本申請是申請日為2010年08月19日，申請?zhí)枮?01080060632.7，發(fā)明名稱為“包含格拉默或其藥用鹽的儲藥系統(tǒng)”的申請的分案申請。

本發(fā)明涉及醋酸格拉默(glatirameracetate)和格拉默(glatiramer)的其它藥用鹽的長效劑型。特別優(yōu)選的是用于醋酸格拉默的延長釋放的儲藥系統(tǒng)(depotsystem)和其它可植入系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

醋酸格拉默

共聚物-1，還稱作醋酸格拉默并以商標(biāo)銷售，包含多肽的醋酸鹽，上述多肽含有l(wèi)-谷氨酸、l-丙氨酸、l-酪氨酸和l-賴氨酸。氨基酸的平均摩爾分?jǐn)?shù)分別為0.141、0.427、0.095和0.338，并且共聚物-1的平均分子量為4,700至11,000道爾頓?；瘜W(xué)上，醋酸格拉默是指定的l-谷氨酸聚合物，并具有l(wèi)-丙氨酸、l-賴氨酸和l-酪氨酸，醋酸(鹽)。它的結(jié)構(gòu)式是：

(glu,ala,lys,tyr)xch3cooh(c5h9no4_c3h7no2_c6h14n2o2_c9h11no3)xc2h4o2[cas-147245-92-9]，大約比率為glu14ala43tyr10lyz34x(ch3cooh)20。是澄清、無色至微黃色、無菌、非致熱溶液，用于皮下注射。每毫升包含20mg醋酸格拉默和40mg甘露醇。溶液的ph范圍大約為5.5至7.0。

作用機(jī)制

醋酸格拉默是無規(guī)聚合物(平均分子質(zhì)量為6.4kd)，包括4種在髓磷脂堿性蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。醋酸格拉默的作用機(jī)制是未知的，雖然已出現(xiàn)這種共聚物的一些重要的免疫學(xué)特性。給予共聚物-1會使t細(xì)胞群體從促炎th1細(xì)胞移動到調(diào)節(jié)th2細(xì)胞，其抑制炎性反應(yīng)(fda標(biāo)簽)。鑒于它與髓磷脂堿性蛋白的相似性，共聚物-1還可以作為誘餌，來轉(zhuǎn)移相對于髓磷脂的自身免疫反應(yīng)。然而，至少在治療的早期，血腦屏障的完整性并不受到共聚物-1的明顯影響。

共聚物-1是非自身抗原，已證明其可以抑制由各種致腦炎因子(包括小鼠脊髓勻漿(msch))誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(eae)，其包括髓磷脂抗原，如髓磷脂堿性蛋白(mbp)(selametal.,bullinstpasteur(1990)88303-314)、蛋白脂質(zhì)蛋白(plp)(teitelbaumdetal.,jneuroimmunol(1996)64209-217)和在各種物種中的髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(mog)(ben-nunaetal.,jneurol(1996)243(suppl1)s14-s22)。eae是多發(fā)性硬化癥的接受模型。

已證明，當(dāng)皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射時，共聚物-1是活性的(teitelbaumdetal.,eurjimmunol(1971)1242-248；teitelbaumdetal.,eurjimmunol(1973)3273-279)。在iii期臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)，每日皮下注射共聚物-1會放慢無能的進(jìn)展并降低加劇-緩解多發(fā)性硬化癥的復(fù)發(fā)率(johnsonkp,neurology(1995)165-70；www.copaxone.com)。共聚物-1治療目前限于每日皮下給予。在us6,214,791中披露了通過攝入或吸入共聚物-1來進(jìn)行治療，但還未表明這些給予途徑在人患者中可以獲得臨床療效。

療效

在患有復(fù)發(fā)-緩解多發(fā)性硬化癥(rrms)的患者中支持醋酸格拉默在降低復(fù)發(fā)頻率方面的有效性的證據(jù)來自兩項(xiàng)安慰劑對照試驗(yàn)，其均使用20mg/天的醋酸格拉默劑量。在rrms的安慰劑對照試驗(yàn)中沒有研究其它劑量或劑量方案(www.copaxone.com)。認(rèn)可的20mg劑量和40mg劑量的比較試驗(yàn)表明，在這些劑量之間療效沒有顯著性差異(the9006trial；cohenjaetal.,neurology(2007)68939-944)。醋酸格拉默的各種臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。這些臨床試驗(yàn)包括用較高劑量的醋酸格拉默進(jìn)行的研究(40mg–forte研究)；對臨床孤立性綜合征患者進(jìn)行的研究(precise研究)；以及許多組合和誘導(dǎo)方案，其中和另一種活性產(chǎn)物一起或在其以后給予醋酸格拉默。

副作用

目前，多發(fā)性硬化癥的所有特別認(rèn)可的治療涉及活性物質(zhì)的自我注射。經(jīng)常觀察到的注射部位問題包括刺激、超敏感性、炎癥、疼痛和甚至壞死(在干擾素1β治療的情況下)以及低水平的患者依從性。

副作用通常包括在注射部位的團(tuán)塊(注射部位反應(yīng))、疼痛、發(fā)熱、和寒戰(zhàn)。這些副作用的特性通常是溫和的。偶爾在注射以后數(shù)分鐘發(fā)生反應(yīng)，其中存在潮紅、呼吸短促、焦慮和快速心搏。這些副作用在30分鐘內(nèi)減退。隨著時間的推移，可以在注射部位發(fā)展可見凹痕，這是由于脂肪組織的局部破壞，稱作皮下脂肪萎縮。因而，期望一種可替換的給予方法。

按照fda的處方標(biāo)注，已報道了醋酸格拉默的更嚴(yán)重的副作用，它們包括對身體的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)(包括肝臟)、造血及淋巴系統(tǒng)、肌肉骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、特殊感官(尤其是眼)、泌尿生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重的副作用；還報道了代謝和營養(yǎng)障礙；然而，還沒有明確建立在醋酸格拉默和這些不利影響之間的聯(lián)系(fda標(biāo)簽)。

儲藥系統(tǒng)(depotsystem)

通過靜脈內(nèi)(iv)、肌內(nèi)(im)、或皮下(sc)注射的胃腸道外途徑是遞送較小和較大分子量藥物的最常見和最有效的形式。然而，起因于針扎的疼痛、不適和不方便使得這種藥物遞送方式成為患者最少優(yōu)選的。因而，可以在最低限度減少注射總數(shù)的任何藥物遞送技術(shù)是優(yōu)選的。在實(shí)踐中，可以通過使用可注射的儲藥制劑來減小給予藥物的頻率，上述儲藥制劑能夠以緩慢但可預(yù)見的方式來釋放藥物，因而可以改善依從性。對于大多數(shù)藥物，取決于劑量，可以減小注射頻率：從每日一次到每月一次或兩次或甚至更長時間(6個月)。除改善患者舒適度以外，通過消除高峰和低谷，儲藥制劑的藥性的較小頻繁注射可以緩和血漿濃度-時間曲線。血漿分布的上述緩和有可能在大多數(shù)情況下不僅提高治療效果，而且可以減少任何不需要的事件，如免疫原性等(經(jīng)常伴隨較大分子量藥物)。

微顆粒、植入物和凝膠是在實(shí)踐中使用的可生物降解聚合物裝置的最常見形式，用于延長藥物在體內(nèi)的釋放。在注射以前立刻將微顆粒懸浮在水介質(zhì)中，并且可以在懸浮液中加載多達(dá)40％固體。借助于處于干燥狀態(tài)的特殊針而不需要水介質(zhì)，來將植入物/棒劑型遞送到sc/im組織。棒/植入物的這種特點(diǎn)便于遞送較高質(zhì)量的劑型以及藥物含量。另外，在棒/植入物中，最初爆發(fā)的問題被最小化，這是由于和微顆粒相比，植入物的小得多的面積。除可生物降解系統(tǒng)之外，還有不可生物降解植入物和可以佩戴在體外的輸注泵。不可生物降解植入物需要醫(yī)生的訪問：不僅為了將裝置植入sc/im組織，而且為了在藥物釋放期以后除去它們。

