本發(fā)明涉及透皮微針陣列給藥設備技術領域，具體涉及一種負載脂肪褐變劑的微針貼片及其制備方法。

背景技術：

久坐的生活方式和過多攝入的高熱量食物助長了肥胖的日益流行。人類脂肪組織分為白色脂肪組織(whiteadiposetissue，wat)和棕色脂肪組織(brownadiposetissue，bat)。wat由幾乎沒有線粒體的大單房細胞組成，通過甘油三酯儲存能量；而bat則是由小多房細胞組成，細胞內含有大量線粒體，并線粒體內膜上的解偶聯(lián)蛋白1(uncouplingprotein1，ucp1)產熱來消耗能量。簡單而言，bat富含線粒體，可以自我“燃燒”脂肪，被稱為“好脂肪”；而wat缺乏線粒體，無法自主動用脂肪，被稱為“壞脂肪”。

脂肪細胞增生和脂肪細胞過度肥大產生的大量wat，過量的白色脂肪組織是導致如ii型糖尿病、高血壓、冠心病、中風和某些類型的癌癥(例如，結直腸癌)等疾病的重要因素。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年全球至少有280萬人死于肥胖引起的并發(fā)癥，全球約3580萬人因超重或肥胖引起健康問題。因此，預防和治療肥胖的需求日益增大。

研究者為尋求有效的抗肥胖藥物而付出了巨大的努力。截至目前，僅有少數(shù)藥物被fda批準可作為飲食和運動減肥外的輔助療法而進行銷售。目前治療肥胖藥物的作用機理主要為抑制食欲(lorcaserin，naltrexone和安非他酮)或減少脂肪的胃腸道吸收。一些化合物(如β3-adrenergicagonist,bonemorphogeneticprotein7,fibroblastgrowthfactor21,apelin等)已被證明可實現(xiàn)wat褐變，具有良好的預防和治療肥胖的效果。

然而，利用口服或靜脈注射等傳統(tǒng)給藥方式存在吸收差、易被血液稀釋及被血液中一些酶降解等問題。此外，這些常規(guī)給藥方式由于為全身給藥，所需劑量大，往往會產生全身性副作用或在非靶向器官產生積累。即便是fda批準使用的藥物依靠口服攝入也無可避免的會產生副作用。例如，lorcaserin可能會引起頭痛和抑郁；orlistat具有顯著的gi副作用。這導致一些曾允許銷售的治療肥胖藥物由于具有嚴重副作用而被撤回。例如，fen-phen藥物作為組合食欲抑制劑可能引起肺壓升高、產生心臟瓣膜問題。抑制食欲的藥物sibutramine可能會引發(fā)嚴重的心血管問題。

促進白色脂肪自我重塑使其轉變成棕色脂肪是治療肥胖的有效手段。以前人們僅僅將脂肪組織認為是存貯多余能量的倉庫，但現(xiàn)在科學家們已經公認脂肪是最大的內分泌器官，通過分泌多種信號分子(脂肪因子)和應對其他組織產生的各種代謝因素(如胰島素)在人體代謝中起著核心作用。肥胖不僅表現(xiàn)出異常的細胞因子，也是游離脂肪酸、炎癥細胞因子和活性氧等許多有害物質的主要來源。與白色脂肪組織不同的棕色脂肪組織可促進能量消耗，燃燒脂肪。雖然bat在成人中含量較低，但已證明wat中存在類棕色脂肪細胞(褐色細胞)，尤其是在占全身脂肪含量85％的皮下wat中這一現(xiàn)象尤其明顯。研究表明，白色脂肪細胞轉化為褐色細胞，可提高身體能量消耗。因此，促進白色脂肪自我重塑使其轉變成棕色脂肪(褐變，減少巨噬細胞浸潤，平衡脂肪細胞分化，增強血管化等)是治療肥胖的有效手段和新思路。

然而，由于缺乏脂肪細胞特異性表面標志物，使用常規(guī)的路線將藥物輸送到脂肪組織十分困難。盡管使用傳統(tǒng)的注射針可對皮下脂肪組織(例如人體主要的wat在腹部)直接進行注射是可能的，但長期注射過程痛苦、容易引起感染。因此，尋求安全有效的肥胖治療策略勢在必行。對白色脂肪密集部位進行靶向、精準、直接給藥進而實現(xiàn)低劑量給藥、降低藥物在非脂肪器官的副作用，并實現(xiàn)簡單便捷、易操作的家庭長期肥胖控制目前仍存在巨大的挑戰(zhàn)。

微針(含微針陣列)透皮給藥作為一種新型透皮給藥方式，集皮下注射給藥方式和透皮貼給藥的優(yōu)點于一體。微針憑借其微米尺度鋒利的針尖在皮膚上首先刺破角質層，形成一個到達表皮層甚至上部真皮層的通道，使藥物到達表皮層或上部真皮層，進而被相關組織吸收，不僅無痛微創(chuàng)，而且減少人體血藥濃度出現(xiàn)峰谷的變化、降低給藥誤差、避免胃腸道的毒副作用和肝臟的首過效應、提高了生物利用度。此外，微針給藥時患者可自行給藥，方便安全。因此，微針透皮給藥技術從開始出現(xiàn)就獲得了廣泛的關注。

伴隨著當前微加工技術的快速發(fā)展，微針透皮給藥技術越來越受到關注和重視。目前已經出現(xiàn)了以硅、氮化硅、玻璃、金屬、高分子聚合物等為基質材料的微針。硅微針制作工藝成熟、應用廣泛，但與人體的生物相容性差、價格昂貴、質地較脆、工藝復雜；金屬材料機械強度好，不易折斷，但存在生物相容性一般，工藝復雜，加工成本高等缺點。此外，在插入皮膚過程中金屬、硅和剝離微針存在自身發(fā)生斷裂的可能性?；谝陨显颍斍皩ξ⑨樆|的研究熱點為生物相容性良好的生物可降解的聚合物材料。微針針尖插入皮膚后，微針可自行降解而無殘留物，解決了微針一旦斷裂于皮膚內難以處理的問題。

