǔ)充量和最高安全攝入量等數(shù)據(jù)來綜合考慮每日最適補(bǔ)充劑量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1～6制得的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子(secsa1-6)與硫酸軟骨素(cs)的紅外光譜對(duì)比譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1～6制得的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子(secsa1-6)與硫酸軟骨素(cs)的xrd衍射對(duì)比譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1～6制得的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子(secsa1-6)與硫酸軟骨素(cs)的丁達(dá)爾效應(yīng)圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1～6制得的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子(secsa1-6)與硫酸軟骨素(cs)的粒徑分布圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1～6制得的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子(secsa1-6)與硫酸軟骨素(cs)的表面電位圖；

圖6為硫酸軟骨素a納米硒膠束(secsa4)與前期合成的css的溶解性比較圖

圖7為不同干預(yù)下軟骨細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

實(shí)施例1

1)稱取0.495g硫酸軟骨素a溶解于3ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制得硫酸軟骨素a水溶液；將0.011g亞硒酸鈉(na2seo3)溶解于1ml水中，制得亞硒酸鈉水溶液；在60hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

2)將0.033gl-抗壞血酸加2ml水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，制得l-抗壞血酸水溶液，然后在攪拌下，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟1)制得的混合溶液中，60hz，30℃，超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

3)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。由原子熒光分光光度計(jì)測(cè)得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子中硒元素的含量為0.68％。

實(shí)施例2

1)稱取0.490g硫酸軟骨素a溶解于3ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍频昧蛩彳浌撬豠水溶液；將0.022g亞硒酸鈉(na2seo3)溶解于1ml水中，制得亞硒酸鈉水溶液；在60hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

2)將0.066gl-抗壞血酸加2ml水充分?jǐn)嚢柚寥芙猓频胠-抗壞血酸水溶液，然后在攪拌下，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟1)制得的混合溶液中，60hz，30℃，超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

3)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。由原子熒光分光光度計(jì)測(cè)得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子中硒元素的含量為1.82％。

實(shí)施例3

1)稱取0.475g硫酸軟骨素a溶解于3ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制得硫酸軟骨素a水溶液；將0.055g亞硒酸鈉(na2seo3)溶解于1ml水中，制得亞硒酸鈉水溶液；在60hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

2)將0.165gl-抗壞血酸加2ml水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，制得l-抗壞血酸水溶液，然后在攪拌下，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟1)制得的混合溶液中，60hz，30℃，超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

3)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。由原子熒光分光光度計(jì)測(cè)得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子中硒元素的含量為3.97％。

實(shí)施例4

1)稱取0.450g硫酸軟骨素a溶解于3ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍频昧蛩彳浌撬豠水溶液；將0.110g亞硒酸鈉(na2seo3)溶解于1ml水中，制得亞硒酸鈉水溶液；在60hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

2)將0.330gl-抗壞血酸加2ml水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，制得l-抗壞血酸水溶液，然后在攪拌下，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟1)制得的混合溶液中，60hz，30℃，超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

3)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。由原子熒光分光光度計(jì)測(cè)得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子中硒元素的含量為9.05％。

實(shí)施例5

1)稱取0.400g硫酸軟骨素a溶解于3ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍频昧蛩彳浌撬豠水溶液；將0.219g亞硒酸鈉(na2seo3)溶解于1ml水中，制得亞硒酸鈉水溶液；在60hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

2)將0.657gl-抗壞血酸加2ml水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，制得l-抗壞血酸水溶液，然后在攪拌下，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟1)制得的混合溶液中，60hz，30℃，超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

3)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。由原子熒光分光光度計(jì)測(cè)得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子中硒元素的含量為14.20％。

實(shí)施例6

1)稱取0.350g硫酸軟骨素a溶解于3ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制得硫酸軟骨素a水溶液；將0.328g亞硒酸鈉(na2seo3)溶解于1ml水中，制得亞硒酸鈉水溶液；在60hz，30℃超聲條件下，將硒化合水溶液加入硫酸軟骨素a水溶液中，制得混合溶液；

2)將0.985gl-抗壞血酸加2ml水充分?jǐn)嚢柚寥芙?，制得l-抗壞血酸水溶液，然后在攪拌下，將該l-抗壞血酸水溶液逐滴加入步驟1)制得的混合溶液中，60hz，30℃，超聲處理1h，然后將所得溶液裝入透析袋中，放入去離子水溶液中透析過夜，第2天更換去離子水繼續(xù)透析，每隔4小時(shí)更換一次去離子水，直至透析袋中的紅色納米硒不再滲出，收集透析袋中的膠體；

3)將膠體冷凍干燥后得到的紅色物質(zhì)即為硫酸軟骨素a納米硒，將該硫酸軟骨素a納米硒用去離子水再次分散，制得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子。由原子熒光分光光度計(jì)測(cè)得硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子中硒元素的含量為20.20％。

1、硫酸軟骨素納米硒的ir譜圖

硫酸軟骨素a的紅外吸收光譜在3400cm^-1(-oh，存在多糖經(jīng)基)，1620cm^-1(>c＝o)，1560cm^-1(c-n，存在乙酞氨基)，1200cm^-1至800cm^-1間(存在硫酸基)有特征吸收峰。如圖1所示的硫酸軟骨素a納米硒膠束粒子(secs，secs1-6為投料比不同制備的不同硒含量的硫酸軟骨素a納米硒，其中硒的含量分別為0.68％、1.82％、3.97％、9.05％、14.20％和20.20％)與硫酸軟骨素a(cs)的紅外光譜對(duì)比譜圖，橫坐標(biāo)為波數(shù)，可以看到所制備的硫酸軟骨素a納米硒紅外圖譜峰位沒有明顯改變減弱，峰強(qiáng)在1310cm^-1隨著硒含量的增加峰強(qiáng)加強(qiáng)的變化較明顯。納米硒與硫酸軟骨素結(jié)合的方式可能為物理吸附、共價(jià)結(jié)合或者分子間氫鍵。