包含微顆粒制劑的可注射組合物特別容易出現(xiàn)問題。和在其它類型的可注射懸浮液中的0.5-5％固體相比，微顆粒懸浮液可以包含多達(dá)40％的固體。另外，和建議用于im或sc給予的小于5μm的顆粒尺寸相比，在可注射儲藥產(chǎn)品中所使用的微顆粒的尺寸高達(dá)約250μm(平均60-100μm)。更高濃度的固體、以及更大的固體顆粒尺寸需要更大尺寸的針(約18-21號規(guī)格)來注射?？傊M管很少使用較大的和不舒服的針，但和用較小針每天藥物注射相比，患者還是喜歡不經(jīng)常給予劑型。

聚乳酸(pla)的可生物降解聚酯以及丙交酯和乙交酯的共聚物，稱作聚(丙交酯-乙交酯)(plga)，是用于可生物降解劑型的最常見的聚合物。pla是疏水性分子并且plga比pla更快地降解，這是因?yàn)楦哂H水性的乙交酯基團(tuán)的存在。這些生物相容性聚合物經(jīng)受酯鍵的隨機(jī)的非酶促的水解切割以形成乳酸和乙醇酸，其是體內(nèi)的正常代謝化合物?？晌湛p線、小夾和植入物是這些聚合物的最早應(yīng)用。在1970年，南方研究所(southernresearchinstitute)開發(fā)了第一種合成的可吸收縫線描述plga聚合物在緩釋劑型中的應(yīng)用的第一個專利出現(xiàn)于1973年(us3,773,919)。

今天，plga聚合物可商業(yè)上獲自多個供應(yīng)商：alkermes(medisorb聚合物)、absorbablepolymersinternational[先前的birminghampolymers(durect的一個部門)]、purac和boehringeringelheim。除plga和pla之外，天然纖維素聚合物如淀粉、淀粉衍生物、葡聚糖和非plga合成聚合物，也被開發(fā)為在上述系統(tǒng)中的可生物降解聚合物。

目前，不能獲得醋酸格拉默的長效劑型。這是巨大的未滿足的醫(yī)療需求，因?yàn)檫@些劑型將極為有利于許多患者，尤其是有利于具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或身體殘疾的那些患者。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了長效胃腸道外藥物組合物，該組合物包含治療有效量的格拉默的藥用鹽，例如，醋酸格拉默。尤其是，本發(fā)明提供了長效藥物組合物，該組合物包含治療有效量的儲藥形式(depotform)的格拉默鹽，適用于在醫(yī)療上可接受的位置胃腸道外給予對其需要的主體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括胃腸道外給予或植入組合物，該組合物包含治療有效量的格拉默的藥用鹽，優(yōu)選醋酸格拉默。

出乎預(yù)料地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的原則的長效藥物組合物相對于市售每日注射劑型可以提供相同或更好的療效，并在局部和/或全身水平具有降低的副作用的發(fā)生率和/或嚴(yán)重性。

根據(jù)一些實(shí)施方式，醋酸格拉默包含l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-賴氨酸、和l-酪氨酸的醋酸鹽，摩爾比率為約0.14谷氨酸、約0.43丙氨酸、約0.10酪氨酸和約0.33賴氨酸。

根據(jù)其它實(shí)施方式，醋酸格拉默或格拉默的其他藥用鹽包含約15至約100個氨基酸。

根據(jù)某些實(shí)施方式，可植入儲藥適合于皮下或肌內(nèi)植入。

根據(jù)可替換的實(shí)施方式，長效胃腸道外藥物組合物包含用于格拉默鹽如醋酸格拉默的藥用可生物降解或不可生物降解載體。

根據(jù)一些實(shí)施方式，載體選自plga、pla、pga、聚己內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、聚原酸酯、聚鏈烷酸酐、明膠、膠原、氧化纖維素、和聚磷腈。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。

根據(jù)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的長效藥物組合物具有通過水包油包水雙重乳化工藝(water-inoil-inwaterdoubleemulsificationprocess)制備的微顆粒的形式。在目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的長效藥物組合物包括：內(nèi)部水相，其包含治療有效量的格拉默的藥用鹽；水不混溶的聚合物相，其包含選自可生物降解和不可生物降解聚合物的載體；以及外部水相。在其它目前優(yōu)選的實(shí)施方式中，水不混溶的聚合物相包含選自pla和plga的可生物降解聚合物。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。在另外的實(shí)施方式中，外部水相包含表面活性劑，其選自聚乙烯醇(pva)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物和纖維素酯。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。

本發(fā)明涵蓋適用于植入對其需要的個體的儲藥形式的醋酸格拉默或格拉默的任何其它藥用鹽用于治療多發(fā)性硬化癥的用途。

本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋使用醋酸格拉默的可植入儲藥，其適用于提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

在本發(fā)明范圍內(nèi)的是儲藥形式的格拉默的藥用鹽，其適合用于治療多發(fā)性硬化癥或提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

本發(fā)明還包括醋酸格拉默與至少一種另外藥物，優(yōu)選地，免疫抑制劑，尤其是芬戈莫德(fingolimod)的組合。

根據(jù)一些實(shí)施方式，長效藥物組合物適用于每周一次到每6個月一次的給藥時間表。

根據(jù)特定的實(shí)施方式，組合物適合于從每2周一次到每月一次的給藥。

根據(jù)一些實(shí)施方式，長效組合物包括20-750mg醋酸格拉默/注射的劑量。

長效組合物的具體實(shí)例將包括可生物降解或不可生物降解微球體、任何適宜幾何形狀的植入物、可植入棒、可植入膠囊、可植入環(huán)、延長釋放凝膠和易侵蝕基質(zhì)。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。

本申請還涉及以下內(nèi)容：

1)一種長效胃腸道外藥物組合物，包含治療有效量的格拉默的藥用鹽。

2)一種長效藥物組合物，包括治療有效量的儲藥形式的格拉默的藥用鹽，所述儲藥形式適合于在醫(yī)療上可接受的位置植入對其需要的主體。

3)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，其中，所述格拉默的藥用鹽是醋酸格拉默。

4)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，適合于皮下或肌內(nèi)植入。

5)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，其中，所述格拉默包含l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-賴氨酸、和l-酪氨酸，摩爾比率為約0.14谷氨酸、約0.43丙氨酸、約0.10酪氨酸和約0.33賴氨酸。

6)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，其中，所述格拉默包含約15至約100個氨基酸。

7)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，其中，所述格拉默的藥用鹽的劑量為約20至約750mg范圍。

8)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含藥用可生物降解或不可生物降解載體。

9)根據(jù)8)所述的藥物組合物，其中，所述載體選自plga、pla、pga、聚己內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、聚原酸酯、聚鏈烷酸酐、明膠、膠原、氧化纖維素、和聚磷腈。

10)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，具有通過水包油包水雙重乳化工藝制備的微顆粒的形式。

11)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，包含：內(nèi)部水相，所述內(nèi)部水相包含治療有效量的格拉默的藥用鹽；水不混溶的聚合物相，所述水不混溶的聚合物相包含可生物降解或不可生物降解聚合物；以及外部水相。

12)根據(jù)11)所述的藥物組合物，其中，所述水不混溶的聚合物相包含選自pla和plga的可生物降解聚合物。

13)根據(jù)11)所述的藥物組合物，其中，所述外部水相包含表面活性劑，所述表面活性劑選自聚乙烯醇(pva)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物和纖維素酯。

14)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，適合于每周一次至每6個月一次的給藥時間表。

15)根據(jù)14)所述的藥物組合物，適合于每2周一次至每月一次的給藥時間表。

16)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，具有以下形式：可生物降解微球體、不可生物降解微球體、任何適宜幾何形狀的植入物、可植入棒、可植入膠囊、可植入環(huán)、或延長釋放凝膠或易侵蝕基質(zhì)。

17)根據(jù)1)或2)所述的藥物組合物，其中，相對于醋酸格拉默的市售每日注射劑型，所述組合物提供相同或更好的療效，在局部和/或全身水平，副作用的發(fā)生率降低和/或副作用的嚴(yán)重性降低。

