本發(fā)明涉及一種藥物組合物，尤其涉及一種抑制pcsk9基因表達(dá)的藥物組合物。

背景技術(shù)：

高脂血癥(hyperlipidemia，hl)是指血脂高于正常參考值的上限的現(xiàn)象，是由多種原因?qū)е轮鞍缀铣膳c清除平衡紊亂所致。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，一些基因缺陷或表達(dá)失衡，使參與脂蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的受體、酶或載脂蛋白異常，導(dǎo)致血脂升高。高脂血癥是引起動脈粥樣硬化、腦中風(fēng)等心腦血管疾病的重要原因，利用藥物控制血脂水平，可以減少心腦血管疾病的發(fā)病率，具有重要的臨床意義。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，pcsk9)基因是近十年來發(fā)現(xiàn)的一種新的致病基因，該基因編碼一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，名為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1(neuralapoptosis-regulatedconvertasel，narc-1)，可介導(dǎo)低密度脂蛋白受體(low-densitylipoproteinreceptor，ldlr)降解，升高血漿中低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，ldl-c)的水平，該基因的各種突變會導(dǎo)致異常膽固醇血癥。他汀類是目前臨床上最常用的降脂藥物，降脂效果得到認(rèn)可，但也存在部分副作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在降脂的同時，能增強(qiáng)pcsk9表達(dá)，從而增強(qiáng)ldlr降解，從而導(dǎo)致ldlr數(shù)量減少，進(jìn)而影響到循環(huán)中l(wèi)dl-c的清除，導(dǎo)致ldl-c水平升高，使他汀類藥物降脂效果受到抑制。

黃芪性甘，微溫，是傳統(tǒng)中藥材，以玉屏風(fēng)散、防己黃芪湯等經(jīng)典方劑為代表，黃芪在我國的使用有著悠久的歷史，有補(bǔ)氣、利尿、生肌、脫毒等功效。黃芪的主要藥學(xué)活性物質(zhì)基礎(chǔ)為皂苷類、黃酮類及多糖類，另外含有有機(jī)酸類、微量元素、氨基酸、葉酸、甜菜堿等化學(xué)成分。黃酮類及異黃酮類成分是黃芪屬植物中重要的藥理性成分，其中黃酮類成分主要促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，以及顯著的抗氧化特性；異黃酮類具有抗菌、降血脂、抗氧化性、類雌激素樣作用等作用。

二硝酸異山梨醇酯可通過擴(kuò)張外周血管，特別是增加靜脈血容量，減少回流量，降低心臟前后負(fù)荷，而減少心肌耗氧量。主要藥理作用是松弛血管平滑肌，釋放一氧化氮，一氧化氮與內(nèi)皮釋放的舒張因子相同，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)鳥苷酸增加，肌酸蛋白輕鏈去磷酸化，從而松弛血管平滑肌，擴(kuò)張冠狀動脈，增加冠脈血流量；擴(kuò)張外周動脈，降低外周血管阻力，降低血壓。

針對高脂血癥的治療，為了在獲得顯著降脂效果的同時取得有效預(yù)防或改善其他心血管疾病的療效，發(fā)明人根據(jù)高血脂臨床治療的最新研究進(jìn)展情況和高血脂患者的疾病發(fā)展趨勢，創(chuàng)造性地將黃芪異黃酮提取物與二硝酸異山梨醇酯聯(lián)用治療高血脂，協(xié)同降低血脂，目前未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本案提供一種抑制pcsk9基因表達(dá)的藥物組合物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本案通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種藥物組合物，其中，所述的藥物組合物包括黃芪異黃酮提取物及二硝酸異山梨醇酯。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的黃芪異黃酮提取物中異黃酮總含量為20～95％。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的黃芪異黃酮提取物包括毛蕊異黃酮-7-o-β-d-葡萄糖苷、芒柄花素-7-o-β-d-葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的黃芪異黃酮提取物中異黃酮總含量為20～95％，其中毛蕊異黃酮的含量為5～16％。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物，其中，所述黃芪異黃酮類提取物和二硝酸異山梨醇酯的重量比為10-35：1。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物中還含有可藥用載體或賦形劑，如羧甲基纖維素、淀粉、β-環(huán)糊精的一種或多種。