生物可降解聚合物微針的基質材料應同時具備以下幾個條件:①加工成型后應有足夠的機械強度可以穿透角質層，保證所攜藥物的順利滲入。②生物可降解，無長期殘留物。③具有良好的生物相容性，不能破壞皮膚內蛋白質的固有結構。④具有維持藥物緩慢釋放，在一定時間內維持藥物治療的有效濃度。⑤不影響藥物的生物活性。⑥使用簡單安全，即使在無醫(yī)療訓練情況下使用也無針尖或生物有害物質殘留，不會給患者帶來危害。

麥芽糖、葡聚糖、糊精、羧甲基纖維素、支鏈淀粉、半乳糖、聚乳酸、聚乙醇酸、硫酸軟骨素、聚對二氧環(huán)己酮、透明質酸、聚乳酸-羥基乙酸(plga)等都可用作生物可降解微針的基質，但是糖類的機械強度不高，在高濕度條件下不穩(wěn)定，易變黏潮解。聚乳糖和聚乙醇酸具有較高的熔融溫度，其在制備微針時需要較高的溫度，因此不適用于高溫敏感的藥物負載，并且具有明顯的酸催化特性，微針降解過程中會產生酸性物質，不利于保持敏感藥物活性，因而限制了其在控釋制劑領域中的應用。硫酸軟骨素不但生物相容性良好，而且其降解產物是人體關節(jié)腔等部位的潤滑液，更適合關節(jié)部位或眼部的局部治療。聚對二氧環(huán)己酮的結晶度較高，可使材料鋼化，力學性能良好，適用于骨固定裝置骨釘。透明質酸(ha)又稱玻璃酸，是體內重要的生理活性物質，降解速度快，半衰期為1-2天。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)由兩種單體-乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，且可通過改變聚合物中乳酸及羥基乙酸比例、聚合物枝狀或者星型、聚合物分子量等改變溶解和降解性能。plga已在美國plga通過fda認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。但需少量有機溶劑溶解。

然而，盡管已經對聚合物載藥微針開展了一定研究，但載藥聚合物微針(含微針陣列)透皮給藥方法不具有部位和藥物普適性，必須針對給藥的部位、給藥的藥劑特點等方面對聚合物微針結構、組成進行適應性的設計，并實現(xiàn)藥物釋放速度與藥物半衰期等相匹配的釋放，才可在指定組織保持藥物活性并進一步實現(xiàn)藥物藥效。此外，目前尚無用于肥胖預防和治療的微針透皮給藥研究。

技術實現(xiàn)要素：

針對當前肥胖預防和治療中的緊迫需求，本發(fā)明提供了一種負載脂肪褐變劑的微針貼片，通過集成到一次性貼片上的聚合物微針陣列中負載脂肪褐變劑，透皮給藥實現(xiàn)皮下wat的直接、局部給藥，有效促進白色脂肪棕化，在無需日常飲食控制的情況下抑制脂肪和體重增加。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種負載脂肪褐變劑的微針貼片，包括基底和立于基底上的微針陣列，微針為由聚合物材料制成的錐形結構，所述聚合物材料為透明質酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物或兩者的混合物，所述脂肪褐變劑通過與聚合物材料共澆注的方式負載在微針的針體內。

人體白色脂肪組織主要分布于腹部及腹股溝，本發(fā)明結合該給藥部位的特點選擇匹配的可降解聚合物。透明質酸(ha)是廣泛分布在軟結締組織細胞外基質中的一種線性大分子酸性粘多糖，由葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復交替連接而成，是構成皮膚、玻璃體、軟骨組織的重要組分，因此透明質酸用于制備本發(fā)明的微針。作為優(yōu)選，所述透明質酸的分子量為<10kda。但透明質酸溶解速度快、降解速度快，不適于需緩慢釋放的應用情況，因此，透明質酸可以與半衰期短的藥物組成，達到快速釋藥的目的。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)的降解產物是乳酸和羥基乙酸，是人體代謝途徑的副產物，因此，對人體不會有毒副作用，適合應用到本發(fā)明。在美國plga通過fda認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。plga溶解速度慢，可以與半衰期長的藥物組合。

所用plga原料包括長鏈聚乳酸-羥基乙酸(分子量76,000-116,000da)、短鏈聚乳酸-羥基乙酸(分子量7000-17000da)或葡萄糖核的星型聚乳酸-羥基乙酸(分子量不高于15000da)。

長鏈及短鏈聚乳酸-羥基乙酸的結構式如式(ⅰ)所示：

其中短鏈聚乳酸-羥基乙酸x＝97-236，y＝122-298；長鏈聚乳酸-羥基乙酸x＝1055-1611，y＝1461-2230；

葡萄糖核的星型聚乳酸-羥基乙酸結構式如式(ⅱ)所示：

其中m＝10-125，x＝1-211，y＝1-268。

作為優(yōu)選，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物為長鏈聚乳酸-羥基乙酸、短鏈聚乳酸-羥基乙酸或星型聚乳酸-羥基乙酸中任意兩種以質量比1:1復配的混合物。

此外，結合透明質酸和plga溶解速度不同的特點，將兩者進行復合，控制溶解和藥物釋放速度，滿足本專利預防或治療肥胖應用的各種要求。

作為優(yōu)選，所述聚合物材料為透明質酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物以質量比1:99～99:1的混合物。

目前預防或治療肥胖的藥物分為食欲抑制劑、消化吸收阻滯劑、降糖藥物(雙胍類、α-糖苷酶抑制劑、glp-1和dpp-4抑制劑)和脂肪褐變劑。脂肪褐變劑是一類代謝刺激劑，可促進白色脂肪褐變，促進褐色脂肪組織的產熱過程，促進體內的脂肪和糖原的分解和氧化。與其他幾類藥物相比，可以在不影響攝食量的情況下，降低體重和體脂。

本發(fā)明選用的脂肪褐變劑包括腎上腺激素(adrenergichormones)、甲狀腺激素(thyroidhormones)、β3腎上腺素能受體激動劑(β3-adrenergicreceptoragonist)、ppar激動劑(pparγagonist)，e2前列腺素及其類似物(prostaglandine2anditsanalogues)，二硝基苯酚(dinitrophenol)，成纖維細胞生長因子21(fibroblastgrowthfactor21)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bonemorphogeneticprotein7)，apelin、脂聯(lián)素、micrornas。

