本發(fā)明屬于化學(xué)工藝領(lǐng)域，涉及玫瑰花渣活性部位萃取方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大馬士革玫瑰(rosadamascena)，常用名damaskrose，又名突厥薔薇，薔薇科薔薇屬，屬古典庭院玫瑰，叢生灌木植物，原產(chǎn)于敘利亞，14世紀(jì)開始在法國(guó)廣為栽種，大馬士革玫瑰是保加利亞種植的主要的玫瑰品種，也是世界公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)玫瑰品種。所產(chǎn)精油為玫瑰中的上品，因而被廣泛種植用以提取玫瑰精油。

玫瑰在我國(guó)的栽培歷史悠久，目前在全國(guó)各地均有種植。山東平陰是中國(guó)最大的玫瑰花種植基地，玫瑰花資源十分豐富。近年來，各地相繼引進(jìn)用于提取精油的大馬士革玫瑰，提取精油后產(chǎn)生大量的花渣，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、維生素c、維生素e、β-胡蘿卜素及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素。玫瑰具有很強(qiáng)的滋補(bǔ)身心的功效，能提高機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)荷爾蒙水平，促進(jìn)循環(huán)代謝，改善及增強(qiáng)泌尿系統(tǒng)機(jī)能，利尿，強(qiáng)腎。此外玫瑰還能活化血管、促進(jìn)血液循環(huán)，增強(qiáng)血管壁彈性，降低心臟的充血現(xiàn)象，降低心臟病的發(fā)生率，改善脾臟功能，利脾益心。玫瑰具有一定的抗菌、抑菌功能；并能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，有輕瀉作用，凈化消化道，幫助毒素排解及代謝，能改善反胃、嘔吐及便秘；并能增強(qiáng)及改善肝功能，清除毒素，尤其能減低酒精對(duì)肝臟的毒害作用，改善過量酒精造成的肝充血。玫瑰能夠平衡及強(qiáng)化胃腸道功能，調(diào)節(jié)消化液的分泌，促進(jìn)消化和吸收：對(duì)消化不良及胃酸分泌過多等慢性疾病有一定的調(diào)節(jié)和改善作用；對(duì)情緒緊張、壓抑等引起的胃痛有明顯的改善功能。像所有的天然產(chǎn)物一樣，玫瑰花成分復(fù)雜，含有多酚類、黃酮類等多種化學(xué)成分，具有減少和消除自由基，抗氧化活性，抗血栓，抗癌，抗炎，抗菌，免疫調(diào)節(jié)作用，如果將這些花渣丟掉，不僅造成巨大的浪費(fèi)，還將污染環(huán)境。若能將這些廢渣加工制成玫瑰保健功能食品、玫瑰黃酮抗氧化劑及高檔化妝品，則既可豐富了市場(chǎng)，有利于環(huán)境保護(hù)，又提高了玫瑰的綜合利用價(jià)值，產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。

機(jī)體或細(xì)胞的衰老和死亡以及很多疾病被認(rèn)為是由過量的自由基的氧化損傷造成，抗氧化劑是能阻止或很大程度抑制易氧化物質(zhì)氧化過程，能清除活性氧或者阻止活性氧生成的一類物質(zhì)，在病理學(xué)和飲食中都起著不可或缺的作用。從植物組織中提取的天然抗氧化劑不僅能夠有效清除機(jī)體的自由基，抑制氧化損傷，而且具有來源廣泛、成本低、安全性好、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。清除abts自由基法是評(píng)價(jià)抗氧化能力的常用方法，abts法廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基的能力。abts自由基可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)。此法快速簡(jiǎn)單，廣泛應(yīng)用于食品和天然水溶性酚類物質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定。

清除dpph自由基法也是評(píng)價(jià)抗氧化能力的常用方法，該方法快速、簡(jiǎn)單、靈敏、直接。

天然產(chǎn)物抗氧化作用的機(jī)理之一是清除羥自由基，機(jī)體在一定的病理?xiàng)l件下能夠產(chǎn)生較多的羥自由基，多種疾病與羥自由基所致的氧化性損傷有關(guān)，采用水楊酸法清除反應(yīng)產(chǎn)生的·oh，該法儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，測(cè)定快速。

酪氨酸酶，又稱多酚氧化酶，廣泛存在于動(dòng)、植物以及微生物的組織細(xì)胞中，與果蔬褐變、人色素障礙性疾病及其惡性黑色素瘤的發(fā)生有著重要關(guān)系。酪氨酸酶是黑色素形成過程的關(guān)鍵酶。由于酪氨酸酶是黑色素形成過程中的關(guān)鍵酶，抑制酪氨酸酶的活性可減少黑色素的形成。酪氨酸酶首先催化酪氨酸羥基化為l-dopa，再進(jìn)一步催化l-dopa為醌類。在美白化妝品中添加能抑制酪氨酸酶活性的美白劑，可以通過抑制酪氨酸酶活性直接抑制黑色素的形成，從而達(dá)到美白肌膚的目的。酪氨酸酶氧化酪氨酸為黑色素的流程圖如下：

沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性；同時(shí)沒食子酸具有抗腫瘤作用，可以抑制肥大細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移，從而延長(zhǎng)生存期；對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，可以抵抗四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟生理和生化的轉(zhuǎn)變；可以通過抑制內(nèi)皮no的生成誘導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴性收縮和對(duì)內(nèi)皮依賴性松弛。對(duì)多種細(xì)菌、真菌以及流感病毒均有一定的抑制作用。沒食子酸的一些酯類常常作為優(yōu)良的抗氧化劑廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域。歐、美、日等發(fā)達(dá)國(guó)家大部分的水產(chǎn)品浸漬防腐均用沒食子酸替代有致癌作用的丁基-4-羥基苯甲醚。目前國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)沒食子酸主要以五倍子為原料，采用酸水解、堿水解、發(fā)酵法和酶水解法制備沒食子酸，但均純?cè)谝欢ǖ谋锥?，酸水解法不僅引入了無機(jī)雜質(zhì)，而且對(duì)設(shè)備腐蝕很嚴(yán)重；堿水解法工藝較為繁瑣，耗能大；發(fā)酵法和酶法效率雖得到提高，但生產(chǎn)成本也大幅提高，對(duì)人員要求較高，且引入了一些有機(jī)雜質(zhì)。

玫瑰花渣營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、維生素c、維生素e、β胡蘿卜素及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，文獻(xiàn)報(bào)道其渣有抗菌，抗氧化等生理活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決玫瑰花殘?jiān)木C合利用的技術(shù)問題，公開了玫瑰花渣活性部位萃取方法及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

玫瑰花渣活性部位萃取方法，步驟如下：

(1)玫瑰花渣浸膏的制備；

(2)梯度萃取玫瑰花渣浸膏，分離有機(jī)相和水相，從有機(jī)相得到活性部位drfr(damaskroseflowerresidue)-a和活性部位drfr-b；

(3)從步驟(2)中的水相中分離沉淀、純化制得活性部位drfr-c；

(4)對(duì)步驟(2)中的水相進(jìn)行抽濾并回收濾液、純化制得活性部位drfr-d。

所述步驟(1)的操作為：取玫瑰花渣，加入8～12倍質(zhì)量的酶解液，浸泡30～60min，組織破碎法提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，合并濾液，經(jīng)多級(jí)閃蒸器回收溶劑，濃縮成膏。

所述酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5。

所述步驟(2)的操作為：取經(jīng)步驟(1)得到的玫瑰花渣浸膏，加水制成混懸，使之比重在1.0～1.3，分別用乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，回收有機(jī)溶劑，于55℃烘箱里干燥至恒重，將經(jīng)乙酸乙酯溶液萃取的活性部位命名為drfr-a，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液萃取的活性部位命名為drfr-b。

所述乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液均采用梯度溶劑量進(jìn)行萃?。灰宜嵋阴ィ阂掖嫉捏w積比為(1～10):(1～10)。

所述步驟(3)的操作為：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65％～85％，靜置8～12小時(shí)，經(jīng)抽濾得到沉淀，于55℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，將沉淀命名為活性部位drfr-c。

所述步驟(4)的操作為：

將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65％～85％，靜置8～12小時(shí)，經(jīng)抽濾后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱里干燥至恒重，將此部位命名為活性部位drfr-d。

所述的玫瑰花渣活性部位萃取方法制備的玫瑰花渣活性部位的應(yīng)用，所述玫瑰花渣活性部位作為制備沒食子酸結(jié)晶的應(yīng)用。

制備方法如下：

(1)在drfr-a部位中加入石油醚-乙酸乙酯混合溶劑制得drfr-a混合液，超聲萃取3～5次后，剩下的部分用體積分?jǐn)?shù)為50％～70％的乙醇溶解得混合液ⅱ，濃縮至混合液ⅱ體積的(1/2～1/3)，移至4℃冰箱內(nèi)靜置12～18h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品；石油醚：乙酸乙酯的體積比為(1～10):(1～10)，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的加入量為：以1gdrfr-a部位為基準(zhǔn)，加入4～8ml石油醚-乙酸乙酯混合溶劑；

(2)取步驟(1)制得的沒食子酸粗品，用二氯甲烷-甲醇混合溶劑溶解后，于10～20℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，收集瓶壁上的針狀晶體；二氯甲烷：甲醇的體積比為(10～20):(0.5～4.5)，二氯甲烷-甲醇混合溶劑的加入量：以1g沒食子酸粗品為基準(zhǔn)，加入4～8ml二氯甲烷-甲醇混合溶劑；

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸結(jié)晶。

所述玫瑰花渣活性部位作為抗氧化、抗黑色素產(chǎn)品的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明以提取精油之后產(chǎn)生的玫瑰渣為原料，組織破碎提取后，進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取，并對(duì)萃取的各個(gè)部位進(jìn)行抑制酪氨酸酶和抗氧化活性篩選，以期分離出具有高度生物活性的單體或一類物質(zhì)，為玫瑰花的綜合利用，奠定理論基礎(chǔ)。

2.本發(fā)明用閃式提取器提取玫瑰渣中的成分，依靠高速機(jī)械剪刀力和超動(dòng)分子滲透技術(shù)，在室溫及溶劑存在下短時(shí)間內(nèi)把其組織破碎至細(xì)微顆粒，同時(shí)使有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，通過過濾達(dá)到提取之目的。

3.本發(fā)明采用液-液萃取法進(jìn)行初步分離，萃取原理是根據(jù)化合物在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中，經(jīng)過反復(fù)多次萃取，而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離。

4.各部位對(duì)dpph自由基的清除效果關(guān)系如圖4所示，它們均有一定的清除dpph自由基的能力，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各成分隨濃度的不斷增大，其對(duì)dpph自由基的清除效果呈不斷增加的趨勢(shì)。

5.本發(fā)明的三個(gè)萃取部位對(duì)abts清除的能力相對(duì)弱于vc，它們對(duì)abts清除能力從大到小依次為:vc＞drfr-a＞drfr-b＞drfr-c，從數(shù)值上來看，同等濃度drfr-a與vc對(duì)abts清除能力幾乎相當(dāng)，各部位對(duì)abts清除效果關(guān)系如圖5所示，該活性部位均有一定的清除abts的能力，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各成分隨濃度的不斷增大，其對(duì)abts的清除效果呈不斷增加的趨勢(shì)。