優(yōu)選的是，所述的藥物組合物，其中，所述的藥物組合物為膠囊劑、片劑、顆粒劑或溶液劑。

一種藥物組合物在pcsk9基因表達(dá)抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)該藥物組合物能夠抑制肝臟pcsk9基因表達(dá)，增加ldlr表達(dá)量。

(2)該藥物組合物顯示了優(yōu)異的降低血中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的作用，因此作為用于降低血中l(wèi)dl膽固醇的藥物是有用的。

附圖說明

圖1為藥物組合物對高血脂模型大鼠肝臟pcsk9和ldlr的mrna表達(dá)

與空白對照組比較，^*p＜0.02；與高脂模型組比較，^&p＜0.02；與聯(lián)合用藥組比較，^#p＜0.02。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1：黃芪異黃酮提取物的制備

取黃芪藥材，粉碎，以80％乙醇回流提取兩次(2小時，1小時)過濾，合并兩次乙醇提液，減壓回收溶劑，濃縮至含0.8g生藥/ml，再以2ml/min速度通過20gh-107型大孔樹脂，上樣量不超過3g生藥/ml樹脂，依次用6倍柱體積純水，6倍柱體積30％乙醇，8倍柱體積80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫部分，洗脫液減壓回收溶劑，60℃干燥，粉碎，即得。

共制備3批樣品，其黃芪異黃酮總含量(以毛蕊異黃酮計(jì)算)及毛蕊異黃酮的含量分別見表1：

表1黃芪異黃酮提取物的制備結(jié)果

將3批樣品混合得到黃芪異黃酮提取物，作為下面的生物學(xué)試驗(yàn)的樣品。

實(shí)施例2：黃芪異黃酮提取物和二硝酸異山梨醇酯組合物對高脂血癥大鼠模型pcsk9基因表達(dá)的影響

1、分組及模型建立

spf級雄性sd大鼠60只，體重(150±20)g，分籠喂養(yǎng)于室溫下明暗各24h的動物飼養(yǎng)室內(nèi)，飲水不限。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)(喂食普通飼料)1周后，隨機(jī)分為空白對照組、高脂模型組、二硝酸異山梨醇酯組、黃芪異黃酮組和黃芪異黃酮與二硝酸異山梨醇酯聯(lián)合用藥組5組。根據(jù)人體實(shí)驗(yàn)劑量和成人與大鼠的體重折算系數(shù)折算成大鼠用藥量。造模同時灌胃給黃芪異黃酮和二硝酸異山梨醇酯，黃芪異黃酮劑量為每天100mg/kg，二硝酸異山梨醇酯劑量為每天5mg/kg，聯(lián)合用藥組以兩者聯(lián)合劑量給藥；空白對照組和高脂模型組每天灌服0.1％的羧甲基纖維素鈉，每周稱重1次用以調(diào)整灌胃量，連續(xù)給藥10周。

2、動物處置及標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥后，禁食24h，不禁水，稱體重，7％水合氯醛皮下麻醉，腹主動脈采血10ml。將大鼠處死后，迅速剝?nèi)∑淙扛闻K，用預(yù)冷5℃的生理鹽水反復(fù)沖洗，直到未見淤血，用濾紙吸干，做好標(biāo)記并稱重、拍照。標(biāo)本采集完后，所剩動物尸體按有關(guān)要求進(jìn)行處置。

3、大鼠血脂的測定

將采集的大鼠血液5℃、3500r/min離心10min，分離血清，全自動生化分析儀測定tc(總膽固醇)和ldl-c。

4、real－timepcr檢測大鼠肝臟pcsr9和ldlr的mrna表達(dá)

在冰上將肝臟組織用trizol試劑勻漿至無明顯組織顆粒，并按trizol試劑盒操作要求提取肝臟總rna，按rt－pcr試劑盒操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增的cdna加入至20μl的反應(yīng)體系中。pcsk9的上游引物序列為5’-acgatgcctgcctcactcc-3’，下游引物序列為5’-gcctgtgatgtcccactctgt-3’；ldlr的上游引物序列為5’-gattggctatgagtgcctatgtc-3’，下游引物序列為5’-gtgaagagcagaaaccctatgg-3’；gapdh的上游引物序列為5’-caaggtcatccatgacaactttg-3’，下游引物序列為5’-gtccaccaccctgttgctgtag-3’，以gapdh作為內(nèi)參照，目的基因pcsk9的表達(dá)根據(jù)經(jīng)real－timepcr儀器檢測的ct值，通過公式2^-△△ct計(jì)算相對表達(dá)量。