18)根據(jù)17)所述的藥物組合物，其中，與大致相同劑量的醋酸格拉默的立即釋放劑型相比，所述組合物提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

19)一種用于治療多發(fā)性硬化癥的方法，其中，通過胃腸道外給予根據(jù)1)所述的長效藥物組合物。

20)一種用于治療多發(fā)性硬化癥的方法，包括以下步驟：將根據(jù)2)所述的長效藥物組合物植入對其需要的主體。

21)根據(jù)19)或20)所述的方法，包括以下步驟：皮下給予或肌內(nèi)植入所述藥物組合物。

22)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，所述藥物組合物包含醋酸格拉默。

23)根據(jù)22)所述的方法，其中，所述醋酸格拉默包含l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-賴氨酸、和l-酪氨酸，摩爾比率為約0.14谷氨酸、約0.43丙氨酸、約0.10酪氨酸和約0.33賴氨酸。

24)根據(jù)23)所述的方法，其中，所述格拉默包含約15至約100個氨基酸。

25)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，所述藥物組合物包含劑量范圍為約20至約750mg的格拉默的藥用鹽。

26)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含藥用可生物降解或不可生物降解載體。

27)根據(jù)26)所述的方法，其中，所述載體選自由plga、pla、pga、聚己內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、聚原酸酯、聚鏈烷酸酐、明膠、膠原、氧化纖維素、和聚磷腈組成的組。

28)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，所述藥物組合物具有通過水包油包水雙重乳化工藝制備的微顆粒的形式。

29)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，所述藥物組合物包含：內(nèi)部水相，所述內(nèi)部水相包含治療有效量的格拉默的藥用鹽；水不混溶的聚合物相，所述水不混溶的聚合物相包含可生物降解或不可生物降解聚合物；以及外部水相。

30)根據(jù)29)所述的方法，其中，所述水不混溶的聚合物相包含選自pla和plga的可生物降解聚合物。

31)根據(jù)29)所述的方法，其中，所述外部水相包含表面活性劑，所述表面活性劑選自聚乙烯醇(pva)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物和纖維素酯。

32)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，以每周一次至每6個月一次的給藥時間表進(jìn)行所述給予或所述植入步驟。

33)根據(jù)32)所述的方法，其中，所述給藥時間表是每2周一次至每月一次。

34)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，所述藥物組合物具有以下形式：可生物降解微球體、不可生物降解微球體、任何適宜幾何形狀的植入物、可植入棒、可植入膠囊、或可植入環(huán)、延長釋放凝膠或易侵蝕基質(zhì)。

35)根據(jù)19)或20)所述的方法，其中，相對于市售每日注射劑型，所述藥物組合物提供相同或更好的療效，在局部和/或全身水平副作用的發(fā)生率降低和副作用的嚴(yán)重性降低。

36)根據(jù)35)所述的方法，其中，與大致相同劑量的醋酸格拉默的立即釋放劑型相比，所述藥物組合物提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

37)適用于植入對其需要的個體的儲藥形式的格拉默的藥用鹽用于治療多發(fā)性硬化癥的應(yīng)用。

38)根據(jù)37)所述的可植入儲藥的應(yīng)用，用于提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

39)根據(jù)37)至38)中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述格拉默的藥用鹽是醋酸格拉默。

40)一種儲藥形式的格拉默的藥用鹽，適合用于治療多發(fā)性硬化癥。

41)一種儲藥形式的格拉默的藥用鹽，適合用于提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

根據(jù)下文給出的詳細(xì)描述，本發(fā)明的另外的實(shí)施方式和應(yīng)用的全部范圍將是顯而易見的。然而，應(yīng)當(dāng)明了，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例，雖然指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，僅是說明性的，因?yàn)閷τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說，根據(jù)這種詳細(xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和改進(jìn)將是顯而易見的。

附圖說明

圖1.在pbs中并在37℃下，醋酸格拉默自plga微顆粒制劑mpg-02-07的釋放。表示的數(shù)據(jù)被歸一化到存儲在相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液。

圖2.在pbs中并在37℃下，醋酸格拉默自plga微顆粒制劑mpg-05r、08-11和格拉默的生育酚琥珀酸鹽(1:1)的釋放。表示的數(shù)據(jù)被歸一化到存儲在相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液。

圖3.在pbs中并在37℃下，醋酸格拉默自plga微顆粒制劑mpg-12–15的釋放。表示的數(shù)據(jù)被歸一化到存儲在相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液。

圖4.在體外在pbs中并在37℃、ph7.4下，醋酸格拉默自plga微顆粒制劑mpg-14su-1和mpg-15su-1的釋放。

圖5.在體外在pbs中并在37℃、ph7.4下，醋酸格拉默自plga微顆粒制劑mpg-14su-2和mpg-15su-2的釋放。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了格拉默的藥用鹽(優(yōu)選醋酸格拉默)的長效胃腸道外藥物制劑，相比于每天注射，其可以提供相同或更好的療效，因而導(dǎo)致改善的患者依從性。除提供相同療效以外，長效注射劑或植入物還可以降低起源于頻繁注射的格拉默副作用(局部和/或全身)。

根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了長效胃腸道外藥物組合物，該組合物包含治療有效量的醋酸格拉默或格拉默的任何其它藥用鹽。如在本文中所使用的，術(shù)語“胃腸道外”是指途徑，其選自皮下(sc)、靜脈內(nèi)(iv)、肌內(nèi)(im)、皮內(nèi)(id)、腹腔內(nèi)(ip)等途徑。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。如在本文中所使用的，術(shù)語"治療有效量"用來限定共聚物的量，其將實(shí)現(xiàn)緩和多發(fā)性硬化癥的癥狀的目標(biāo)。適宜劑量包括但不限于每劑型20-750mg。然而，應(yīng)當(dāng)明了，給予的共聚物的量將由醫(yī)生根據(jù)各種參數(shù)來確定，包括所選的給予途徑、年齡、體重、和患者癥狀的嚴(yán)重性。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式，至少一種共聚物的治療有效量為約1mg至約500mg/天?？商鎿Q地，至少一種共聚物的上述治療有效量為約20mg至約100mg/天。

在另一個方面，本發(fā)明提供了長效藥物組合物，該組合物包含治療有效量的儲藥形式的醋酸格拉默或格拉默的任何其它藥用鹽，其適用于在醫(yī)療上可接受的位置給予對其需要的主體。如在本文中所使用的，術(shù)語“長效”是指一種組合物提供格拉默鹽到主體的一般全身循環(huán)或到主體的局部作用部位的長期、持續(xù)或延長釋放。此術(shù)語可以進(jìn)一步指一種組合物提供格拉默鹽在主體中的長期、持續(xù)或延長的作用持續(xù)時間(藥代動力學(xué))。尤其是，本發(fā)明的長效藥物組合物提供了每周一次到每6個月一次的給藥方案。根據(jù)目前更優(yōu)選的實(shí)施方式，給藥方案是一周一次、每月兩次(大約每兩周一次)到每月一次。取決于所需要的作用的持續(xù)時間，本發(fā)明的各儲藥或可植入裝置將通常包含約20至750mg的活性組分，設(shè)計成經(jīng)兩周至數(shù)月時間范圍加以釋放。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的儲藥制劑包括但不限于：格拉默或其藥用鹽在水、油或蠟相中的懸浮體；格拉默或其藥用鹽的不易溶解的聚合物電解質(zhì)復(fù)合物(polyelectrolytecomplexes)；基于水混溶性溶劑與格拉默或其藥用鹽的組合的“原位”凝膠形成基質(zhì)；以及結(jié)合有格拉默或其藥用鹽的可生物降解聚合物微顆粒。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。尤其是，本發(fā)明的組合物具有可注射微顆粒的形式，其中格拉默或其藥用鹽被截留在可生物降解或不可生物降解載體中。本發(fā)明的微顆粒組合物可以包含水包油包水雙重乳液。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，微顆粒組合物包含：內(nèi)部水相，其包含格拉默或其任何藥用鹽；油相或水不混溶相，其包含可生物降解或不可生物降解聚合物；以及外部水相。外部水相可以進(jìn)一步包含表面活性劑，優(yōu)選聚乙烯醇(pva)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物或纖維素酯。在本文中可以互換使用術(shù)語“油相”和“水不混溶相”。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過將長效藥物組合物胃腸道外給予對其需要的主體治療多發(fā)性硬化癥的方法，該長效藥物組合物包含治療有效量的醋酸格拉默或格拉默的任何其它藥用鹽。本發(fā)明的范圍內(nèi)的是治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法將儲藥形式的醋酸格拉默或格拉默的任何其它藥用鹽給予對其需要的個體。如在本文中所使用的，術(shù)語“治療”是指在多發(fā)性硬化癥的發(fā)作以后癥狀的抑制或緩和。在多發(fā)性硬化癥的發(fā)作以后的常見癥狀包括但不限于視力的降低或喪失、跌跌撞撞和不平衡的步態(tài)、言語不清、以及尿頻和尿失禁。此外，多發(fā)性硬化癥可以引起心境變化和抑郁、肌肉痙攣和嚴(yán)重癱瘓。藥物所給予的"主體"是哺乳動物，優(yōu)選但不限于人。如在本文中所使用的，術(shù)語“多發(fā)性硬化癥”是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫病，其伴隨上述一種或多種癥狀。