6.本發(fā)明的效果實(shí)施例以曲酸為陽性對(duì)照，考察了drfr-a部位對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，結(jié)果表明此部位對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用，此部位中具有潛在高活性成分抑制酪氨酸酶的活性。玫瑰渣是純天然的，具有安全無毒的副作用。因此，對(duì)抑制酪氨酸酶活性較強(qiáng)的此部位進(jìn)一步分析其抑制機(jī)理及功能成分具有重要的意義。

7.本發(fā)明首次利用萃取結(jié)晶方法分離純化玫瑰花渣中的抗氧化的主要活性成分沒食子酸，不經(jīng)過柱層析，方法簡(jiǎn)便、環(huán)保，收率高，生產(chǎn)周期短，便于產(chǎn)業(yè)化；制備的沒食子酸具有純度高、雜質(zhì)少、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低、對(duì)設(shè)備要求低等特點(diǎn)，本發(fā)明以天然產(chǎn)物玫瑰花渣為原料，無需昂貴設(shè)備，也不會(huì)引入新的雜質(zhì)，僅用萃取和結(jié)晶的方法就能生產(chǎn)高純度沒食子酸，在化妝品和食品抗氧化方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1dpph全波長(zhǎng)掃描圖；

圖2abts全波長(zhǎng)掃描圖；

圖3羥自由基全波長(zhǎng)掃描圖；

圖4drfr-a，drfr-b，drfr-c和vc對(duì)dpph的清除能力；

圖5drfr-a，drfr-b，drfr-c和vc對(duì)abts的清除能力；

圖6玫瑰渣萃取各部位與vc和羥自由基反應(yīng)時(shí)的吸光度變化趨勢(shì)；

圖7曲酸抑制酪氨酸酶活性曲線；

圖8各濃度對(duì)酪氨酸酶抑制曲線；

圖9drfr-a抑制酪氨酸酶活性曲線；

圖10沒食子酸結(jié)晶hplc色譜圖；

圖11沒食子酸結(jié)晶¹h-nmr；

圖12沒食子酸結(jié)晶ir圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.玫瑰渣浸膏的制備

取9kg的玫瑰渣，加入11倍質(zhì)量的酶解液(酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5；上述酶購(gòu)自河南正興食品添加劑有限公司)，浸泡40min，組織破碎提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，濾渣加一定量再次提取3次，每次3分鐘，如此反復(fù)三次。合并3次濾液，用多級(jí)閃蒸器濃縮成浸膏。

2.有機(jī)溶劑梯度萃取

取55克玫瑰渣浸膏，加350ml水分散，使之比重在1.2左右。超聲20分鐘助溶，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯：95％乙醇＝6:2，進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋去水相中的殘留的有機(jī)溶劑。合并各梯度萃取所得，旋去有機(jī)溶劑后，于55℃烘箱里干燥至恒重。乙酸乙酯和乙酸乙酯：95％乙醇＝6:2兩個(gè)萃取部位命名為drfr-a和drfr-b。

3.玫瑰多糖的分離與純化

將萃取剩下的水相，加適量95％乙醇，使乙醇濃度為85％左右。靜置一夜，抽濾得到粗多糖沉淀，命名為drfr-c部位。55℃烘箱干燥至恒重。

4.多糖沉淀后溶液的處理

85％醇沉粗多糖后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱中干燥至恒重。此部位命名為drfr-d。

5.各部位萃取的平均得率

重復(fù)三次，計(jì)算各次各部位的得率，算出此萃取方法的平均得率。

6.結(jié)果與討論

6.1玫瑰渣組織破碎提取得膏率

玫瑰渣經(jīng)多級(jí)閃蒸器提取后，得膏852克。得膏率＝得膏量/玫瑰渣質(zhì)量＝852/8000＝10.65％.

6.2各梯度有機(jī)溶劑萃取得率

6.2.1乙酸乙酯萃取部位(drfr-a)得率

表1drfr-a萃取次數(shù)與所用溶劑量(ml)

本梯度共萃取9次，第9次，用乙酸乙酯:丙酮：10％甲酸＝8:2:0.4作展開劑，tlc檢測(cè)，三氯化鐵顯色，第9次時(shí)，幾乎在薄層板上不顯色，表明量已很少，此相萃取結(jié)束。合并9次濾液，旋去有機(jī)溶劑，55℃烘箱干燥至恒重得乙酸乙酯部位干物質(zhì)1.4512克。得率為2.697％.

6.2.2乙酸乙酯：95％乙醇＝6：2萃取部位(drfr-b)得率

表2drfr-b萃取次數(shù)與所用溶劑量(ml)

本梯度共萃取20次，用乙酸乙酯：甲醇：水＝5:2:1作為tlc展開劑，三氯化鐵顯色，檢視發(fā)現(xiàn)，第20次時(shí)，主斑點(diǎn)顏色與第一次比較顏色很淡，幾乎無色。標(biāo)志著此梯度萃取結(jié)束。合并20次濾液，旋去有機(jī)溶劑，55℃烘箱干燥至恒重時(shí)得此部位干物質(zhì)為5.0413克。得率為9.370％.