上述脂肪褐變劑目前已被證明具有脂肪褐變能力，腹腔注射可抑制肥胖。截至目前，尚無透皮給藥的研究。

由于微針陣列是對皮下wat直接、局部給藥，因此所需藥物濃度低但生物利用度高，在保證藥效的基礎上降低成本及可能有的副反應，藥物濃度應盡可能低。作為優(yōu)選，每個微針中脂肪褐變劑的質量百分比含量為0.1～50％。

微針陣列中藥物均勻分布，與空心微針及涂覆型微針相比，本發(fā)明藥物均勻分布的聚合物微針載藥量高。

人體的皮膚有三層組織，角質層、活性表皮層和真皮層。其中，最外層的角質層厚度為10～40μm，由致密的角質細胞組成，是藥物輸送的主要障礙；表皮層厚度為50～100μm，含有活性細胞和少量的神經組織，但不含血管；真皮層是皮膚的主要組成部分，含有大量的活細胞、神經組織和血管組織，厚度約為2000μm。為了保證高的滲透性且在微針刺入時不產生疼痛感，微針應刺透皮膚角質層到達表皮層，進入部分真皮層。因此，微針陣列的微針總數(shù)、針高、間隔、底寬需綜合考慮，以實現(xiàn)拇指按壓刺入皮膚及盡量少產生痛感。

作為優(yōu)選，所述微針呈四角錐形，針體高度為100～900μm，高度與底邊寬度之比為2～2.5，相鄰微針之間間隔100～900μm。通過優(yōu)選發(fā)現(xiàn)基于金字塔式的錐形微針陣列、高與底比例為2、間距為700μm適于最佳的透皮效果。進一步優(yōu)選，采用10×10錐形陣列，微針針高600μm，底寬300μm。

基底貼片的作用是為微針陣列提供支撐，使得通過拇指按壓的方式，即可實現(xiàn)刺入皮膚。治療的藥物分子只加載在微針針體內，無需大面積的支持基底，這有效降低了昂貴藥物的浪費。所述基底為由透明質酸制得的薄片，厚度為1～1.5mm。透明質酸生物相容性好、價格低廉。

本發(fā)明微針貼片的使用方法：將負載脂肪褐變劑的一次性載藥聚合物微針陣列貼片貼于皮膚上，通過拇指擠壓將聚合物微針刺入皮膚，聚合物微針溶解后，釋放藥物實現(xiàn)預防或治療肥胖的作用。微針刺入后，可直接去除外留貼片。

本發(fā)明提供了所述的微針貼片的制備方法，包括：

(1)將脂肪褐變劑和聚合物材料溶于溶劑中，制得模液；

(2)將所述模液注入具有微孔陣列的模腔內，離心讓模液填滿微孔，除去多余的溶液，干燥除去溶劑，形成微針；

(3)將不含脂肪褐變劑的聚合物材料溶液填滿模腔，離心后干燥，形成基底。

本發(fā)明利用聚甲基硅氧烷(pdms)微孔模具制備載藥聚合物微針，pdms微孔模具通過將pdms與固化劑甲基二甲基硅氧烷以質量比10:1混合傾倒到不銹鋼模具中，注塑后真空脫氣下于70℃固化2-5小時制得，所述不銹鋼模具內含1個或多個錐形微針陣列陰模。制備微針時，在pdms微模具中加入含藥物的透明質酸或聚乳酸-羥基乙酸(plga)或ha-plga混合物后離心，室溫干燥一定時間。

本發(fā)明采用的聚合物均有良好的成膜性，因此制備過程無紫外線照射和加熱等易于破壞微針結構、藥物組成及活性的過程。

步驟(1)中，本發(fā)明依據(jù)聚合物材料的特點采用相應的溶劑、藥劑以及配比關系，如透明質酸的配制介質為蒸餾水，透明質酸的濃度為0.05～2.0g/ml，透明質酸成膜性好，但過低濃度時所得微針機械強度低，過高濃度時易于吸潮，優(yōu)選0.5g/ml，研究表明：這一濃度條件下制備的微針機械力為每針0.06n，足以刺破皮膚，同時具有抗壓縮能力。藥物與透明質酸的質量比為0.001-0.5:1，優(yōu)選0.005:1(2.5mg:0.5g)。

所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)的配制介質為二甲基甲酰胺。plga的濃度為0.05～1.0g/ml，優(yōu)選0.2g/ml；藥物與plga的質量比為0.01-0.5:1，優(yōu)選0.05：1(10mg:200mg)。

所述ha-plga混合物的復配方案中，首先保證ha、plga及藥物溶解，配制介質為水-二甲基甲酰胺混合液，二甲基甲酰胺百分含量為1％-99％，藥物與ha-plga混合物的質量比為0.001-0.05:1。

上述兩種聚合物材料不僅成膜性好，而且與脂肪褐變劑的相容性好，同時不影響脂肪褐變劑發(fā)揮正常藥效。本發(fā)明微針透皮給藥與直接腹腔注射相對比，透皮給藥的藥物使用量僅需腹腔注射給藥五分之一，即可起到相同的抗肥胖效果。證明兩種聚合物與脂肪褐變劑的相容性好，同時不影響脂肪褐變劑發(fā)揮正常藥效。

本發(fā)明采用離心的方式將聚合物溶液快速充滿pdms模具，且藥物均勻分布，離心轉速和時間主要從能耗和易于操作角度考慮。所述離心轉速為1000-20000rpm，優(yōu)選4000rpm；離心時間為1-20min，優(yōu)選3min。室溫下干燥4-18小時，優(yōu)選12小時。