如在本文中所使用的，術(shù)語“醋酸格拉默”是指以前稱為共聚物1的化合物，其以商標(biāo)名稱出售并且由合成多肽的醋酸鹽組成，包含4種天然存在的氨基酸：l-谷氨酸、l-丙氨酸、l-酪氨酸、和l-賴氨酸，平均摩爾分?jǐn)?shù)分別為0.141、0.427、0.095、和0.338。在中醋酸格拉默的平均分子量是4,700-11,000道爾頓(fda標(biāo)注)以及氨基酸的數(shù)目范圍為約15至約100個氨基酸。該術(shù)語還指化合物的化學(xué)衍生物和類似物。通常，該化合物如在以下任何一項(xiàng)美國專利號中所述的來制備和表征：5,981,589、6,054,430、6,342,476、6,362,161、6,620,847、和6,939,539，每個上述專利的全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。

在一些實(shí)施方式中，組合物可以包含格拉默的任何其它藥用鹽，包括但不限于硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、醋酸鹽、硝酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、癸酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、生育酚琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯基醋酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、β-羥基丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙烷磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、扁桃酸鹽以及類似鹽。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何程序來制備共聚物。例如，可以在縮合條件下利用在溶液中的所期望摩爾比率的氨基酸、或通過固相合成程序，來制備共聚物?？s合條件包括適當(dāng)溫度、ph、和溶劑條件，用于縮合一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基以形成肽鍵?？s合劑，例如，二環(huán)己基碳二亞胺，可以用來促進(jìn)肽鍵的形成。

保護(hù)基團(tuán)可以用來保護(hù)官能團(tuán)，如側(cè)鏈部分和一些氨基或羧基避免不希望的副反應(yīng)。在美國專利號3,849,550(其全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)中披露的方法可以用于制備本發(fā)明的共聚物。例如，在環(huán)境溫度下在無水二氧雜環(huán)己烷中并用二乙胺作為引發(fā)劑，來聚合酪氨酸的n-羧基酸酐、丙氨酸、γ-芐基谷氨酸和n,ε-三氟乙?；?賴氨酸。可以通過在冰醋酸中的溴化氫來解封谷氨酸的γ-羧基。通過1摩爾哌啶來從賴氨酸除去三氟乙?；１绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易明了，該方法可以加以調(diào)節(jié)以制備包含所期望的氨基酸的肽和多肽，即，在共聚物1中四種氨基酸中的三種，其中通過選擇性地消除涉及谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、或賴氨酸的任何一種的反應(yīng)。美國專利號6,620,847、6,362,161、6,342,476、6,054,430、6,048,898和5,981,589(其全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)披露了用于制備醋酸格拉默(cop-1)的改進(jìn)方法。對于本申請的目的來說，術(shù)語“環(huán)境溫度”和“室溫”通常是指約20℃至約26℃的溫度。

可以在多肽合成期間或在已制備聚合物以后來調(diào)節(jié)共聚物的分子量。為了在多肽合成期間調(diào)節(jié)分子量，調(diào)節(jié)合成條件或氨基酸的量，使得當(dāng)多肽達(dá)到近似所期望的長度時停止合成。在合成以后，可以通過任何可獲得的尺寸選擇程序來獲得具有所期望的分子量的多肽，如用分子量分級柱(molecularweightsizingcolumn)或凝膠對多肽進(jìn)行的層析法，以及所期望的分子量范圍的收集。還可以部分地水解多肽以除去高分子量物質(zhì)，例如，通過酸或酶水解，然后加以純化以除去酸或酶。

在一種實(shí)施方式中，可以通過一種方法來制備具有所期望的分子量的共聚物，該方法包括反應(yīng)受保護(hù)多肽和氫溴酸以形成具有所期望的分子量分布的三氟乙?；?多肽。在由一種或多種測試反應(yīng)預(yù)先確定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)一定時間。在測試反應(yīng)期間，變化時間和溫度，并確定給定批的測試多肽的分子量范圍。為該批多肽提供最佳分子量范圍的測試條件用于上述批。因此，可以通過一種方法來制備具有所期望的分子量分布的三氟乙?；?多肽，該方法包括在由測試反應(yīng)預(yù)先確定的溫度下反應(yīng)受保護(hù)多肽和氫溴酸一定時間。然后用哌啶水溶液進(jìn)一步處理具有所期望的分子量分布的三氟乙?；?多肽，以形成具有所期望的分子量的去保護(hù)多肽。

在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，在約20-28℃的溫度下，使來自給定批的受保護(hù)多肽的測試樣品和氫溴酸反應(yīng)約10-50小時。通過運(yùn)行若干測試反應(yīng)來確定用于該批的最佳條件。例如，在一種實(shí)施方式中，在約26℃的溫度下，使受保護(hù)多肽和氫溴酸反應(yīng)約17小時。

在某些實(shí)施方式中，劑型包括但不限于可生物降解可注射儲藥系統(tǒng)(depotsystem)如，基于plga的可注射儲藥系統(tǒng)、基于非plga的可注射儲藥系統(tǒng)、和可注射可生物降解凝膠或分散體。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。如在本文中所使用的，術(shù)語“可生物降解”是指這樣的成分，其隨著時間的推移在其表面會發(fā)生侵蝕或降解，這至少部分地起因于與存在于周圍組織液中的物質(zhì)的接觸，或通過細(xì)胞作用。尤其是，可生物降解成分是聚合物如但不限于基于乳酸的聚合物如聚丙交酯例如聚(d,l-丙交酯)即pla；基于乙醇酸的聚合物如聚乙交酯(pga)例如來自durect的聚(d,l-丙交酯-乙交酯)即plga(來自boehringer的rg-504、rg-502、rg-504h、rg-502h、rg-504s、rg-502s，來自durect的)；聚己內(nèi)酯如聚(e-己內(nèi)酯)即pcl(來自durect的)；聚酐；聚(癸二酸)sa；聚(蓖麻油酸)ra；聚(富馬酸)，fa；聚(脂肪酸二聚體)，fad；聚(對苯二甲酸)，ta；聚(間苯二甲酸)，ipa；聚(對{羧基苯氧基}甲烷)，cpm；聚(對{羧基苯氧基}丙烷)，cpp；聚(對{羧基苯氧基}己烷)cph；聚胺、聚氨酯、聚酯酰胺、聚原酸酯{chdm：順式/反式-環(huán)己基二甲醇，hd:l,6-己二醇，detou：(3,9-二亞乙基-2,4,8,10-四氧雜螺十一烷)}；聚二氧雜環(huán)己酮；聚羥基丁酸酯；聚草酸亞烷基酯(polyalkyleneoxalate)；聚酰胺；聚酯酰胺；聚氨酯；聚縮醛；聚縮酮；聚碳酸酯；聚原碳酸酯；聚硅氧烷；聚磷腈；琥珀酸酯；透明質(zhì)酸；聚(蘋果酸)；聚(氨基酸)；聚羥基戊酸酯；聚琥珀酸亞烷基酯(polyalkylenesuccinates)；聚乙烯吡咯烷酮；聚苯乙烯；合成纖維素酯；聚丙烯酸；聚丁酸；三嵌段共聚物(plga-peg-plga)、三嵌段共聚物(peg-plga-peg)、聚(n-異丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(環(huán)氧乙烷)-聚(環(huán)氧丙烷)-聚(環(huán)氧乙烷)三嵌段共聚物(peo-ppo-peo)、聚戊酸；聚乙二醇；聚羥基烷基纖維素；甲殼質(zhì)(chitin)；殼聚糖；聚原酸酯和共聚物、三元共聚物；脂質(zhì)如膽固醇、卵磷脂；聚(谷氨酸-谷氨酸乙酯)及類似物、或它們的混合物。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含可生物降解聚合物，其選自但不限于plga、pla、pga、聚己內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、聚原酸酯、聚鏈烷酸酐、明膠、膠原、氧化纖維素、聚磷腈等。每個可能性表示單獨(dú)的實(shí)施方式。