2、硫酸軟骨素納米硒的xrd譜圖

如圖2所示，將secs1-6與亞硒酸鈉(na2seo3)比較可以發(fā)現(xiàn)二者的峰位和強(qiáng)度完全不同，說明在硫酸軟骨素a中硒的存在方式已經(jīng)發(fā)生變化；而secs與cs的xrd衍射對(duì)比譜圖，橫坐標(biāo)以2θ表示衍射儀掃描角度，縱坐標(biāo)為強(qiáng)度；可以看出，二者晶體衍射的峰位和強(qiáng)度均未發(fā)生較大的變化，說明納米硒的引入并沒有改變硫酸軟骨素a的非晶結(jié)構(gòu)。

3、硫酸軟骨素a納米硒膠束的丁達(dá)爾效應(yīng)

將secs1-6與cs制備成濃度為0.1％的水溶液，超聲10min后依次擺開，用激光筆分別從secs1(左側(cè))和cs(右側(cè))照射，結(jié)果如圖3，發(fā)現(xiàn)secs1-6可見丁達(dá)爾現(xiàn)象，而cs無論從左側(cè)還是右側(cè)照射均無丁達(dá)爾效應(yīng)(當(dāng)一束光線透過膠體，從入射光的垂直方向可以觀察到膠體里出現(xiàn)的一條光亮的“通路”，這種現(xiàn)象叫丁達(dá)爾現(xiàn)象，也叫丁達(dá)爾效應(yīng))，說明secs1-6均能形成較好的膠體。

4、硫酸軟骨素a納米硒的粒徑和表面電位

以去離子水分散不同濃度的硫酸軟骨素a納米硒制成0.1％的膠體，超聲10min后，置于馬爾文納米粒度電位儀(zetasizer)檢測(cè)，粒徑結(jié)果如圖4所示，與cs相比secs的分散性較好，分散系數(shù)pdi可從0.58降至0.078，粒徑分布在30nm-270nm，隨著引入納米硒的濃度增加先減小再增大；表面電位結(jié)果如圖5所示，與cs相比secs表面負(fù)電荷的絕對(duì)值隨著引入納米硒的濃度增加先降低再升高。

5、溶解度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

鑒于secs4的pdi最小，表面電位的絕對(duì)值最大，因此將secs4與本課題組早期研發(fā)的硫酸軟骨素納米硒粒子(css)相比較，結(jié)果如圖6，secs4和css的濃度分別為0.2％和0.5％。比較顏色可以發(fā)現(xiàn)secs4較紅，溶解性良好，而css顏色較淺，并且超聲后尚有一些不溶解的納米粒子。靜置1h后secs4變化不大，而css中可見更多不溶解的納米粒子，因此可以判斷新形成的secs4較原先工藝合成的css溶解性好，性質(zhì)穩(wěn)定，是可以作為醫(yī)用注射劑的潛在可能制劑。

6、硫酸軟骨素納米硒的生物活性

鑒于secs4的pdi最小，表面電位的絕對(duì)值最大，相較于其他secs納米膠束較穩(wěn)定，所以生物活性的研究選擇secs4作為研究對(duì)象，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組分別是對(duì)照組(kbd患者軟骨細(xì)胞)、補(bǔ)硒組(secs4100ng/ml，硒的含量為9.1％)、t-2組(t-2毒素濃度為20ng/ml)、t-2+補(bǔ)硒組。干預(yù)1天后，用live/dead死活細(xì)胞染料染色，觀察不同組細(xì)胞的數(shù)量，圖7為不同干預(yù)下軟骨細(xì)胞的熒光顯微鏡圖(紅色代表死細(xì)胞，綠色代表活細(xì)胞)，可以發(fā)現(xiàn)secs4組軟骨細(xì)胞數(shù)量教對(duì)照組增多，t-2毒素組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量減少，并且可見死亡細(xì)胞(箭頭)，secs4與t-2毒素同時(shí)使用時(shí)細(xì)胞數(shù)較t-2組稍多。

綜上所述，本發(fā)明采用生物活性較高的硫酸軟骨素a作為納米硒的載體替代之前的人工合成化工品硫酸軟骨素，硫酸軟骨素a是多種硫酸軟骨素(a、b、c、d、e等)中的一種，由d-葡糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成的多糖，并在n-乙酰氨基半乳糖的c-4位羥基上發(fā)生硫酸酯化。硫酸軟骨素a也是構(gòu)成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的一種主要的硫酸化多糖，在關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)中的生物大分子有蛋白聚糖的聚集體聚集蛋白聚糖和膠原纖維等，而構(gòu)成蛋白聚糖的主要聚糖為糖胺聚糖，其中以硫酸軟骨素a、c含量最多。

本發(fā)明中的硫酸軟骨素a為高分子聚合物，呈現(xiàn)非晶體結(jié)構(gòu)，硫酸軟骨素a是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中的一種重要的成分，與關(guān)節(jié)應(yīng)力引起的損傷有關(guān)，且與應(yīng)力相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)，本發(fā)明通過硫酸軟骨素a物理吸附作用將納米硒包裹于形成的膠束粒子的中心，并在膠束表面形成負(fù)電荷，以增大膠束表面電位的絕對(duì)值，所以自組裝形成的納米膠束更加穩(wěn)定，而且凍干所得的凍干粉的再分散性亦大大提高。