6.3玫瑰粗多糖(drfr-c)的分離

80％乙醇沉淀得到的玫瑰粗多糖55℃烘箱干燥至恒重后為7.2859克。得率為13.54％。

6.4萃取各部位的平均得率

表3萃取各部位的平均得率

上表中，對(duì)不同浸膏量萃取三次，drfr-a,drfr-b和drfr-c平均得率為4.105％，9.381％和11.782％。

實(shí)施例2

一、玫瑰花渣活性部位萃取方法，步驟如下：

(1)玫瑰花渣浸膏的制備：取玫瑰花渣，加入11倍質(zhì)量的酶解液，浸泡55min，組織破碎法提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，合并濾液，經(jīng)多級(jí)閃蒸器回收溶劑，濃縮成膏。所述酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5。

(2)梯度萃取玫瑰花渣浸膏，分離有機(jī)相和水相，從有機(jī)相得到活性部位drfr-a和活性部位drfr-b：取經(jīng)步驟(1)得到的玫瑰花渣浸膏，加水制成混懸，使之比重在1.2，分別用乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，回收有機(jī)溶劑，于55℃烘箱里干燥至恒重，將經(jīng)乙酸乙酯溶液萃取的活性部位命名為drfr-a，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液萃取的活性部位命名為drfr-b。所述乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液均采用梯度溶劑量進(jìn)行萃?。灰宜嵋阴ィ阂掖嫉捏w積比為7:4。

(3)從步驟(2)中的水相中分離沉淀、純化制得活性部位drfr-c：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為85％，靜置11小時(shí)，經(jīng)抽濾得到沉淀，于55℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，將沉淀命名為活性部位drfr-c。

(4)對(duì)步驟(2)中的水相進(jìn)行抽濾并回收濾液、純化制得活性部位drfr-d：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％，靜置10小時(shí)，經(jīng)抽濾后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱里干燥至恒重，將此部位命名為活性部位drfr-d。

二、本發(fā)明制備的玫瑰花渣活性部位作為制備沒食子酸結(jié)晶的應(yīng)用。

1、沒食子酸結(jié)晶的制備方法如下：

(1)在drfr-a部位中加入石油醚-乙酸乙酯混合溶劑制得drfr-a混合液，超聲萃取3次后，剩下的部分用體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇溶解得混合液ⅱ，濃縮至混合液ⅱ體積的1/2，移至4℃冰箱內(nèi)靜置12h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品；石油醚：乙酸乙酯的體積比為10:7，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的加入量為：以1gdrfr-a部位為基準(zhǔn)，加入4ml石油醚-乙酸乙酯混合溶劑；

(2)取步驟(1)制得的沒食子酸粗品，用二氯甲烷-甲醇混合溶劑溶解后，于17℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，收集瓶壁上的針狀晶體；二氯甲烷：甲醇的體積比為14:3，二氯甲烷-甲醇混合溶劑的加入量：以1g沒食子酸粗品為基準(zhǔn)，加入7ml二氯甲烷-甲醇混合溶劑。

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸結(jié)晶。

實(shí)施例3

一、玫瑰花渣活性部位萃取方法，步驟如下：

(1)玫瑰花渣浸膏的制備：取玫瑰花渣，加入9倍質(zhì)量的酶解液，浸泡50min，組織破碎法提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，合并濾液，經(jīng)多級(jí)閃蒸器回收溶劑，濃縮成膏。所述酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5。

(2)梯度萃取玫瑰花渣浸膏，分離有機(jī)相和水相，從有機(jī)相得到活性部位drfr-a和活性部位drfr-b：取經(jīng)步驟(1)得到的玫瑰花渣浸膏，加水制成混懸，使之比重在1.2，分別用乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，回收有機(jī)溶劑，于55℃烘箱里干燥至恒重，將經(jīng)乙酸乙酯溶液萃取的活性部位命名為drfr-a，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液萃取的活性部位命名為drfr-b。所述乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液均采用梯度溶劑量進(jìn)行萃??；乙酸乙酯：乙醇的體積比為9:2。

(3)從步驟(2)中的水相中分離沉淀、純化制得活性部位drfr-c：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80％，靜置9小時(shí)，經(jīng)抽濾得到沉淀，于55℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，將沉淀命名為活性部位drfr-c。

(4)對(duì)步驟(2)中的水相進(jìn)行抽濾并回收濾液、純化制得活性部位drfr-d：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％，靜置9小時(shí)，經(jīng)抽濾后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱里干燥至恒重，將此部位命名為活性部位drfr-d。

二、本發(fā)明制備的玫瑰花渣活性部位作為制備沒食子酸結(jié)晶的應(yīng)用。

1、沒食子酸結(jié)晶的制備方法如下：

(1)在drfr-a部位中加入石油醚-乙酸乙酯混合溶劑制得drfr-a混合液，超聲萃取4次后，剩下的部分用體積分?jǐn)?shù)為55％的乙醇溶解得混合液ⅱ，濃縮至混合液ⅱ體積的3/8，移至4℃冰箱內(nèi)靜置16h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品；石油醚：乙酸乙酯的體積比為6:5，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的加入量為：以1gdrfr-a部位為基準(zhǔn)，加入7ml石油醚-乙酸乙酯混合溶劑；

(2)取步驟(1)制得的沒食子酸粗品，用二氯甲烷-甲醇混合溶劑溶解后，于17℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，收集瓶壁上的針狀晶體；二氯甲烷：甲醇的體積比為17:3，二氯甲烷-甲醇混合溶劑的加入量：以1g沒食子酸粗品為基準(zhǔn)，加入7ml二氯甲烷-甲醇混合溶劑。