目前優(yōu)選的可生物降解聚合物是基于乳酸的聚合物，更優(yōu)選聚丙交酯、或聚(d,l-丙交酯-乙交酯)即plga。優(yōu)選地，可生物降解聚合物的存在量為組合物的約10％至約98％w/w?；谌樗岬木酆衔锞哂?00:0至約0:100的乳酸與乙醇酸的單體配比，優(yōu)選100:0至約10:90，并具有約1,000至200,000道爾頓的平均分子量。然而，應(yīng)當(dāng)明了，可生物降解聚合物的量是由參數(shù)如應(yīng)用的持續(xù)時間等來確定。

本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種藥用賦形劑，其選自但不限于輔助表面活性劑、溶劑/共溶劑、水不混溶性溶劑、水、水混溶性溶劑、油性成分、親水性溶劑、乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、防泡劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑、滲透劑、通道形成劑、滲透調(diào)節(jié)劑、或本領(lǐng)域已知的任何其它賦形劑。適宜的輔助表面活性劑包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(稱作“泊洛沙姆”)、聚甘油脂肪酸酯如單月桂酸十甘油酯(decaglycerylmonolaurate)和單肉豆寇酸十甘油酯(decaglycerylmonomyristate)、山梨聚糖脂肪酸酯如脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨坦脂肪酸酯如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫)、聚乙二醇脂肪酸酯如聚氧乙烯單硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚如聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯蓖麻油和硬化蓖麻油如聚氧乙烯硬化蓖麻油等或它們的混合物。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。適宜溶劑/共溶劑包括但不限于醇、三乙酸甘油酯、二甲基異山梨醇、四氫呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、碳酸丙二酯、水、二甲基乙酰胺等或它們的混合物。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。適宜的防泡劑包括但不限于硅酮乳液或倍半油酸山梨聚糖。用來在本發(fā)明的組合物中防止或減少成分的惡化的適宜的穩(wěn)定劑包括但不限于抗氧化劑如甘氨酸、α-生育酚或抗壞血酸、bha、bht等或它們的混合物。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。適宜的張力調(diào)節(jié)劑包括但不限于甘露醇、氯化鈉、和葡萄糖。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。適宜的緩沖劑包括但不限于醋酸鹽、磷酸鹽、和檸檬酸鹽(具有適宜的陽離子)。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式來制備本發(fā)明的組合物。目前優(yōu)選的是將格拉默或其鹽共聚物加入膠體遞送系統(tǒng)，例如，可生物降解微顆粒，從而便于借助于通過顆粒的聚合物壁的擴(kuò)散和通過在體內(nèi)的水介質(zhì)或生物流體中的聚合物降解來實(shí)現(xiàn)釋放遲緩?？梢酝ㄟ^稱作“雙重乳化”的工藝并以可注射微顆粒的形式來制備本發(fā)明的組合物。簡要地，將水溶性共聚物的濃縮溶液分散于可生物降解或不可生物降解聚合物在水不混溶性揮發(fā)性有機(jī)溶劑(例如二氯甲烷、氯仿等)中的溶液。然后將如此獲得的“油包水”(w/o)乳液分散在包含表面活性劑(例如聚乙烯醇-pva、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物、纖維素酯等)的連續(xù)外部水相中，以形成“水包油包水(w/o/w)雙重乳液”小滴。在蒸發(fā)有機(jī)溶劑以后，固化微顆粒并通過過濾或離心加以收集。用純化水洗滌收集的微顆粒(mp)以消除大多數(shù)表面活性劑和非結(jié)合肽，然后再次離心。在沒有添加劑或添加冷凍保護(hù)劑(甘露醇)的條件下，收集和冷凍干燥經(jīng)洗滌的mp，以促進(jìn)它們隨后的重建。

可以通過各種參數(shù)來確定“水包油包水(w/o/w)雙重乳液”的顆粒尺寸，包括但不限于在此步驟中外加力的量、混合速度、表面活性劑類型和濃度等。適宜的顆粒尺寸為約1至100μm。

本發(fā)明的儲藥系統(tǒng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何形式。適宜的形式包括但不限于可生物降解或不可生物降解微球體、可植入棒、可植入膠囊、和可植入環(huán)。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。另外包括延長釋放凝膠儲藥和易侵蝕基質(zhì)。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。適宜的可植入系統(tǒng)描述于例如us2008/0063687，其全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。如在本領(lǐng)域已知的，可以利用適宜的微型擠出機(jī)如那些例如在http://www.randcastle.com/prodinfo.html中描述的微型擠出機(jī)，來制備可植入棒。

根據(jù)本發(fā)明的原則，相對于市售每日注射劑型，本發(fā)明的長效藥物組合物可以提供相同或更好的療效，并在局部和/或全身水平下，具有降低的副作用的發(fā)生率和降低的副作用的嚴(yán)重性。在一些實(shí)施方式中，和大致相同劑量的醋酸格拉默的立即釋放制劑相比，本發(fā)明的組合物可以提供格拉默在主體中的延長釋放或延長作用。

本發(fā)明包括醋酸格拉默或格拉默的任何其它藥用鹽與至少一種其它活性劑的聯(lián)合療法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的活性劑包括但不限于干擾素，例如聚乙二醇化或非聚乙二醇化α-干擾素、或β-干擾素，例如干擾素β-1a或干擾素β-1b、或τ-干擾素；具有可選的抗增生/抗腫瘤活性的免疫抑制劑，例如米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、環(huán)磷酰胺、或類固醇，例如甲潑尼龍、潑尼松或地塞米松，或類固醇分泌劑，例如acth；腺苷脫氨酶抑制劑，例如克拉屈濱(cladribine)；相對于各種t細(xì)胞表面標(biāo)記的iv免疫球蛋白g(例如如在neurology,1998,may50(5):1273-81中所披露的)單克隆抗體，例如那他珠單抗(natalizumab)或阿侖單抗(alemtuzumab)；th2促進(jìn)細(xì)胞因子，例如il-4、il-10，或抑制th1促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)的化合物，例如磷酸二酯酶抑制劑，例如己酮可可堿(pentoxifylline)；解痙劑，其包括巴氯芬(baclofen)、地西泮(diazepam)、吡拉西坦、丹曲林(dantrolene)、拉莫三嗪(lamotrigine)、利魯唑(rifluzole)、替扎尼定、可樂定、β阻滯劑、賽庚啶、奧芬那君或大麻素；ampa谷氨酸受體拮抗劑，例如2,3-二羥基-6-硝基-7-氨磺酰苯并(f)喹喔啉、[1,2,3,4,-四氫-7-嗎啉基-2,3-二氧代-6-(三氟甲基)喹喔啉-i-基]甲基膦酸酯、1-(4-氨基苯基)-4-甲基-7,8-亞甲基-二氧-5h-2,3-苯并二吖庚因(1-(4-aminophenyl)-4-methyl-7,8-methylene-dioxy-5h-2,3-benzodiazepine)、或(-)1-(4-氨基苯基)-4-甲基-7,8-亞甲基-二氧-4,5-二氫-3-甲基氨基甲酰基-2,3-苯并二吖庚因；vcam-1表達(dá)的抑制劑或它的配體的拮抗劑，例如α4βl整聯(lián)蛋白vla-4和/或α-4-β-7整聯(lián)蛋白的拮抗劑，例如那他珠單抗抗巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(anti-mif)；xii)組織蛋白酶s抑制劑；xiii)mtor抑制劑。每個可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)的實(shí)施方式。目前優(yōu)選的一種其它活性劑是fty720(2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1,3-二醇；芬戈莫德)，其屬于免疫抑制劑。

