本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體是一種基于納米脂肪基質細胞修復再生注射物的制備方法。

背景技術：

衰老是機體形態(tài)結構和生理功能全面衰退的動態(tài)、復雜的過程，包括不同器官和一系列特定的病理生理變化。而皮膚衰老是機體整體老化的一部分，與真皮成纖維細胞及血管減少、功能下調密切相關，但具體機制尚未明確。目前，針對皮膚老化的治療手段包括手術和非手術治療。手術治療包括除皺術、下瞼袋切除術、組織填充術等。非手術治療主要包括激光和強脈沖光治療、射頻治療、等離子治療、肉毒素注射和化學剝脫等。各種治療方式都有其優(yōu)缺點，比如激光和強脈沖光可顯著改善色素異常、皺紋，但術后恢復期漫長，而且不當?shù)闹委熆赡軐е聡乐夭涣挤磻?；射頻通過熱能介導真皮加熱促進膠原再生，但對色素沉著沒有治療作用；肉毒素注射主要用于動態(tài)性皺紋的治療，但其作用時間有限，需要多次重復注射；化學剝脫在造成皮膚損傷的基礎上刺激組織再生，可治療皮膚色素性病變，改善皮膚紋理，但治療過程較為痛苦；手術治療只能改善局部的皮膚松弛，無法從根本上改善皮膚狀態(tài)。組織填充術所用材料，可根據(jù)填充效果維持的時間長短，分為短暫性填充劑和永久性填充劑。短暫性填充劑包括膠原、透明質酸和藻酸鹽等，隨著在體內的代謝消除，組織填充的效果也逐漸減弱直至消失。

自體脂肪組織是目前臨床常用的長效組織填充材料，不僅容易獲得、來源充足，而且填充效果持久，無排異反應，可用于治療凹陷瘢痕和較深的皺紋，還可明顯改善皮膚質地，但脂肪組織移植會導致皮下脂肪容積的擴增。自從2001年zuk等首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)吸脂術獲得的脂肪組織中存在脂肪干細胞(adipose-derivedstromal/stemcells，ascs)以來，大量研究證實ascs通過旁分泌和自分泌作用激活甚至直接分化為成纖維細胞，以參與皮膚組織損傷修復和結構重建。ascs作為組織修復與再生理想的種子細胞，目前已證實其在抗衰老、軟組織損傷修復、促進移植脂肪成活等治療中具有顯著療效。以往對脂肪移植的研究主要注重脂肪組織作為填充物在輪廓改善方面的應用，如增加脂肪細胞移植的成活率及提高脂肪移植的長期效果和整體效果。研究發(fā)現(xiàn)在皮下注射脂肪組織可使皮膚年輕化，植入的脂肪組織存活后，不但有體積膨脹效果，且由于合成新膠原使植入部位的皮膚變得緊實，從而改善皮膚的光澤度；植入的脂肪組織在植入部位生成新的血管，從而形成新的生理平衡，后期研究認為脂肪組織中含有的ascs發(fā)揮了重要作用，其分化刺激大量i型膠原蛋白、少量v型和ⅵ型膠原蛋白的生成，以及成纖維細胞的重組、分泌大量新的細胞基質成分，從而修復原有的真皮斷裂，重建、修復皮膚結構，表明其在組織再生及美容抗衰老領域中的具有廣闊的臨床應用前景，[zukpa,zhum,mizunoh,huangj,futrelljw,katzaj,benhaimp,lorenzhp,hedrickmh.multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.tissueeng,2001,7(2):211-28.nautaa,seidelc,devezal,montorod,grovam,kosh,hyunj,gurtnergc,longakermt,yangf.adipose-derivedstromalcellsoverexpressingvascularendothelialgrowthfactoracceleratemouseexcisionalwoundhealing.molther,2013,21(2):445-455.leesh,jinsy,songjs,seokk,chokh.paracrineeffectsofadipose-derivedstemcellsonkeratinocytesanddermalfibroblasts.anndermatol，2012，24:136-143.kimws,parkbs,sungjh,yangjm,parksb,kwaksj,parkjs.woundhealingeffectofadipose-derivedstemcells:acriticalroleofsecretoryfactorsonhumandermalfibroblasts.jdermatolsci,2007,48(1):15-24.gaop,yangx,mungurl,kampos,wenq.adiposetissue-derivedstemcellsattenuateacutelunginjurythroughenosandenos-derivedno.intjmolmed.2013,31(6):1313-1318.]