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸結(jié)晶。

實(shí)施例4

一、玫瑰花渣活性部位萃取方法，步驟如下：

(1)玫瑰花渣浸膏的制備：取玫瑰花渣，加入10倍質(zhì)量的酶解液，浸泡45min，組織破碎法提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，合并濾液，經(jīng)多級(jí)閃蒸器回收溶劑，濃縮成膏。所述酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5。

(2)梯度萃取玫瑰花渣浸膏，分離有機(jī)相和水相，從有機(jī)相得到活性部位drfr-a和活性部位drfr-b：取經(jīng)步驟(1)得到的玫瑰花渣浸膏，加水制成混懸，使之比重在1.2，分別用乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，回收有機(jī)溶劑，于55℃烘箱里干燥至恒重，將經(jīng)乙酸乙酯溶液萃取的活性部位命名為drfr-a，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液萃取的活性部位命名為drfr-b。所述乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液均采用梯度溶劑量進(jìn)行萃?。灰宜嵋阴ィ阂掖嫉捏w積比為5:8。

(3)從步驟(2)中的水相中分離沉淀、純化制得活性部位drfr-c：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％，靜置10小時(shí)，經(jīng)抽濾得到沉淀，于55℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，將沉淀命名為活性部位drfr-c。

(4)對(duì)步驟(2)中的水相進(jìn)行抽濾并回收濾液、純化制得活性部位drfr-d：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％，靜置10小時(shí)，經(jīng)抽濾后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱里干燥至恒重，將此部位命名為活性部位drfr-d。

二、本發(fā)明制備的玫瑰花渣活性部位作為制備沒食子酸結(jié)晶的應(yīng)用。

1、沒食子酸結(jié)晶的制備方法如下：

(1)在drfr-a部位中加入石油醚-乙酸乙酯混合溶劑制得drfr-a混合液，超聲萃取4次后，剩下的部分用體積分?jǐn)?shù)為60％的乙醇溶解得混合液ⅱ，濃縮至混合液ⅱ體積的5/12，移至4℃冰箱內(nèi)靜置15h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品；石油醚：乙酸乙酯的體積比為8:5，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的加入量為：以1gdrfr-a部位為基準(zhǔn)，加入6ml石油醚-乙酸乙酯混合溶劑；

(2)取步驟(1)制得的沒食子酸粗品，用二氯甲烷-甲醇混合溶劑溶解后，于15℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，收集瓶壁上的針狀晶體；二氯甲烷：甲醇的體積比為15:2.5，二氯甲烷-甲醇混合溶劑的加入量：以1g沒食子酸粗品為基準(zhǔn)，加入5ml二氯甲烷-甲醇混合溶劑。

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸結(jié)晶。

實(shí)施例5

一、玫瑰花渣活性部位萃取方法，步驟如下：

(1)玫瑰花渣浸膏的制備：取玫瑰花渣，加入8倍質(zhì)量的酶解液，浸泡30min，組織破碎法提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，合并濾液，經(jīng)多級(jí)閃蒸器回收溶劑，濃縮成膏。所述酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5。

(2)梯度萃取玫瑰花渣浸膏，分離有機(jī)相和水相，從有機(jī)相得到活性部位drfr-a和活性部位drfr-b：取經(jīng)步驟(1)得到的玫瑰花渣浸膏，加水制成混懸，使之比重在1.0，分別用乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，回收有機(jī)溶劑，于55℃烘箱里干燥至恒重，將經(jīng)乙酸乙酯溶液萃取的活性部位命名為drfr-a，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液萃取的活性部位命名為drfr-b。所述乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液均采用梯度溶劑量進(jìn)行萃??；乙酸乙酯：乙醇的體積比為1:10。

(3)從步驟(2)中的水相中分離沉淀、純化制得活性部位drfr-c：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65％，靜置8小時(shí)，經(jīng)抽濾得到沉淀，于55℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，將沉淀命名為活性部位drfr-c。

(4)對(duì)步驟(2)中的水相進(jìn)行抽濾并回收濾液、純化制得活性部位drfr-d：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65％，靜置8小時(shí)，經(jīng)抽濾后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱里干燥至恒重，將此部位命名為活性部位drfr-d。

二、本發(fā)明制備的玫瑰花渣活性部位作為制備沒食子酸結(jié)晶的應(yīng)用。

1、沒食子酸結(jié)晶的制備方法如下：

(1)在drfr-a部位中加入石油醚-乙酸乙酯混合溶劑制得drfr-a混合液，超聲萃取3次后，剩下的部分用體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇溶解得混合液ⅱ，濃縮至混合液ⅱ體積的1/2，移至4℃冰箱內(nèi)靜置12h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品；石油醚：乙酸乙酯的體積比為1:10，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的加入量為：以1gdrfr-a部位為基準(zhǔn)，加入4ml石油醚-乙酸乙酯混合溶劑；

(2)取步驟(1)制得的沒食子酸粗品，用二氯甲烷-甲醇混合溶劑溶解后，于10℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，收集瓶壁上的針狀晶體；二氯甲烷：甲醇的體積比為10:0.5，二氯甲烷-甲醇混合溶劑的加入量：以1g沒食子酸粗品為基準(zhǔn)，加入4ml二氯甲烷-甲醇混合溶劑。

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸結(jié)晶。

實(shí)施例6

一、玫瑰花渣活性部位萃取方法，步驟如下：

(1)玫瑰花渣浸膏的制備：取玫瑰花渣，加入12倍質(zhì)量的酶解液，浸泡60min，組織破碎法提取3次，每次3分鐘，用八層紗布過濾，合并濾液，經(jīng)多級(jí)閃蒸器回收溶劑，濃縮成膏。所述酶解液為2w/v％纖維素酶、1w/v％半纖維素酶、0.5w/v％果膠酶、0.5w/v％離析酶，ph為6.5。