以下實(shí)施例用來更充分說明本發(fā)明的某些實(shí)施方式。然而，決不應(yīng)將它們看作是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)計本文披露的原則的許多變化和改進(jìn)而不偏離本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1：一般制備方法

基于plga的可注射長效顆粒

通過溶劑萃取/蒸發(fā)方法(單乳液)來制備微顆粒。將包含250mg的plga和200mg醋酸格拉默的50:50的二氯甲烷/乙醇溶液慢慢倒入包含2％pva的水溶液(200ml)并在25℃下利用機(jī)械攪拌器(300rpm)加以乳化。在攪拌(100rpm)下蒸發(fā)有機(jī)溶劑2h。通過離心來收集如此形成的微顆粒并用蒸餾水洗滌以除去過多的乳化劑。然后冷凍干燥最終懸浮液以獲得細(xì)粉。

基于聚己內(nèi)酯的可注射儲藥(depot)顆粒

通過溶劑萃取/蒸發(fā)方法(單乳液)來制備微顆粒。將包含500mg聚己內(nèi)酯和200mg醋酸格拉默的70:30的二氯甲烷/丙酮溶液慢慢倒入包含2％pva、1％吐溫80的水溶液(200ml)，然后在25℃下利用機(jī)械攪拌器(500rpm)加以乳化。在攪拌(300rpm)下蒸發(fā)有機(jī)溶劑4h。通過離心來收集形成的微顆粒并用蒸餾水洗滌，以除去過多的乳化劑。然后冷凍干燥最終懸浮液以獲得細(xì)粉。

基于plga的植入棒

通過溶劑萃取/蒸發(fā)方法來制備長度為20mm和直徑為2mm的基于plga的可生物降解棒狀植入物。將包含250mg的plga和200mg醋酸格拉默的50:50的二氯甲烷/乙醇溶液慢慢倒入特制的棒狀模具。在室溫的真空烘箱中蒸發(fā)有機(jī)溶劑12小時?？商鎿Q地，通過在85-90℃下擠出250mg的plga和200mg格拉默的混合物來制備棒狀植入物，其中利用模具直徑為0.8或1.0mm的螺桿式擠出機(jī)(microtruderrancastlercp-0250或類似擠出機(jī))。

實(shí)施例2：分析方法–醋酸格拉默的測定

設(shè)備

分光光度計

分析天平，能夠精確地稱量到0.01mg

材料和試劑

醋酸格拉默83％，作為參考標(biāo)準(zhǔn)

2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs，苦基磺酸(picrylsulfonicacid)，170.5mm)，5％在meoh中

0.1m硼酸鹽緩沖液ph9.3(十水四硼酸鈉mw381.37)

純化水

0.5、1.0、2.0和7.0ml的容量吸移管

各種各樣的玻璃器皿。

制備

格拉默儲備溶液400μg/ml的制備

將4.8mg醋酸格拉默(效力83％，作為參考標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ))稱量到10ml容量瓶。添加大約7ml的0.1m硼酸鹽緩沖液以在超聲波浴中溶解醋酸格拉默。用0.1m硼酸鹽緩沖液進(jìn)一步稀釋溶液以獲得格拉默儲備溶液400μg/ml(作為基礎(chǔ))。

0.25％tnbs工作溶液的制備

在使用前，用水(20倍；例如50μl和950μl水)稀釋tnbs的5％儲備溶液，以獲得0.25％tnbs工作溶液。

校準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)制備

按照表1來制備8個格拉默校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液(cstd；各自4ml)。

表1.醋酸格拉默的標(biāo)準(zhǔn)溶液

光密度測量

將1.0ml的各種格拉默校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品(兩份)和試劑空白(0.1m硼酸鹽緩沖液)轉(zhuǎn)移到1.5ml聚丙烯離心管，其中添加50μl的0.25％tnbs工作溶液。充分混合溶液并將溶液保持在室溫下30分鐘。在420nm和700nm處讀每種獲得的溶液的光密度，并計算這些密度的差異，以避免起因于膠體系統(tǒng)的光散射的誤差。計算了所選濃度范圍的校準(zhǔn)曲線。

接受標(biāo)準(zhǔn)

按照以下公式的計算，重復(fù)樣品制備的結(jié)果之間的差異是nmt5％：

式中，rspl1是獲自樣品1的結(jié)果以及rspl2是獲自樣品2的結(jié)果。

實(shí)施例3：加載有醋酸格拉默的plga微顆粒的制備

外部(連續(xù))水相：在純化水中的30ml的0.75％nacl溶液，進(jìn)一步包含0.5％部分地水解(87-89％)的聚乙烯醇(pva)作為表面活性劑，0.2％聚山梨酯-80(吐溫-80)用于mpg-10以及2％pva用于空白mp制劑。

內(nèi)部水相(用于肽溶液)：150-200μl純化水/25-30mg醋酸格拉默。利用超聲波浴來將醋酸格拉默溶解于水。

有機(jī)聚合物溶液(油相)：在2-5ml二氯甲烷中的165-300mg的plga?？蛇x地，將反離子進(jìn)一步溶解或分散于有機(jī)相。

制備程序

油包水(w/o)乳液制備：在試管中，直接混合包含溶解的醋酸格拉默的內(nèi)部水相和包含在ch2cl2中的plga溶液的油相。充分搖動混合物并用超聲波壓頭(鈦尖端，最大功率為120瓦，工作功率為10-15％，3-5個循環(huán)，每個循環(huán)為5秒)加以處理?？蛇x地，利用冰或冰水來進(jìn)行冷卻以避免二氯甲烷的沸騰。

雙重乳液(w/o/w)制備：在各種速度下，用高剪切混合器(小型混合器，vdi-12，軸直徑10mm，和較大混合器，omni-1100，軸直徑18mm)進(jìn)一步處理如此獲得的在聚合物plga有機(jī)溶液中的醋酸格拉默溶液的w/o乳液30-120秒。

溶劑消除：將具有如此形成的雙重乳液的敞口燒杯放置在磁板攪拌器上并在室溫下在通風(fēng)櫥中攪拌3-4小時，直到蒸發(fā)所有二氯甲烷并且微顆粒已固化。

微顆粒的離心：在2000-5000g下離心固化微顆粒的懸浮液10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到分開的容器并分析醋酸格拉默含量，以估算肽摻入和結(jié)合。

微顆粒的洗滌：利用漩渦和超聲波浴將按照上述程序的沉降的微顆粒懸浮在10ml純化水中，然后搖晃或聲處理2-3分鐘。在2000-5000g下再次離心分離微顆粒的懸浮液10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到分開的容器并分析醋酸格拉默含量。

冷凍干燥：將微顆粒的洗滌沉淀物再懸浮于3-5ml純化水或5％甘露醇，轉(zhuǎn)移到10ml預(yù)先稱重的玻璃小瓶，利用在-37至-43℃下的冷凍干燥板裝置加以冷凍，然后冷凍干燥(在-20℃和真空0.05巴下主要干燥16-48小時，在+20℃和0.025巴下最后干燥12-16小時)。在冷凍干燥以后稱量小瓶，用溴化丁基橡膠瓶塞封閉，然后在冰箱的儲存條件下存放直到使用。