自2005年以來，我們的研究團隊以人類不同解剖部位的皮下脂肪為組織來源，建立了自己的一整套實驗技術平臺及方法，進一步優(yōu)化ascs分離培養(yǎng)方案，并對其進行多潛能分化表型鑒定，通過在細胞體外培養(yǎng)或體內移植過程中添加中藥單體或自體血細胞因子等成分，觀察及評價細胞表型及其它生物學行為的變化情況，同時評價這些成分對脂肪干細胞生長增殖、多向分化、旁分泌功能及特定組織構建的影響，在優(yōu)化脂肪干細胞生物學功能方面取得了可喜的研究成果，為脂肪干細胞應用于組織工程、再生醫(yī)學研究及其在臨床上促進創(chuàng)傷修復、組織再生及美容抗衰老等治療提供可靠的理論依據(jù)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于納米脂肪基質細胞修復再生注射物的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：

1.一種基于納米脂肪基質細胞修復再生注射物的制備方法，制備方法包括以下步驟：

1)納米脂肪基質細胞的提取與純化

選取大腿上段內外側或下腹部為供區(qū)，用手持20ml針筒預留空氣法低負壓抽取，根據(jù)患者情況，選定脂肪供區(qū)位置后，局部腫脹液浸潤麻醉，采用自行設計的多孔專用吸脂針由深層向淺層呈扇形反復抽吸；將抽吸出來的脂肪顆粒用生理鹽水沖洗備用；采取低速離心方法獲取并純化脂肪顆粒，離心轉速600rpm/min，離心時間2min，操作過程全程遵循無菌密閉操作原則，盡量減少脂肪組織與空氣的接觸時間；將純化后的脂肪顆粒經(jīng)機械搗碎乳化法制備富含脂肪干細胞的納米脂肪基質細胞，將脂肪顆粒經(jīng)孔徑0.5mm的濾網(wǎng)過濾，隨后將顆粒脂肪經(jīng)2個20ml注射針筒連接納米脂肪專用乳化器快速對打30次，機械乳化，然后用0.5mm孔徑的濾網(wǎng)再次過濾，最后經(jīng)轉速為8000rpm/min離心，離心時間為5min，高速離心去除油脂后得到的脂肪乳化液即為納米脂肪，這部分乳化后的納米脂肪攜帶有較多的基質血管成分和脂肪干細胞；有利于損傷或老化皮膚組織的修復與再生。

2)富血小板纖維蛋白析出液的提取與儲存

抽取患者的適量靜脈血20ml，分裝于無菌負壓試血管內，采用一次高速離心，轉速為2700rpm/min，離心時間為12min提取富含細胞因子的凝膠狀物質，靜置5min，得到富血小板纖維蛋白凝膠，此時血液分3層，最上層：貧血小板血漿，為淡黃色透明清亮液體；中間層：富血小板纖維蛋白，為淡黃色凝膠狀物質；最下層：紅細胞碎片，為暗紅色物質，排出其中多余的紅細胞；將富血小板纖維蛋白單獨提取出來，放置于無菌試管，在4℃冰箱中儲存7d后，再提取其中的析出液備用；同時對富血小板纖維蛋白在1～28d時間段內進行細胞因子釋放濃度的檢測。

3)將納米脂肪基質細胞、富血小板纖維蛋白析出液與氨甲環(huán)酸、維生素c、還原型谷光甘肽5種成分依次按10％:3％:3％:1％:1％質量比例制備注射物。

上述的基于納米脂肪基質細胞修復再生注射物的應用臨床上面部、頸部及其它皮膚組織的修復再生與除皺美白抗衰老等治療。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明方法安全性可靠，且效果顯著。