(2)梯度萃取玫瑰花渣浸膏，分離有機(jī)相和水相，從有機(jī)相得到活性部位drfr-a和活性部位drfr-b：取經(jīng)步驟(1)得到的玫瑰花渣浸膏，加水制成混懸，使之比重在1.3，分別用乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液進(jìn)行萃取，萃取結(jié)束后，回收有機(jī)溶劑，于55℃烘箱里干燥至恒重，將經(jīng)乙酸乙酯溶液萃取的活性部位命名為drfr-a，經(jīng)乙酸乙酯-乙醇混合溶液萃取的活性部位命名為drfr-b。所述乙酸乙酯溶液和乙酸乙酯-乙醇混合溶液均采用梯度溶劑量進(jìn)行萃?。灰宜嵋阴ィ阂掖嫉捏w積比為10:1。

(3)從步驟(2)中的水相中分離沉淀、純化制得活性部位drfr-c：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為85％，靜置12小時(shí)，經(jīng)抽濾得到沉淀，于55℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，將沉淀命名為活性部位drfr-c。

(4)對(duì)步驟(2)中的水相進(jìn)行抽濾并回收濾液、純化制得活性部位drfr-d：將經(jīng)步驟(2)萃取剩下的水相加入體積分?jǐn)?shù)為95％乙醇，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)為85％，靜置12小時(shí)，經(jīng)抽濾后，對(duì)抽濾的溶液進(jìn)行旋干，于55℃烘箱里干燥至恒重，將此部位命名為活性部位drfr-d。

二、本發(fā)明制備的玫瑰花渣活性部位作為制備沒食子酸結(jié)晶的應(yīng)用。

1、沒食子酸結(jié)晶的制備方法如下：

(1)在drfr-a部位中加入石油醚-乙酸乙酯混合溶劑制得drfr-a混合液，超聲萃取5次后，剩下的部分用體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶解得混合液ⅱ，濃縮至混合液ⅱ體積的1/3，移至4℃冰箱內(nèi)靜置18h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品；石油醚：乙酸乙酯的體積比為10:1，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑的加入量為：以1gdrfr-a部位為基準(zhǔn)，加入8ml石油醚-乙酸乙酯混合溶劑；

(2)取步驟(1)制得的沒食子酸粗品，用二氯甲烷-甲醇混合溶劑溶解后，于20℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，收集瓶壁上的針狀晶體；二氯甲烷：甲醇的體積比為20:4.5，二氯甲烷-甲醇混合溶劑的加入量：以1g沒食子酸粗品為基準(zhǔn)，加入8ml二氯甲烷-甲醇混合溶劑。

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸結(jié)晶。

效果實(shí)施例1：作為抗氧化物的應(yīng)用鑒定

1.試驗(yàn)材料

1.1原料

實(shí)施例1制備的：drfr-a，drfr-b，drfr-c。

1.2試劑

abts，k2s2o8，甲醇，磷酸鹽緩沖液，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)，維生素c(純度99％)，水楊酸，無水乙醇等(試劑均為分析純)。

1.3主要儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋，uv－2550紫外分光光度計(jì)(日本島津)，phs－25型數(shù)顯ph計(jì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(re-52系列)，高速離心機(jī)。

2試驗(yàn)方法

2.1溶液的配制

樣品溶液的配制：精密稱取drfr-a，drfr-b，drfr-c和vc(陽性對(duì)照)各50.0000mg，用少量dmso溶解后，補(bǔ)加超純水，定容至25ml，使之濃度均為2mg/ml。取96孔板，將2mg/ml的drfr-a，drfr-b，drfr-c和vc用連續(xù)稀釋法分別稀釋至2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125mg/ml，共八個(gè)濃度梯度。

dpph溶液的配制：精密稱取5mgdpph于250ml容量瓶中，無水乙醇定容至250ml，使其濃度為0.05mmol/ml。

abts溶液的配制：將5ml7mmol/labts和88μl140mmol/l過硫酸鉀溶液混合,在室溫、避光條件下靜置過夜(12h-16h)，形成abts+儲(chǔ)備液，該儲(chǔ)備液在室溫、避光的條件下可穩(wěn)定3h-4h，使用前用磷酸鹽緩沖液(10mmol/l，ph7.4)稀釋成工作液，要求其在734nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.70±0.02。

2.2dpph法及最大吸收波長(zhǎng)的確定

吸取3mldpph溶液于1cm比色皿中，用無水乙醇做對(duì)照，在200～800nm間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定本設(shè)備本實(shí)驗(yàn)條件下的最大吸收波長(zhǎng)為515nm。如圖1所示。在確立了最大吸收波長(zhǎng)之后，用移液槍吸取0.05mmol/ml的dpph溶液2.906ml于5mlep管中，然后再往每個(gè)含有dpph溶液的ep管中精密加入96μl不同濃度梯度的樣品，最終，與dpph反應(yīng)時(shí)，樣品的終濃度為0.064，0.032，0.016，0.008，0.004，0.002，0.001，0.0005mg/ml。室溫下避光靜置30min后，在515nm處測(cè)量其吸光度as,對(duì)照樣本用無水乙醇代替提取物,以乙醇為空白樣品，測(cè)得吸光度a0。以vc為陽性對(duì)照，用去離子水配制成與樣品同等質(zhì)量濃度的對(duì)照液。蒸餾水做空白對(duì)照。各測(cè)定三次取平均值，并計(jì)算自由基清除率。