顆粒尺寸的估算：利用光場和相襯顯微術(shù)(leutzorthoplan^tm，德國)來評估微顆粒的顆粒尺寸，其中物鏡為40x和10x，以及臺式測微計的量程為1-1000μm。

利用包含0.75％氯化鈉的水相來制備所有微顆粒制劑，以增加外部滲透壓以及改善水溶性帶電荷藥物的摻入。借助于2％pva作為表面活性劑來獲得空白微顆粒(第一個實(shí)驗(yàn))，而對于所有加載肽的制劑的制備則使用0.5％pva。

制備工藝的組成和參數(shù)列于表2-5。

表2.用于醋酸格拉默(ga)的緩釋的plga微顆粒(制劑1-4)

將來自德國ika的具有定子的較小直徑(軸12mm)和速度范圍8-30,000rpm的vwrvdi-12高剪切混合器設(shè)定在#5位置(大約24,000rpm)。在2％pva相中，在二氯甲烷中的大約10％plga溶液的短期處理(30秒)用來制備空白mp樣品，其導(dǎo)致具有相對較寬尺寸分布(10-50μm)的光滑球形微顆粒。由于發(fā)泡，在表面活性劑的較低濃度下進(jìn)行進(jìn)一步處理。還延長均化時間(1或2分鐘處理)以獲得更窄的尺寸分布。

由于在雙重乳液中內(nèi)部水相的存在，所以，當(dāng)在光學(xué)顯微鏡下觀測時，用格拉默肽制備的所有微顆粒在mp表面上或在顆粒內(nèi)具有可見夾雜物和孔隙標(biāo)志。

表3.用于緩釋醋酸格拉默(ga)的plga微顆粒(制劑5-7)

離心形成的加載有醋酸格拉默的微顆粒，將顆粒重新懸浮于純化水，洗滌并重復(fù)離心分離。分析上清液和(在一些情況下)洗滌水的醋酸格拉默含量。將經(jīng)離心的沉淀物重新懸浮于純化水或5％甘露醇溶液，然后冷凍干燥。

表4：用于緩釋醋酸格拉默(ga)的plga微顆粒(制劑05r、08-011和格拉默的生育酚琥珀酸鹽)

借助于超聲波壓頭60秒(6x10秒)和冰冷卻，通過將格拉默的水溶液懸浮于包含先前溶解的等摩爾量的生育酚琥珀酸的二氯甲烷，來制備生育酚琥珀酸(mw530，一個cooh當(dāng)量，265道爾頓)和醋酸格拉默(mw4,700-11,000，一個nh2當(dāng)量，～693道爾頓)的等摩爾復(fù)合物(鹽)的制劑。在蒸發(fā)有機(jī)溶劑和水以后，收集如此形成的水不溶性產(chǎn)物，用純化水和用干乙醇洗滌，然后用于進(jìn)一步研究而沒有另外的純化。

表5.用于緩釋醋酸格拉默(ga)的plga微顆粒(制劑mpg-12-15)

冷凍干燥

在離心和洗滌以后，在沉降物再懸浮液于純化水以后“原樣”地，或在一些情況下借助于添加冷凍保護(hù)劑(將沉降物重新懸浮于5％甘露醇溶液)，來冷凍干燥微顆粒制劑。利用冷凍干燥器板在-37至-43℃下冷凍樣品1小時，然后在0.050毫巴和-20℃下利用冷凍干燥器“alpha2-4lsc”(christ，德國)冷凍干燥24-48小時，最后在0.025毫巴和+20℃下干燥10-16小時。在兩種再懸浮程序中，均可以容易地重建冷凍干燥產(chǎn)物。和沒有冷凍保護(hù)劑的制劑相比，甘露醇的使用導(dǎo)致容易重建的產(chǎn)物，但這樣的組成包含顯著量的壓載材料，因而需要更加復(fù)雜的計算來確定活性物質(zhì)的真實(shí)濃度。

實(shí)施例4：來自plga微顆粒的醋酸格拉默的體外釋放

設(shè)備

20ml小瓶

多點(diǎn)磁性攪拌器

恒溫箱

吸移管

uv-vis分光光度計shimadzu1601

試劑和塑料/玻璃器皿

試驗(yàn)樣品

制劑mpg-02、03、04、05、05r、06、07、12、13、14、和15-50mg干燥的冷凍干燥微顆粒。

制劑mpg-08、09、10、和11：對應(yīng)于50mg干燥的微顆粒的量，用5％甘露醇加以冷凍干燥。

對照醋酸格拉默溶液20-50μg/ml(作為基礎(chǔ))，在具有0.05％疊氮化鈉的pbs中)

溫度：37℃

為了評估摻入的醋酸格拉默自加載有醋酸格拉默的可生物降解plga微顆粒(各種制劑)的釋放，已采用了以下工藝。

工藝描述：將20ml的pbs(0.01m磷酸鹽，0.05％nan3)ph7.4加入每個小瓶。將小瓶置于37℃下并用小磁體攪拌。在10,000g下離心600μl樣品5分鐘。將500μl上清轉(zhuǎn)移到1.5ml微管，接著添加500μl的0.1m硼酸鹽緩沖液(2倍稀釋)和50μl的tnbs。強(qiáng)烈地混合獲得的組合物并保持在工作臺上30分鐘。利用tnbs方法進(jìn)行分析。

將用500μl新鮮pbs(含有nan3)重新懸浮的剩余的沉淀顆粒返回到小瓶。在另外的釋放工藝(對于每個時間點(diǎn)，2.5％)中，進(jìn)行醋酸格拉默的釋放量的正確計算。

利用裝備有多點(diǎn)磁性攪拌器的37℃的恒溫箱，在緊密封閉的20ml玻璃小瓶中，進(jìn)行摻入的醋酸格拉默的釋放。磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)(ph7.4)用作釋放介質(zhì)。

在10-32天期間，測試醋酸格拉默的釋放。

計算用于在1-200μg/ml范圍內(nèi)的校準(zhǔn)曲線的方程(shimadzuuv-1601)為：

od＝0.035+0.0132*c(r²＝0.9985)

式中od–光密度(在420和700nm處的差異)

c–醋酸格拉默基質(zhì)的濃度，μg/ml

制劑mpg01-mpg07的肽釋放的結(jié)果示于圖1。在制劑mpg-05中，其基于具有酸性端基(resomerrg502h)和沒有疏水性相反離子的低分子量plga聚合物，獲得摻入醋酸格拉默的最快釋放(1-10天，40％)。具有相對少量的生育酚琥珀酸作為相反離子(mpg-03)的中性聚合物rg502也呈現(xiàn)顯著釋放(2-12天，～30％)，但具有較低絕對釋放值。包含較高量相反離子的制劑顯示藥物釋放的抑制。不受限于任何理論或作用機(jī)制，這可以歸因于所形成的復(fù)合物的高疏水性。另外，包含dcp或dmpg的微顆粒的制備伴隨聚集體的形成和較寬的顆粒尺寸分布。

代替vdi-12(12mm軸)，更大和更強(qiáng)大高剪切混合器omniglh(軸直徑20mm，5000-30000rpm)的使用導(dǎo)致微顆粒(制劑8-11)的尺寸的顯著下降和增加的表面平滑度。增加有機(jī)溶劑的量(mpg-02)會減少肽摻入微顆粒。不受限于任何理論或作用機(jī)制，這可能歸因于中間o/w/o雙重乳化小滴尺寸的增加。類似地，使用聚山梨酯作為非離子型表面活性劑還負(fù)面影響藥物加載(mpg-10，具有0.2％吐溫-80)。和沒有相反離子的制劑(mpg-05、mpg-05r)相比，疏水性相反離子(生育酚琥珀酸、雙肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg、雙十六烷基磷酸酯dcp)的添加會顯著阻礙自聚合物微顆粒的肽釋放。不受限于任何理論或作用機(jī)制，疏水性相反離子的添加可以提供具有妥協(xié)特性的微顆粒(mpg-06)。

