本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域，經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荷葉堿能夠促進(jìn)細(xì)胞glut4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4)轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取葡萄糖，可以用于治療二型糖尿病的新藥開發(fā)。

背景技術(shù)：

二型糖尿病，又稱非胰島素依賴型糖尿病。二型糖尿病患者在整個(gè)糖尿病人群中占90％～95％。體內(nèi)糖脂代謝異常是二型糖尿病的主要特征。在二型糖尿病發(fā)病的過程中，開始患者的胰島β細(xì)胞還有分泌胰島素的能力，之后患者機(jī)體會產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞代償性分泌更多胰島素來維持正常血糖水平。當(dāng)患者的胰島β細(xì)胞失去代償能力之后，血糖水平升高，引起二型糖尿病。二型糖尿病的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，尚未完全闡明。目前的研究表明二型糖尿病與遺傳和外界環(huán)境因素有關(guān)。胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗是二型糖尿病的2個(gè)主要癥狀。如果未及時(shí)控制，二型糖尿病會導(dǎo)致一系列慢性并發(fā)癥，例如心血管疾病、視網(wǎng)膜病變、腎功能衰竭等。目前臨床已有一系列降糖藥物用于改善二型糖尿病患者的血糖水平。目前應(yīng)用較多的主要有雙胍類藥物，磺脲類藥物和α-糖苷酶抑制劑等藥物。而長期服用這些藥物有較多副作用，例如腸胃不適和低血糖等。而近年研發(fā)的過氧化物酶體增殖物激活物受體γ激動劑噻唑烷二酮類藥物也有引起體重增加和水腫等副作用。目前的研究證明二型糖尿病與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glut4)的表達(dá)和轉(zhuǎn)位缺陷有關(guān)。因此，可以針對glut4為靶點(diǎn)尋找篩選出治療二型糖尿病的新藥物。

荷葉堿，拉丁學(xué)名：foliumnelumbinis，荷葉中的一種阿樸啡型生物堿，為荷葉中的主要降脂活性成分；以曬干粉碎的荷葉為原料，采用纖維素酶預(yù)處理、稀鹽酸浸提、超聲波輔助提取、氯仿萃取一系列方法提取而成。其中江西石城產(chǎn)區(qū)的荷葉含荷葉堿最高。中國發(fā)明專利201410628713.2提供了一種治療糖尿病的藥物組合物，該組合物由荷葉堿、葫蘆素e、鞭打繡球苷b、海州常山苦素a配比而成，該專利中從中醫(yī)的角度闡述了以上藥物組合物治療糖尿病的機(jī)理，并通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了以上藥物組合物能夠起到降低血糖的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了荷葉堿的新的用途，檢測了荷葉堿對細(xì)胞glut4表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，以及細(xì)胞葡萄糖攝取的實(shí)驗(yàn)。另外，本申請中還研究了荷葉堿的作用機(jī)理和相關(guān)信號通路。為研發(fā)荷葉堿藥物用于治療二型糖尿病提供了依據(jù)。

具體研究結(jié)論如下：

(1)荷葉堿能夠促進(jìn)l6細(xì)胞的葡萄糖攝取。

(2)荷葉堿能夠促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)。

(3)荷葉堿通過ampk通路促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)；通過g蛋白-plc-pkc信號通路促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)。

本發(fā)明的有益效果為：通過檢測細(xì)胞glut4表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及細(xì)胞葡萄糖攝取的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)荷葉堿具有促進(jìn)glut4的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖攝取的功效，有望應(yīng)用于緩解二型糖尿病引起的胰島素抵抗，改善患者血糖水平。

雖然中國發(fā)明專利201410628713.2中提供了一種治療糖尿病的藥物組合物，該組合物由荷葉堿、葫蘆素e、鞭打繡球苷b、海州常山苦素a配比而成，能夠起到降低血糖的效果。但是已有專利中所提供的是藥物組合物，由荷葉堿、葫蘆素e、鞭打繡球苷b、海州常山苦素a配比而成共同發(fā)揮的藥效。本申請中相比而言是荷葉堿單體應(yīng)用在治療2型糖尿病方面的保護(hù)。此外，已有專利中是從動物實(shí)驗(yàn)水平方面證實(shí)包括荷葉堿在內(nèi)的組合藥在糖尿病治療方面具有效果。而本申請中是從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平證明荷葉堿在治療2型糖尿病方面的效果，包括荷葉堿對細(xì)胞glut4的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及細(xì)胞葡萄糖攝取的影響；還研究了荷葉堿的作用分子機(jī)理和相關(guān)信號通路，為研發(fā)荷葉堿藥物用于治療二型糖尿病提供了依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中的荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞的葡萄糖攝取效果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)運(yùn)效果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞glut4表達(dá)效果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中的荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)被ampk信號通路抑制劑compoundc以及pkc信號通路抑制劑g蛋白抑制劑ptx、plc抑制劑u73122抑制效果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中的荷葉堿提高l6細(xì)胞pkc的磷酸化效果圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中的荷葉堿促進(jìn)葡萄糖攝取的通路圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實(shí)施例。