2.本發(fā)明方法為脂肪干細胞應用于組織工程、再生醫(yī)學研究及其在臨床上促進創(chuàng)傷修復、組織再生及美容抗衰老等治療提供可靠的理論依據(jù)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明結構性顆粒脂肪和納米脂肪的提取圖。

圖2是本發(fā)明富含細胞因子纖維蛋白及其析出液的提取示意圖。

圖3是本發(fā)明不同時間點富含細胞因子纖維蛋白膠釋放細胞因子酶聯(lián)免疫吸附檢測結果圖。

圖4基于納米脂肪修復再生技術的皮膚抗衰老注射物的配制比例圖。

圖5是本發(fā)明實施例1手術前后對比圖。

圖中，a為治療前，b為治療后6個月。

圖6是本發(fā)明實施例2手術前后對比圖。

圖中，a、b、c為治療前，d、e、f為治療后6個月。

圖7是本發(fā)明實施例3治療前后對比圖。

圖中，a、b為治療前，c、d為治療后1個月。

具體實施方式

下面結合具體實施對本發(fā)明作進一步說明。

1.一種基于納米脂肪基質細胞修復再生注射物的制備方法，制備方法包括以下步驟：

1)納米脂肪基質細胞的提取與純化

選取大腿上段內外側或下腹部為供區(qū)，用手持20ml針筒預留空氣法低負壓抽取，根據(jù)患者情況，選定脂肪供區(qū)位置后，局部腫脹液浸潤麻醉，采用自行設計的多孔專用吸脂針由深層向淺層呈扇形反復抽吸；將抽吸出來的脂肪顆粒用生理鹽水沖洗備用；采取低速離心方法獲取并純化脂肪顆粒，離心轉速600rpm/min，離心時間2min，操作過程全程遵循無菌密閉操作原則，盡量減少脂肪組織與空氣的接觸時間；將純化后的脂肪顆粒經(jīng)機械搗碎乳化法制備富含脂肪干細胞的納米脂肪基質細胞，將脂肪顆粒經(jīng)孔徑0.5mm的濾網(wǎng)過濾，隨后將顆粒脂肪經(jīng)2個20ml注射針筒連接納米脂肪專用乳化器快速對打30次，機械乳化，然后用0.5mm孔徑的濾網(wǎng)再次過濾，最后經(jīng)轉速為8000rpm/min離心，離心時間為5min，高速離心去除油脂后得到的脂肪乳化液即為納米脂肪，這部分乳化后的納米脂肪攜帶有較多的基質血管成分和脂肪干細胞；有利于損傷或老化皮膚組織的修復與再生，如圖1所示。

2)富血小板纖維蛋白析出液的提取與儲存

抽取患者的適量靜脈血20ml，分裝于無菌負壓試血管內，采用一次高速離心，轉速為2700rpm/min，離心時間為12min提取富含細胞因子的凝膠狀物質，靜置5min，得到富血小板纖維蛋白凝膠，此時血液分3層，最上層：貧血小板血漿，為淡黃色透明清亮液體；中間層：富血小板纖維蛋白，為淡黃色凝膠狀物質；最下層：紅細胞碎片，為暗紅色物質，排出其中多余的紅細胞如圖2所示；將富血小板纖維蛋白單獨提取出來，放置于無菌試管，在4℃冰箱中儲存7d后，再提取其中的析出液備用；同時對富血小板纖維蛋白在1～28d時間段內進行細胞因子釋放濃度的檢測，如圖3所示。

3)將納米脂肪基質細胞、富血小板纖維蛋白析出液與氨甲環(huán)酸、維生素c、還原型谷光甘肽5種成分依次按10％:3％:3％:1％:1％質量比例制備注射物，放置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?；因配制后的注射物含有多種細胞因子、氨甲環(huán)酸、維生素c還原型谷光甘肽抗氧化成分，有利于減輕皮膚色素沉著，具有抗氧化、美白抗衰老等功效，如圖4所示。

上述的基于納米脂肪基質細胞修復再生注射物的應用臨床上面部、頸部及其它皮膚組織的修復再生與除皺美白抗衰老等治療，如圖5、圖6、圖7所示。