步驟(3)中，為有利于快速形成穩(wěn)定、機械強度好的柔性基底貼片，在微針陣列底部加入濃度為0.05～2.0g/ml的聚合物材料溶液，成膜形成基底。作為優(yōu)選，加入透明質酸溶液(0.5g/ml)，二次離心(4000rpm，3min)，室溫下干燥12小時后，將微針從模具中剝離下來后于4℃儲存。為了實現(xiàn)拇指按壓透皮的便利性，微針與基底貼片垂直，優(yōu)選的基底貼片尺寸約為6×6mm。

本發(fā)明具備的有益效果：

(1)本發(fā)明提供的微針貼片負載有脂肪褐變劑的微針陣列可直接皮下給藥至皮下脂肪，經短暫的拇指按壓，載藥微針即可嵌入皮膚給藥。由于微針不用拔出，避免了皮膚不適和刺激，與服用藥片、痛苦的靜脈注射，或頻繁就診相比，患者可以方便、有效地使用微針貼片，在家中即可實現(xiàn)肥胖控制或其他代謝性疾病治療。

(2)本發(fā)明優(yōu)選了聚合物種類，透明質酸和plga與脂肪褐變劑相容性好，結合制備過程中離心操作，微針陣列中藥物均勻分布，提高微針制劑的載藥量；此外，通過調整聚合物材料組分可以實現(xiàn)對釋放動力學的調控。

(3)本發(fā)明微針透皮給藥未改變藥物本身的化學結構和藥效，與傳統(tǒng)注射給藥方式相比，本發(fā)明提供的微針貼片具有低劑量給藥和局部靶向給藥的顯著優(yōu)勢，避免常規(guī)全身給藥導致的藥物失效或嚴重的副作用等問題，利用本發(fā)明微針陣列貼片，無需日常飲食控制即可抑制白色脂肪組織和體重的增加，可預防或治療肥胖。

附圖說明

圖1可溶性聚合物載藥貼片透皮給藥皮下脂肪組織的示意圖。

圖2透明質酸微針貼片的表征。[a]負載cy5或藥物的微針貼片的制備過程示意圖。[b]透明質酸微針貼片圖片。[c1-c3]不同角度下拍攝的負載cy5微針的亮場及共聚焦顯微鏡照片。標尺為100μm。[d]未負載藥物和藥物負載微針貼片作用力與位移關系圖。[e1][e2]分別為機械負荷前、后透明質酸微針的sem照片，標尺為100μm。

圖3藥物負載透明質酸微針的體外和體內溶解釋放。[a]負載cy5的透明質酸微針貼片在磷酸緩沖液(pbs,ph7.4)和在小鼠血清中的體外釋放曲線。[b]負載cl316,243的透明質酸微針貼片在豬皮上的釋放曲線。

圖4為藥物負載透明質酸微針的體內溶解釋放。[c1][c2]分別為豬皮上負載cl316,243的透明質酸微針貼片及去除透明質酸貼片后的照片，標尺為2mm。[d][e]分別為負載cl316,243的透明質酸微針及微針插入皮膚后支持貼片的sem照片，標尺為200μm。[f1][f2]分別為微針貼片給藥前后的皮膚切片染色顯微鏡照片。

圖5為藥物負載透明質酸微針的體內分布情況。[g][h]分別為對照組及負載cl316,243的微針給藥2小時和18小時cy5的體內熒光照片。[i]為負載cy5的微針貼片處理2小時的18小時的內臟及皮下脂肪熒光成像照片。[j1][j2]分別為腹腔注射和微針給藥cy5后小鼠內臟及皮下脂肪的熒光強度。

圖6[a1]為小鼠給藥部位示意圖，[a2-a4]為給藥方式圖片。

圖7為載藥透明質酸微針貼片抗肥胖的體內實驗。小鼠進行連續(xù)5天處理。對照組采用未載藥微針貼片，實驗組采用載藥微針貼片。[e]為不同處理方法小鼠的總腹股溝wat，附睪wat和肩胛間bat的圖片。[f][g]為不同處理方法器官及脂肪組織占體重的分數(shù)。

圖8為不同處理的小鼠腹股溝wat褐變標記物表達情況。[h]為western印記結果。[j1-j4]為ucp1,cox1,pgc1α,ap2的免疫印跡結果。

圖9為透皮給藥和注射給藥cl316,243的抗肥胖效果。[a]小鼠進行5天2.5μgcl316,243或0.5μgt3的注射后，總腹股溝wat，附睪wat和肩胛間bat的照片。[b1]體重及[b2]器官與體重的比值。

圖10為小鼠連續(xù)5天注射磷酸緩沖液或高劑量的cl316,243(12.5μg)或利用負載cl316,243微針貼片透皮給藥(共100微針，～2.5μg藥物)的比較圖。[c]為給藥部位示意圖。[d1-d2]為器官與體重的比值。[e]為總腹股溝wat，附睪wat和肩胛間bat的照片。

圖11為體表溫度變化圖。[f]為紅外熱成像分析結果。[g]為未用藥的對照組、高劑量注射及低劑量微針貼片組的溫度比較圖。

圖12為不同給藥處理小鼠的腹股溝wat染色后照片。[h1]為對照組，[h2]為高劑量注射，[h3]為低劑量微針給藥。

圖13為不同處理的小鼠中腹股溝wat棕變效應。[i]為western印記結果。[j1-j4]為ucp1,cox1,pgc1α,ap2的免疫印跡結果。

圖14為plga微針貼片的表征。[a]基于長鏈、具有葡萄糖核的枝狀plga的藥物傳遞系統(tǒng)示意圖。[b]負載cy5的plga微針貼片的亮場和共聚焦顯微鏡。[c]負載cy5的plga微針貼片在磷酸緩沖液(pbs,ph7.4)中的體外釋放。[d]負載cy5的plga微針貼片的機械性能。[e][f]分別為負載cl316,243的plga微針貼片插入豬皮前后的sem照片。[g][h]豬皮中插入單根微針及留有插入痕跡的染色豬皮亮場照片。

圖15為負載cl316,243的plga微針貼片抗肥胖的體內實驗，小鼠進行25天觀察，每周給藥2次。[a]脫毛部位進行微針處理0天及5天的照片。[b]小鼠經微針貼片處理0天及5天的熒光照片。[c]不同給藥處理的小鼠平均體重增長圖。[d]小鼠的日均進食量。[e][f]總腹股溝wat，附睪wat和肩胛間白色脂肪組織的照片及器官占體重的比值。[g]為紅外熱成像分析結果。[h]為體表溫度變化圖。