5、westernblot法檢測大鼠肝臟pcsk9和ldlr蛋白的表達(dá)

在冰上將肝臟組織用細(xì)胞裂解液勻漿至無明顯組織顆粒，靜置充分裂解，離心后取上清，用bca法測定蛋白濃度，蛋白定量100μg，煮沸10min，上樣于5％sds－page膠電泳2h，全濕式電轉(zhuǎn)將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜上。室溫下用含5％脫脂奶粉封閉2h。加入i抗(兔抗鼠pcsk9，1：1000；兔抗鼠β－actin抗體，1：5000)及ⅱ抗(1：5000)，化學(xué)發(fā)光檢測目的條帶，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±sd)表示，采用spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，資料經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較，采用snk-q檢驗(yàn)法，以p＜0.02表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

7、結(jié)果

7.1藥物組合物對高血脂模型大鼠血清血脂水平的影響

各組大鼠血脂水平見表2，結(jié)果顯示與正常對照組比較，高脂模型組大鼠血清tc和ldl-c水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)，與模型組大鼠比較，二硝酸異山梨醇酯組、黃芪異黃酮組和黃芪異黃酮與二硝酸異山梨醇酯聯(lián)合用藥組tc、ldl-c水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)，二硝酸異山梨醇酯組、黃芪異黃酮組比較，以上指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與兩者單獨(dú)用藥比較，黃芪異黃酮與二硝酸異山梨醇酯聯(lián)合用藥組大鼠血清tc、ldl-c水平均明顯降低(p＜0.02)。

表2各組大鼠血脂水平對比(n＝12)

注：與空白對照組比較，^*p＜0.02；與高脂模型組比較，^&p＜0.02；與聯(lián)合用藥組比較，^#p＜0.02。

7.2藥物組合物對高血脂模型大鼠肝臟pcsk9和ldlr的mrna表達(dá)的影響

各組大鼠肝臟pcsk9和ldlr的mrna表達(dá)見圖1，與正常對照組比較，高脂模型組pcsk9的mrna表達(dá)明顯升高，ldlr的mrna表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)。與高脂模型組比較，二硝酸異山梨醇酯組pcsk9和ldlr的mrna表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)；黃芪異黃酮組pcsk9的mrna表達(dá)降低不明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)，ldlr的mrna表達(dá)升高不明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)；聯(lián)合用藥組pcsk9的mrna表達(dá)明顯降低，ldlr的mrna表達(dá)則明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)。

7.3藥物組合物對高血脂模型大鼠肝臟pcsk9和ldlr蛋白表達(dá)的影響

各組大鼠肝臟pcsk9和ldlr蛋白的表達(dá)見表3，結(jié)果顯示與正常對照組比較，高脂模型組pcsk9的蛋白表達(dá)明顯升高，ldlr的蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)。與高脂模型組比較，二硝酸異山梨醇酯組的pcsk9蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，ldlr蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)；黃芪異黃酮組的pcsk9蛋白表達(dá)明顯降低，ldlr蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)；聯(lián)合用藥組的pcsk9蛋白表達(dá)明顯降低，ldlr蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)。聯(lián)合用藥組pcsk9蛋白表達(dá)均低于單獨(dú)黃芪異黃酮組合和二硝酸異山梨醇酯組的蛋白表達(dá)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)；聯(lián)合用藥組ldlr蛋白表達(dá)均高于黃芪異黃酮組和二硝酸異山梨醇酯組的蛋白表達(dá)值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.02)。

表3各組大鼠pcsk9和ldlr蛋白表達(dá)水平(n＝12)

注：與空白對照組比較，^*p＜0.02；與高脂模型組比較，^&p＜0.02；與聯(lián)合用藥組比較，^#p＜0.02。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。