對(duì)dpph自由基的清除率按下式計(jì)算:

ao為空白對(duì)照樣品的吸光度；as為待測(cè)樣品的吸光度。

2.3abts法

吸取3mlabts溶液于1cm比色皿中，用超純水做對(duì)照，在200～800nm間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定本設(shè)備本實(shí)驗(yàn)條件下的最大吸收波長(zhǎng)位753nm。如圖2所示。用移液槍吸取吸光度為0.7±0.02的abts溶液2.906ml于5mlep管中，然后再往每個(gè)含有abts溶液的ep管中精密加入96μl不同濃度梯度的樣品，最終，與abts反應(yīng)時(shí)，樣品的終濃度為0.064，0.032，0.016，0.008，0.004，0.002，0.001，0.0005mg/ml。準(zhǔn)確振蕩30s，靜置6mim后測(cè)753nm波長(zhǎng)處的吸光度。以vc為陽性對(duì)照，用去離子水配制成與樣品同等質(zhì)量濃度的對(duì)照液。蒸餾水做空白對(duì)照。各測(cè)定三次取平均值，并計(jì)算自由基清除率。

對(duì)abts的清除率按下式計(jì)算:

ao為空白對(duì)照樣品的吸光度；as為待測(cè)樣品的吸光。

2.4羥自由基清除實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)方法配制，用移液槍吸取1ml6mmol/l的硫酸亞鐵溶液，1ml6mmol/l的水楊酸(用乙醇溶解)，1ml6mmol/l的過氧化氫溶液于5mlep管中，37度保溫30min后，倒于1cm比色皿中，用超純水做對(duì)照，在200～800nm間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定本設(shè)備本實(shí)驗(yàn)條件下的最大吸收波長(zhǎng)位526nm。如圖3所示。然后按上述方法，往每個(gè)含有3ml工作液的ep管中精密加入100μl不同濃度梯度的樣品，最終反應(yīng)時(shí)，樣品的終濃度近似為0.064，0.032，0.016，0.008，0.004，0.002，0.001，0.0005mg/ml。以去離子水為對(duì)照，空白組去離子水代替水楊酸，用vc作陽性對(duì)照做三次平行實(shí)驗(yàn)。37℃水浴30min，在526nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。其清除率計(jì)算公式為：

其中a0為空白對(duì)照的吸光值，ax為加樣品的吸光值，ax0為不加顯色劑h2o2時(shí)的吸光值。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1對(duì)dpph的清除效果

表4玫瑰渣萃取各部位與vc對(duì)dpph的清除能力比較

表4.中drfr-a，drfr-b，drfr-c的ic50值均大于vc的ic50值。說明此三個(gè)萃取部位對(duì)dpph清除的能力相對(duì)弱于vc。它們對(duì)dpph清除能力從大到小依次為:vc＞drfr-a＞drfr-b＞drfr-c。從數(shù)值上來看，同等濃度的drfr-a與vc對(duì)dpph清除能力較為相近。各部位對(duì)dpph自由基的清除效果關(guān)系如圖4所示。它們均有一定的清除dpph自由基的能力。且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各成分隨濃度的不斷增大，其對(duì)dpph自由基的清除效果呈不斷增加的趨勢(shì)。

3.2對(duì)abts的清除效果

表5玫瑰渣萃取各部位與vc對(duì)abts的清除能力比較

表5中drfr-a，drfr-b，drfr-c的ic50值均大于vc的ic50值。說明此三個(gè)萃取部位對(duì)abts清除的能力相對(duì)弱于vc。它們對(duì)abts清除能力從大到小依次為:vc＞drfr-a＞drfr-b＞drfr-c。從數(shù)值上來看，同等濃度drfr-a與vc對(duì)abts清除能力幾乎相當(dāng)。各部位對(duì)abts清除效果關(guān)系如圖5所示。它們均有一定的清除abts的能力，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各成分隨濃度的不斷增大，其對(duì)abts的清除效果呈不斷增加的趨勢(shì)。

3.3對(duì)羥自由基的清除效果

表6玫瑰渣萃取各部位與vc和羥自由基反應(yīng)時(shí)的吸光度

表6中，理論上隨著drfr-a，drfr-b，drfr-c濃度的升高，吸光度的數(shù)值應(yīng)逐漸變小，然后趨于穩(wěn)定，而本實(shí)驗(yàn)中，卻出現(xiàn)了吸光度隨濃度升高而增大的“反?！壁厔?shì)，而vc卻表現(xiàn)出了正常的趨勢(shì)，見圖6。

觀察發(fā)現(xiàn)，drfr-a，drfr-b，drfr-c三個(gè)部位與羥自由基反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生了藍(lán)黑色的沉淀，并且濃度越高，產(chǎn)生的沉淀越多，從而導(dǎo)致了吸光度逐漸增大的“反?！壁厔?shì)。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，玫瑰渣萃取的三個(gè)部位中含有大量的酚類成分，與fe³⁺反應(yīng)能產(chǎn)生藍(lán)黑色沉淀，故猜測(cè)，本實(shí)驗(yàn)中羥自由基生成過程中的fe³⁺與drfr-a，drfr-b，drfr-c的酚類發(fā)生了反應(yīng)，產(chǎn)生了藍(lán)黑色沉淀，且drfr-b比drfr-a含有更多的酚類物質(zhì)。

4.結(jié)論

實(shí)施例1制備的玫瑰渣三個(gè)萃取部位(drfr-a，drfr-b，drfr-c)均有一定的抗氧化能力，通過dpph和abts自由基清除實(shí)驗(yàn)，以vc為陽性對(duì)照，可以得出抗氧化能力vc＞drfr-a＞drfr-b＞drfr-c，其中，在abts自由基清除能力上，vc與drfr-a效果幾乎相當(dāng)。