圖16為負載cl316,243的plga微針貼片致飲食誘胖小鼠白脂肪棕化的結果。[a1][a2]不同給藥處理小鼠的腹股溝wat染色后照片。[b1-b5]ucp1,cox1,pgc1α,ap2的免疫印跡結果。[c-g]不同給藥處理小鼠血清中膽固醇、游離脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖、胰島素的定量結果。

圖17[a]為負載t3的微針貼片及注射t3的體內藥動力學曲線。[b]不同處理小鼠的平均體重。[c][d]t3處理及對照組小鼠血清中t3和tsh水平。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實驗材料：所用小鼠為c57bl/6j小鼠。透明質酸、cl316,243、t3、長鏈plga(plgarg756s,poly(d,l-乳酸-共-羥基乙酸)75:25,分子量76,000-116,000)、短鏈plga(plgarg502,poly(d,l-乳酸-共-羥基乙酸)50:50,分子量7000-17000)、葡萄糖核的星型聚乳酸-羥基乙酸(plga5armstar)15000購自sigma-aldrich。

預防或治療肥胖的應用通過小鼠實驗得以證實。所有數(shù)據(jù)采用t檢驗進行驗證分析，結果以平均值表示。所有的實驗結果均使用至少四個不同的樣品所得平均數(shù)據(jù)。置信區(qū)間設為p值<0.05。對脂肪組織的評價為總腹股溝白色脂肪組織(lgwat)、附睪白色脂肪組織(epiwat)和肩胛間棕色脂肪(bat)。

pdms微模具通過將pdms(pdms與固化劑甲基二甲基硅氧烷質量比為10:1)傾倒到不銹鋼磨具中(10×10錐形陣列，共100微針，高600μm，間隔700μm，底寬300μm)，真空脫氣下于70℃固化2小時制得。

實施例1選用的聚合物為透明質酸(ha)，選用的脂肪褐變劑活性藥物為β3腎上腺素能受體激動劑cl316,243。微針貼片給藥模式如圖1所示。

1、一種負載脂肪褐變劑的一次性載藥聚合物微針陣列貼片的制備

微針制備如圖2a所示。在pdms微模具中加入含藥物的透明質酸溶液(0.5g透明質酸溶于1ml蒸餾水，加入2.5mgcl316,243)后，離心(4000rpm,3min)，室溫下干燥12小時。

基底貼片通過在微針陣列底部進一步制備透明質酸層制得。在微針陣列底部加入透明質酸溶液(0.5g/ml)，二次離心(4000rpm,3min)后，室溫下干燥12小時后，將微針從模具中剝離下來后于4℃儲存。制備好的微針照片如圖2b所示。

圖2(c1-c3)為同時負載藥物和熒光染料cy5微針貼片的熒光顯微鏡照片，可以看出cy5均勻分布在微針中。圖2d中微針力學性能表征表明，每根微針可承受的力均超過刺破皮膚所需力。這一結果保證了通過拇指按壓可以實現(xiàn)微針的刺皮效果。圖2(e1)為微針進行力學性質測定前的掃描電鏡圖，可以看出微針陣列具有錐狀結構，圖2(e1)為插入后并去基底貼片剝離后微針的掃描電鏡圖，可以看到微針根部的斷裂。微針的力學性質可保證刺入皮膚350um而不斷裂。

2、預防或治療肥胖的應用

將一次性載藥聚合物微針陣列貼片貼于小鼠皮膚上，聚合物微針溶解后，釋放藥物實現(xiàn)預防或治療肥胖的作用。

3、微針陣列貼片的性能參數(shù)分析

β3腎上腺素能受體激動劑cl-316243能促進白色脂肪組織的脂解，也能刺激棕色脂肪組織的非顫栗性產熱，抑制脂肪細胞的分化，并能誘導白色脂肪組織中出現(xiàn)棕色脂肪細胞，從而消耗儲脂，起到抗肥胖作用。預防或治療肥胖的作用通過飲食誘導肥胖的小鼠實驗模型證明，與對照組相比，皮下給藥組小鼠脂肪組織質量減小，血清學相關參數(shù)變化作為輔助評價手段。

3.1微針中負載藥物的有效釋放是實現(xiàn)治療的前提，通過體外和體內實驗分析藥物釋放。

3.1.1體外藥物釋放：在上述制備方法中，在加入藥物的聚合物溶液中同時加入綠色熒光染料cy5，通過熒光染料cy5信號考察體外藥物釋放。

具體分析方法：將負載cy5的微針貼片放入磷酸緩沖液(pbs,ph7.4)或小鼠血清(37℃)中。在37℃進行測定。每隔0～2分鐘取樣，利用熒光光譜分析。激發(fā)波長為633nm，發(fā)射波長為660nm。

結果如圖3a所示。由于透明質酸可以快速溶解，cy5染料分子可在磷酸緩沖液中快速釋放，半衰期τ約為3.5秒。在鼠血清中也可快速釋放，半衰期τ約為5.6秒。

3.1.2體內藥物釋放：將負載cl316,243的微針貼片插入豬皮膚內，在不同時間(0-4min)，測定微針釋放進入皮膚的藥物量，繪制體內釋放曲線。

進入皮膚的藥物量通過初始藥物量減掉微針內殘留藥物量得出，微針內殘留藥物量通過將微針拔出然后溶于pbs緩沖液(ph7.4)得出；皮膚中殘留的藥物量還可通過將刺破部分皮膚用磷酸緩沖液浸泡提取得到。

抽提出的cl316,243利用反相液相色譜分析。色譜柱為agilentporoshell120ec-c18，流動相為水:甲醇體積比80:20,流速為0.5ml/min，于230nm處進行紫外檢測，外標法定量。