1.細(xì)胞葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)：

將l6細(xì)胞按1×10⁴～5×10⁴的密度種于96孔板內(nèi)。用含2％fbs的α-mem培養(yǎng)液將l6細(xì)胞分化5～7天。然后將細(xì)胞饑餓2小時(shí)，之后加入含有150μg/ml2-nbdg的200μmol/l荷葉堿在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min。30min后對細(xì)胞離心5min。去掉上清液，加入葡萄糖檢測試劑盒緩沖液離心5min，再去掉上清。再加入試劑盒緩沖液混勻。在485nm激發(fā)波長和535發(fā)射波長下檢測2-nbdg的熒光吸收值。該試驗(yàn)進(jìn)行了3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并設(shè)立了對照組和胰島素組。

2.激光共聚焦顯微鏡檢測glut4轉(zhuǎn)運(yùn)：

本發(fā)明使用穩(wěn)定表達(dá)irap的l6細(xì)胞(irap-morange-l6)作為研究對象。irap是一種跨膜氨基肽酶蛋白，目前研究已證明irap與glut4存在高度共定位關(guān)系。因此可以利用觀測irap–morange來監(jiān)控l6細(xì)胞內(nèi)glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。首先將irap-morange-l6用無血清培養(yǎng)液饑餓2小時(shí)，之后在激光共聚焦顯微鏡下觀察irap-morange的熒光并檢測細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度，從而檢測細(xì)胞glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。

3.westernblotting：

用無血清培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞2小時(shí)，然后加入相應(yīng)藥物處理，之后立即將細(xì)胞置于冰上用冷的pbs洗三遍。加入蛋白酶抑制劑pmsf，將細(xì)胞刮起。將細(xì)胞分別用27規(guī)格和12規(guī)格的注射器抽提破碎12次，該操作在冰上進(jìn)行。將細(xì)胞在500g離心10min，取上清加入sds-pageloadingbuffer，混勻后65℃變性10min。所得蛋白樣品經(jīng)過sds-page電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育相應(yīng)的一抗和二抗。然后用ecl顯影檢測蛋白條帶。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞的葡萄糖攝取效果圖如圖1所示，由圖1中可以看出，荷葉堿(nuciferine)顯著促進(jìn)了l6細(xì)胞的葡萄糖攝取。而且荷葉堿對l6細(xì)胞葡萄糖攝取的促進(jìn)效果與胰島素(insulin)相當(dāng)。

荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)運(yùn)效果圖如圖2所示，由圖2中可以看出，加入荷葉堿后。irap-morange-l6細(xì)胞膜的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。說明荷葉堿可以促進(jìn)l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)運(yùn)。

荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞glut4表達(dá)效果如圖3所示，由圖3中可以看出，加入荷葉堿作用5min后。l6細(xì)胞的glut4表達(dá)水平顯著高于對照組。表明荷葉堿促進(jìn)了l6細(xì)胞glut4表達(dá)。

荷葉堿促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)被ampk信號通路抑制劑compoundc以及pkc信號通路抑制劑g蛋白抑制劑ptx、plc抑制劑u73122抑制效果圖如圖4所示，由圖4可以看出，荷葉堿對如圖l6細(xì)胞glut4轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)作用被ampk抑制劑compoundc以及pkc信號通路抑制劑抑制、g蛋白抑制劑ptx、plc抑制劑u73122抑制，而胰島素信號通路抑制劑wortmannin及ip3r抑制劑2-apb則無抑制作用。表明荷葉堿通過ampk通路促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)；通過g蛋白-plc-pkc信號通路促進(jìn)l6細(xì)胞glut4的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)。

荷葉堿提高l6細(xì)胞pkc的磷酸化效果圖如圖5所示，由圖5中可以看出，加入荷葉堿作用5min后。l6細(xì)胞中pkc磷酸化水平顯著高于對照組。表明荷葉堿提高l6細(xì)胞pkc的磷酸化。

荷葉堿促進(jìn)葡萄糖攝取的通路圖如圖6所示。