5.注意事項(xiàng)

(1)abts儲(chǔ)備液的配置需遮光靜置12h-16h，儲(chǔ)備液于-20℃保存。

(2)dpph應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，因其見光受熱均易變質(zhì)。

(3)此實(shí)驗(yàn)各步驟均應(yīng)在避光條件下做。

效果實(shí)施例2：抗黑色素功能的鑒定

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)施例1制備的：drfr–a。

1.2試劑

l-dopa，酪氨酸酶(tyrosinase，tyr)(ec.1.14.8.1)，磷酸鈉鹽緩沖液(ph6.8)，dmso(分析純)，超純水，曲酸。

1.3主要儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋，酶標(biāo)儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(re-52系列)，循環(huán)水式多用真空泵，高速離心機(jī)，精密分析天平，超純水制備系統(tǒng)。

1.4試劑的配制

磷酸鈉緩沖液(1/15m，ph＝6.8)：精確稱取0.5000g磷酸二氫鈉，0.5930g磷酸氫二鈉，加入少量去離子水溶解后，定容至250ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

l-dopa溶液(7.5mmol/l)：精確稱取l-dopa0.074g，加去離子水約25ml，微熱完全溶解后，加去離子水定容至50ml。

受試液：精確稱取drfr–a0.1001g，分別溶于20mldmso，得到5mg/ml的待測(cè)液，再對(duì)倍稀釋到2.5、1.25、0.625、0.3125mg/ml，共5個(gè)濃度梯度。

陽性對(duì)照：精確稱取0.1001g曲酸粉末，溶于20ml的去離子水中，得到5mg/ml的陽性對(duì)照母液，再對(duì)倍稀釋到2.5mg/ml、1.2500mg/ml、0.6250mg/ml、0.3125mg/ml，共5個(gè)濃度梯度。

酪氨酸酶溶液(5×10^-6mol/l)：精密稱取0.0032g酪氨酸酶，加緩沖溶液定容至5ml，使其摩爾濃度為5×10^-6mol/l。

1.5酪氨酸酶活性測(cè)定

設(shè)空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組(曲酸)、drfr-a?？偡磻?yīng)體系為300μl。依次在96孔板中加入酪氨酸酶溶液50μl,，磷酸鹽緩沖液90μl，受試溶液60μl,l-dopa溶液100μl。在此體系中，受試液(包括陽性對(duì)照曲酸)的終濃度梯度為0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/ml。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔，取平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。然后將孔板置于微孔板檢測(cè)系統(tǒng)中(37℃)，于475nm時(shí)測(cè)定波長(zhǎng)處的吸光度值，每隔30s測(cè)一次吸光度，共測(cè)80min。

k是與抑制劑反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程斜率，k0是無抑制劑反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程斜率。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1曲酸抑制酪氨酸酶活性的ic50測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品曲酸抑制酪氨酸酶活性的曲線如圖7所示。以曲酸濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(x)，以對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為y＝0.204ln(x)+0.147，r²＝0.995。

由回歸方程計(jì)算得到，曲酸抑制酪氨酸酶活性的半抑制濃度(ic50)為5.6μg/ml。

2.2drfr-a抑制酪氨酸酶活性的ic50測(cè)定

由圖8可知，隨著濃度的增加，drfr-a對(duì)酪氨酸酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，即抑制率與濃度呈正相關(guān)。根據(jù)3.4.2的計(jì)算方法得到線性方程如圖9所示。以樣品濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)(x)，以對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為y＝1.048x³-1.881x²+1.452x+0.291,r2＝0.987。

由回歸方程計(jì)算得到，drfr-a抑制酪氨酸酶活性的半抑制濃度(ic50)為0.2mg/ml。

3.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以曲酸為陽性對(duì)照，考察了drfr-a部位對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，結(jié)果表明此部位對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用。

效果實(shí)施例3：沒食子酸結(jié)晶純化

(1)取實(shí)施例2制備的：drfr-a部位100g，加入石油醚-乙酸乙酯＝4:1的混合溶劑600ml，于超聲清洗機(jī)中超聲提取15min(此步驟主要是除去一些脂溶性雜質(zhì)，有利于沒食子酸的結(jié)晶純化)。共萃取5次，，混合溶劑萃取后剩下的部分用500ml體積分?jǐn)?shù)為60％的甲醇溶解后，于60～70℃水浴條件下處理6小時(shí)，此時(shí)體積約為250ml,然后移至4℃冰箱內(nèi)靜置12-18h，離心后除去上清液，即得沒食子酸粗品55g；

(2)將步驟(1)制得的沒食子酸粗品55g用550ml二氯：甲醇＝15:1的混合溶劑微熱溶解后，于10～20℃條件下，置于真空箱中，8小時(shí)后，壁上逐漸長(zhǎng)出晶體(約0.5-1cm左右的針狀結(jié)晶)，待溶劑剩余至50ml時(shí)，收集瓶壁上的針狀晶體，稱重約46g；

(3)重復(fù)步驟(2)兩次，收集瓶壁上無色透明的針狀結(jié)晶，即得沒食子酸純品結(jié)晶30.8g如圖11、圖12所示。

hplc測(cè)定沒食子酸方法的建立：色譜條件為：色譜柱：innovationexplorerc18hplccolumn(25cm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1％磷酸＝3:97(v/v)；溫度：30℃；流速：0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm；進(jìn)樣量：10μl；等度洗脫25min，色譜圖如圖10所示。