結果如圖3b所示，當一個微針貼片通過拇指按壓(～1.9n)刺破豬表皮時，微針負載的cl316,243也可以迅速釋放，此過程半衰期約為～8.6秒。

由于表皮和真皮組織比較厚，且皮下脂肪豐富，豬皮與人體皮膚結構接近，因而被廣泛用作皮膚模型。小鼠的處理部位為腹股溝位置，這一位置是嚙齒類動物的主要皮下脂肪庫，脂肪松弛附著在皮膚下面。圖4(c1-c2)刺皮實驗結果，證實透明質酸微針可以在2分鐘內快速溶解而沒有無明顯皮膚紅斑、腫脹及感染。

圖4de分別為透皮前后微針的掃描電鏡圖。負載cl316-243的透明質酸基微針貼皮2分鐘后，皮膚穿刺效果良好，微針完全溶解。顯然，利用本發(fā)明微針，治療藥物可快速、充分傳遞進入皮膚。

利用皮膚冷空切片成像分析微針插入情況。皮膚標本用4％的多聚甲醛固定過夜后利用pbs洗滌，隨后浸泡在30％的蔗糖溶液冷凍保存的組織24小時。嵌入fsc22冷凍介質后，得到10μm厚的冰凍切片。所得皮膚切片最后用蘇木精和曙紅染色，并用配備了數(shù)碼相機的倒置顯微鏡采集圖像。圖4(f1-f2)皮膚組織檢查顯示～300微米的深度已經插入真皮層。

3.2利用活體成像系統(tǒng)研究微針貼片溶解后cy5的生物分布

對經未負載和負載cy5的透明質酸基微針貼片處理5分鐘的小鼠進行熒光成像處理。

微針貼片貼在小鼠左側或右側腹股溝位置，5分鐘后去除貼片并將小鼠進行安樂死后解剖，考察皮下插針處wat及其他內臟中的cy5分布。為研究皮下給藥與腹腔注射的藥效區(qū)別，實驗組采用微針給藥，對照實驗中，對老鼠進行腹腔注射cy5(1μg溶于50μlpbs)。實驗組和對照組老鼠解剖得到的皮下wat及主要內臟肝、心、腎、肺用于熒光成像。

結果如圖5g所示，微針給藥1小時時熒光強度在給藥皮膚區(qū)域強，且大多數(shù)的cy5由于局部擴散僅積累在插入位點(腹股溝wat)附近，并通過循環(huán)到達肝。如圖5h所示，在微針給藥6小時內皮下wat插入點附近的cy5分子會持續(xù)累積。如圖5i、5(j1-j2)所示，微針給藥2小時和18小時時，在心臟，頭部和頸部等器官除沒有檢測到熒光信號，胃和腸僅具有食物等產生的本底熒光。然而，注射cy5小鼠的體內分布與本發(fā)明的皮下給藥形成鮮明對比，注射2小時和18小時時，大部分cy5分布在肝臟和腎臟，導致肝臟代謝和腎臟清除。因此，局部擴散和經皮遞送的藥物分子積累可視為靶向皮下wat治療肥胖的有效方法。

3.3采用小鼠實驗考察載藥微針的抗肥胖效果

(1)對正常飲食飼養(yǎng)的小鼠給予微針給藥

將c57bl/6j小鼠(7–8周齡的雄性)進行正常飼養(yǎng)(光照12小時/黑暗12小時，21℃下生長)，飼養(yǎng)過程中水和飲食采用正常標準。

利用4–5只小鼠進行平行測定得出每次測定的平均數(shù)據(jù)。隨機分為三組：第一組，所用微針貼片為藥物負載的微針貼片(貼片中的微針里分別負載～2.5μgcl316,243)；微針貼片給藥的每日劑量為2.5μgcl316,243(～0.1毫克/公斤/天)。藥物均溶于100μlpbs中，微針中負載cl316,243的量通過hplc或酶聯(lián)免疫分析法(elisa)進行準確測定；第二組，為考察藥物的影響，以未負載藥物的貼片作為對照。第三組，為比較經皮給藥或腹腔注射兩種不同給藥方法對藥物的輸送效率，對小鼠進行每日大劑量腹腔注射cl316243(0.5毫克/公斤/天)。

將小鼠分組后連續(xù)5天每天進行皮下給藥。微針給藥方式如圖6(a1-a4)所示，仔細剃掉腹股溝區(qū)的鼠毛(左下或右背外側區(qū)，靠近后肢處)，將微針貼片貼在暴露區(qū)域的左側或右側，保留5分鐘讓微針完全溶解。利用紅外熱像儀測定經不同處理老鼠的體表溫度用于反映小鼠體溫。

5天后，通入致命劑量的二氧化碳對小鼠進行安樂死。測量體重后，將腹股溝wat(igwat)、附睪wat和肩胛間bat脂肪組織分別切出并稱重。

圖7e和f顯示，用藥組(0.1毫克/千克/天)小鼠的腹股溝左右側的白色脂肪顯著減少。盡管微針給藥僅在腹股溝左側或右側一側給藥，與未給藥的對照組老鼠對比，兩側腹股溝處的白色脂肪的體積均減小。此外，cl316,243處理的小鼠表現(xiàn)出顯著降低的附睪wat(腹腔內臟脂肪)，提示經皮釋放cl316,243具有全身抗肥胖作用(圖7，e和f)。與負載cl316,243的微針貼片相比，負載t3的藥物貼片僅能使作用方向的白色脂肪減少，而不能使未作用位置的白色脂肪減少(圖7，e-g)。

眾所周知，β3-腎上腺素能受體激動劑和t3激素能促進白色脂肪棕化，表達ucp1(產熱，棕色脂肪細胞特異性蛋白)、cox1(線粒體生物合成標記)、pgc1α(轉錄因子必不可少的產熱的棕色特異基因的表達)及ap2蛋白質。免疫免疫印跡分析脂肪組織中ucp1,cox1,pgc1α,ap2，操作如下：在4℃下經渦流分散后離心收集組織上清液，利用二辛可寧酸測定蛋白質濃度。每個樣品經12％sds-page電泳后轉移到硝酸纖維素膜上。膜用封閉緩沖液在室溫下封閉2小時后與一抗(1:200-400稀釋，室溫結合12小時)特異性結合后，用含吐溫的tris緩沖液(tbst)清洗3×15分鐘，隨后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1:2000–4000稀釋；室溫反應6小時)。隨后用tbst清洗3×15分鐘。蛋白條帶用成像系統(tǒng)檢測。所用抗體為ucp1(sc-6529),ap2(sc-18661),pgc-1α(sc-13067),cox1(sc-23982),及actin(sc-1616)。抗ucp1抗體為pa1-24894。