和plga的分子量相比，所使用的聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示對釋放性能的更大影響。resomersrg502h和rg502(mw約17,000道爾頓)具有非常類似的擴(kuò)散系數(shù)，但確定所包括肽自聚合物基質(zhì)的釋放的主要因素是在醋酸格拉默的正電荷的lys部分和在plga聚合物中的羧酸端基之間的多點(diǎn)離子相互作用。中性rg502甚至在有相反離子存在的條件下(mpg-02、03)也顯示較低的結(jié)合能力，而具有較高分子量的中性rg503則顯示更好結(jié)合但非常緩慢的釋放(mpg-10、11)。

對于這樣的小規(guī)模批次，自分別制備的相同制劑(mpg-05和mpg-05r)的重復(fù)釋放實(shí)驗(yàn)顯示合理的類似行為和良好的重現(xiàn)性。醋酸格拉默與rg502h的制劑顯示類似的爆發(fā)效應(yīng)(～30％)、良好的初始肽結(jié)合和快速的藥物釋放(圖2)。

生育酚琥珀酸(tocopherylsuccinate)的等摩爾復(fù)合物(鹽)的制劑具有高結(jié)合和極低的水溶性(～5μg/ml)。不受限于任何理論或作用機(jī)制，這可以起因于二酸(生育酚琥珀酸)和聚合物的聚胺分子的離子交聯(lián)。聚合物自在pbs中的這種鹽的釋放是極其緩慢的。對于聚合物微顆粒，當(dāng)生育酚琥珀酸摻入plga基質(zhì)時，僅部分的這種二酸可以相互作用于聚合物，并且為了完全釋放抑制，需要較高量的生育酚琥珀酸。所以，可以通過格拉默和plga的比例來調(diào)節(jié)釋放速率。所使用的有機(jī)溶劑的量也可以具有重要性(但在較低程度上)。

制劑12-15，其基于在藥物和聚合物之間具有不同比例的rg502h，表明，在控制最初的爆發(fā)效應(yīng)、結(jié)合水平和釋放速率方面上述比例起著重要的作用。plga和肽的量的調(diào)節(jié)以及疏水性相反離子(如生育酚琥珀酸)的添加便于制備具有高結(jié)合、低初始爆發(fā)和合理的釋放速率的微顆粒制劑(mpg-12–15)(圖3)。

實(shí)施例5：比例放大

醋酸格拉默微顆粒制劑的冷凍干燥樣品

mpg-14su-1–mpg-014的制劑，是利用更大的反應(yīng)容器和在低速下的更大的均化器(omniglh)來制備。

共計–13個小瓶；每個小瓶包含大約235mg冷凍干燥制劑，其中醋酸格拉默的總含量為～18.2mg/小瓶，等于～75μg/mg冷凍干燥制劑。

mpg-15su-1–mpg-015的制劑，是利用更大的反應(yīng)容器和在低速下的更大的均化器(omniglh)來制備。

共計–10個小瓶；每個小瓶飲食大約145mg冷凍干燥制劑，其中醋酸格拉默的總含量為～14.9mg/小瓶，等于～100μg/mg冷凍干燥制劑。

mpg-14su-2–mpg-014的制劑，是利用相同反應(yīng)容器、相同均化器(vdi12)和相同參數(shù)、并重復(fù)工藝若干次來制備。充分洗滌組合物以降低初始爆發(fā)。

共計–12個小瓶；每個小瓶包含大約88mg冷凍干燥制劑，其中醋酸格拉默的總含量為～6.3mg/小瓶，等于～72μg/mg冷凍干燥制劑。

mpg-15su-2–mpg-015的制劑，是利用相同反應(yīng)容器、相同均化器(vdi12)和相同參數(shù)、并重復(fù)工藝若干次來制備。充分洗滌組合物以降低初始爆發(fā)。

共計–12個小瓶；每個小瓶包含大約55mg冷凍干燥制劑，其中醋酸格拉默的總含量為～5.6mg/小瓶，等于～100μg/mg冷凍干燥制劑。

將所有冷凍干燥樣品存儲于+4℃的冰箱，并在使用前加以重建。

制劑和稀釋劑(葡萄糖溶液)之間的比例為至少1:5，優(yōu)選1:10和更高。在給予重建樣品以前，進(jìn)行劇烈搖晃。這些制劑的釋放曲線示于圖4和5。

因而，證明了醋酸格拉默的高度水溶性肽摻入可生物降解聚合物微顆粒。微顆粒顯示聚合物的良好結(jié)合、合理的藥物加載和降低的初始釋放爆發(fā)，其可以通過采用不同的組成和制備工藝來調(diào)節(jié)。在37℃下，在攪拌水介質(zhì)(磷酸鹽緩沖鹽水，ph7.4)中，制備自502h并加載有醋酸格拉默的plga微顆?？梢蕴峁饺腚牡捏w外釋放，其中釋放速率為3-5％/天，時間為10-15天。

實(shí)施例6：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)是一種炎性自身免疫性脫髓鞘病，其可以在實(shí)驗(yàn)動物中通過注射髓磷脂堿性蛋白來誘導(dǎo)。上述疾病已變成用來研究臨床和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性疾病的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。事?shí)上，許多文章(例如，abramskyet.al.,jneuroimmunol(1982)21和boltonetal.,jneurolsci.(1982)56147)注意到，在動物中的慢性復(fù)發(fā)eae和人類中的多發(fā)性硬化癥的相似性尤其牽涉eae用于研究自身免疫性脫髓鞘病如多發(fā)性硬化癥的價值。因此，eae試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀脕斫⒈景l(fā)明的制劑相對于多發(fā)性硬化癥的活性。按照以下程序來進(jìn)行上述測試。

在雌性lewis大鼠的腳掌中注射在完全弗氏佐劑中的12.5μg髓磷脂堿性蛋白(mbp)(制備自豚鼠脊髓)。以各種劑量，通過注射，將本發(fā)明的制劑給予實(shí)驗(yàn)動物，每周/兩周/月一次。將對照制劑給予某些其它實(shí)驗(yàn)動物。然后稱量動物并按照0至3的級別(0＝?jīng)]有變化；1＝弛緩性尾巴；2＝后肢無能；以及3＝髂腹間髂腹間麻痹/瀕死)每日評分eae的癥狀。如果達(dá)到3的評分，則處死動物。

實(shí)施例7：利用eae模型進(jìn)行體內(nèi)研究

為了確定本發(fā)明的制劑對ms的鼠模型的效應(yīng)，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(eae)。在eae免疫以前，用包含0.87％鈣和1ng的1,25-(oh)2d3(vitd)的純化膳食供養(yǎng)25-羥基維生素d3-1α-羥化酶敲除小鼠(1α-ohko)兩至三周。通過對6至10周齡小鼠皮下免疫200μg的相對于髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(mog35-55)的免疫顯性肽來誘導(dǎo)eae。

通過標(biāo)準(zhǔn)的9-芴基-甲氧基-羰基化學(xué)作用來合成肽。將肽溶解于包含4mg/ml熱滅活結(jié)核分枝桿菌h837a的弗氏完全佐劑(cfa；sigma)。

采用以下評分系統(tǒng)來每日檢查小鼠的eae的臨床體征：0，沒有體征；1，跛行尾巴；2，后肢無力；3，后肢麻痹；4，前肢麻痹；5，瀕死或死亡。

對于發(fā)展eae的臨床體征并且評分≥2的小鼠，通過注射，給予不同劑量的本發(fā)明的制劑加以治療，其中注射是每周/兩周/月一次。用安慰劑或用醋酸格拉默的gold標(biāo)準(zhǔn)方案[例如pnas,2005,vol.102,no.52,19045–19050]來治療對照組。然后稱量小鼠并每日評分eae的癥狀。利用對發(fā)生率的雙尾費(fèi)希爾恰當(dāng)概率實(shí)驗(yàn)和對所有其它測量結(jié)果的不成對t檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計分析。p<0.05的數(shù)值被認(rèn)為是統(tǒng)計顯著的。

雖然已特別描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以進(jìn)行許多變化和改進(jìn)。因而，本發(fā)明并不限于特別描述的實(shí)施方式，并且通過參考權(quán)利要求將可以更容易地明了本發(fā)明的范圍和構(gòu)想。