圖8h、j1-j4的結果表明，cl316,243的微針貼片處理過的小鼠腹股溝左右兩側脂肪組織中上述活性蛋白表達至均增加，而t3微針貼片處理過的小鼠僅用藥部分白色脂肪組織中活性蛋白的表達增加。

圖9a和b1、b2所示，與微針給藥方法相反，采用相同劑量的cl316,243(0.1毫克/公斤/天)經腹腔注射不會顯著改變脂肪組織的重量。只有當腹腔注射劑量5倍提升后，才能達到類與低劑量微針皮下給藥相同的效果。

與微針經皮給藥相比，相同劑量的cl316,243腹腔注射(0.1毫克/千克/天)對脂肪組織重量的改變可以忽略不計。

如圖10c、10(d1-d2)和10e所示，只有當注射劑量提高5倍是，才可以有類似的效果。

圖11f和g結果表明，腹腔注射和低劑量的微針透皮給藥均導致體表溫度升高，其中至少部分是由于脂肪組織轉化為能量消耗狀態(tài)(褐變)(如圖12所示)。

圖13i和j1-j4兩種給藥方式均使褐變標志物ucp1,cox1和pgc1a含量增加。這一結果證明，微針給藥可以在更低的劑量下，實現(xiàn)更好的效果，從而降低或排除了高劑量時β腎上腺素能激動劑對心臟、血壓等的副作用。

實施例2選用的聚合物為plga，選用的脂肪褐變劑活性藥物為β3腎上腺素能受體激動劑cl-316243。

1、一種負載脂肪褐變劑的一次性載藥聚合物微針陣列貼片的制備

將含藥物的plga溶液(200mgplga溶于1ml二甲基甲酰胺，10mgcl316,243)加入到pdms微模具中后離心(4000rpm,3min)，室溫下干燥12小時。

基底貼片通過在微針陣列底部進一步制備透明質酸層制得。在微針陣列底部加入透明質酸溶液(0.5g/ml)，二次離心(4000rpm,3min)后，室溫下干燥12小時后，將微針從模具中剝離下來后于4℃儲存。

2、預防或治療肥胖的應用

將一次性載藥聚合物微針陣列貼片貼于小鼠皮膚上，聚合物微針溶解后，釋放藥物實現(xiàn)預防或治療肥胖的作用。微針貼片插入后，立刻將透明質酸基底分離去除，以防止快速溶解產生透明質酸溶液。

3、微針陣列貼片的性能參數(shù)分析

3.1聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)是一種生物相容性好、可生物降解的高分子材料，已在藥物和生物大分子載體中廣泛采用(如dna、rna、蛋白質)?？梢酝ㄟ^選擇不同的plga結構實現(xiàn)力學性能和藥物釋放動力學的調控。

如圖14a所示，在ha襯底上制備了不同的plga微針。為表征微針形貌和藥物釋放性質，cy5分子僅負載在plga微針處。

長鏈plga制備的微針具有尖銳的錐形結構，而短鏈或星型plga形貌較差。然而長鏈plga的溶解及cy5分子的釋放，十分緩慢，在磷酸緩沖液中浸泡7天后，仍能保持較好的錐狀結構，且在pbs溶液中浸泡4天或2周后，僅有8.6％或37.3％的cy5分子被釋放出來。相比之下，短鏈plga微針浸泡7天之后縮小成一個小球而星形微針基本坍塌，2周后均釋放了超過>70％的cy5分子(圖14b)。

為了保證良好的形態(tài)和適中的釋放動力學，可將長鏈短鏈或星型plga進行混合復配。我們發(fā)現(xiàn)長鏈和短鏈plga按1:1混合最可取。如圖14c-d所示，plga756s+502制備的微針非常尖銳，4天可釋放31.8％的cy5分子，與純短鏈或星型plga微針釋放效果類似。純的長鏈plga微針的機械強度最大，但plga756s+502制備所得微針的機械強度已經超出了刺破豬皮的壓力。因此優(yōu)選plga756s+502制備微針。

如圖14e所示，sem表征顯示微針的基部寬度為250μm和高度為570μm。如圖14f所示，用pbs溶液進行快速(～1min)潤濕后，將微針從透明質酸基底上剝離下來。如圖14g、14h所示，這些微針可以通過拇指按壓刺入豬皮，破皮深度約為300μm。緩慢的溶解性能和適當?shù)臋C械強度，使得載藥plga微針可作為可持續(xù)釋放藥物的皮下給藥系統(tǒng)。

3.2負載cl316,243并緩慢溶解的plga微針貼片經皮給藥的抗肥胖作用

藥物快速釋放的例子中，需要日常多次用藥，這可能帶來一定的痛苦。因此，也可以通過聚合物的緩慢溶解，實現(xiàn)藥物緩慢釋放，進而降低用藥次數(shù)及用藥不適。

plga微針制備材料為(756s+502)。用類似于使用透明質酸微針貼片的實驗方法，plga微針貼片也被應用于小鼠的腹股溝位置。微針穿透皮膚后留下微陣列的痕跡，但沒有造成明顯皮膚紅斑、腫脹和感染等皮膚異常情況，如圖15a所示。

圖15b顯示，使用負載cy5的plga微針貼片5天后，插入位點附近觀察到明顯的熒光信號。這進一步證明了plga的緩慢溶解。且這一保留時間與小鼠的表皮代謝更新時間(8-10天)匹配。顯然，植入的plga微針可作為長效的藥物緩釋庫。

為了測試載藥微針對飲食誘導的肥胖(dio)模型的抗肥胖作用，利用高脂飲食誘導和維持小鼠肥胖-即給予老鼠高脂高熱的食物，促使其肥胖。所用小鼠為c57bl/6j型，9-10周雄性鼠，體重約30克。將小鼠隨機分為3組并每周進行藥物處理2次。對照組采用未負載藥物的微針貼片處理，樣品組采用cl316,243負載的微針貼片(每只老鼠用1片貼片處理,每片貼片的微針載藥10μg)或腹腔注射cl316,243(10μg每鼠；～0.3mg/kg)。

圖15c、d顯示，微針貼片每周使用2次。與采用未負載藥物微針處理的對照組小鼠相比，負載cl316,243微針可顯著抑制～15％的體重增長。相比之下，腹腔注射相同劑量(～0.3mg/kg，每周兩次)未明顯防止體重增加。

圖15e、15f顯示，皮下給藥的小鼠腹股溝wat和附睪wat減少。此外，圖15g、15h顯示，微針給藥cl316,243也導致體表溫度升高。

圖16a顯示，腹股溝wat處棕色脂肪細胞增多，圖16(b1-b5)顯示，褐變標志物均顯著增加。這一結果證實了脂肪褐變。持續(xù)的經皮藥物釋放優(yōu)于全身給藥。

與人類一樣，肥胖小鼠表現(xiàn)出代謝綜合征，包括高水平的總膽固醇、游離脂肪酸、胰島素、葡萄糖和甘油三酯，這是一系列代謝性疾病如糖尿病的高危因素。因此，本發(fā)明的微針治療能改善血清中上述代謝物水平(圖16c-g)。

實施例3選用的聚合物為透明質酸，選用的脂肪褐變劑活性藥物為甲狀腺激素t3。

1、一種負載脂肪褐變劑的一次性載藥聚合物微針陣列貼片的制備

在pdms微模具中加入含藥物的透明質酸溶液(0.5g透明質酸溶于1ml蒸餾水，加入0.5mgt3)后離心(4000rpm,3min)，室溫下干燥12小時。

基底貼片通過在微針陣列底部進一步制備透明質酸層制得。在微針陣列底部加入透明質酸溶液(0.5g/ml)，二次離心(4000rpm,3min)后，室溫下干燥12小時后，將微針從模具中剝離下來后于4℃儲存。

2、預防或治療肥胖的應用

將一次性載藥聚合物微針陣列貼片貼于小鼠皮膚上，聚合物微針溶解后，釋放藥物實現(xiàn)預防或治療肥胖的作用。

3、微針陣列貼片的性能參數(shù)分析

3,3,5–三碘甲狀腺原氨酸(甲狀腺激素t3)被用作模型的抗肥胖藥物。它可以提高機體的代謝率，增加能量的消耗，是一種減肥藥物。但口服和靜脈途徑的全身給藥模式，易于對非靶向部位產生副作用(例如會引起心血管問題)，這限制了其在肥胖管理中的應用。這種副作用可以通過本發(fā)明微針的皮下給藥而極大地克服。

除具體實施例1-2中實驗方法外，本實施例還對微針貼片處理過的小鼠血清中甲狀腺t3和促甲狀腺激素(tsh)水平利用鼠甲狀腺t3elisa板分析(biovision)。肥胖小鼠血清中游離脂肪酸、甘油三脂和葡萄糖水平通過標準測定板測定(biovision)。膽固醇和胰島素水平通過膽固醇定量板(sigma-aldrich)和鼠胰島素elisa板(thermoscientific)測得。

如圖17a所示，傳統(tǒng)的注射給藥可導致血清中甲狀腺t3的迅速急劇增加，隨后快速衰減。本實施例中的微針皮下給藥，一個初始延遲(～1h)后顯示更持續(xù)的低水平t3濃度。這可能是由于經皮排出的t3需要擴散通過皮下組織的細胞外基質，進而在腹股溝wat積累并開始循環(huán)。與負載cl316,243透明質酸微針相反，負載t3的透明質酸微針處理過的小鼠與對照組相比，僅透皮給藥一側的皮下wat變輕變小。同時，附睪wat(內臟脂肪)也沒有產生顯著差異。

本發(fā)明中聚合物材料未改變藥物本身的化學機構和藥效，且微針制備過程中未加入其它輔料，避免了輔料通過靜電作用、疏水作用、包結作用等對藥物形狀及藥效產生影響。

圖17b、c、d中的結果表明，對照組實驗和微針給藥組老鼠的體重、血清t3及血清促甲狀腺激素(tsh)均沒有顯著差異，血清游離t3和正常表明經皮傳遞t3局限在附近的皮下白色脂肪細胞而t3分子進入循環(huán)則被綁定到t3結合蛋白(如球蛋白、白蛋白等)或在肝部降解。腹腔注射相同劑量t3對附睪wat重量也無影響，進一步證實了透皮t3給藥僅導致微針插入?yún)^(qū)附近皮下脂肪組織的減少。進一步驗證了微針不會使負載藥物藥效和性狀發(fā)生變化。負載t3的透明質酸微針處理區(qū)域附近的wat中，ucp1表達量(產熱和棕色脂肪細胞特異性蛋白)、cox1(線粒體生物合成標志物)和pgc1α(產熱的棕色特異基因表達必不可少的轉錄因子)明顯增加(圖7-9)。

以上實施例充分說明，本發(fā)明優(yōu)選了聚合物種類，透明質酸和plga與脂肪褐變劑相容性好，結合制備過程中離心操作，微針陣列中藥物均勻分布，提高微針制劑的載藥量；此外，通過調整聚合物材料組分可以實現(xiàn)對釋放動力學的調控。本發(fā)明微針透皮給藥未改變藥物本身的化學結構和藥效，通過微針透皮給藥可直接給藥到皮下脂肪組織，與傳統(tǒng)注射給藥方式相比，本發(fā)明提供的微針貼片具有低劑量給藥和局部靶向給藥的顯著優(yōu)勢，避免常規(guī)全身給藥導致的藥物失效或嚴重的副作用等問題，利用本發(fā)明微針陣列貼片，無需日常飲食控制即可抑制白色脂肪組織和體重的增加，可預防或治療肥胖。