本發(fā)明屬于眼科疾病治療技術領域，尤其涉及一種雷帕霉素納米膠束滴眼液及其制備方法。

背景技術：

據(jù)統(tǒng)計我國目前約有400萬因角膜疾病致盲的患者，而角膜移植手術是其復明的主要手段。角膜移植手術是用透明的角膜片置換混濁或有病變部分的角膜，以達到增視、治療某些角膜病和改善外觀的目的，是異體移植效果最好的一種手術。但是術后免疫排斥反應的發(fā)生可能會導致角膜植片水腫，甚至混濁，最終導致手術失敗。研究資料顯示，初次進行角膜移植的非高?；颊叩慕悄ぶ财?年存活率達90％，而具有血管化的角膜植床或具有移植排斥病史的高危患者發(fā)生免疫排斥的幾率高達60-100％。因此，角膜植片免疫排斥反應成為制約植片存活時間的關鍵性因素，也是影響移植物遠期存活率的重要因素。

目前，角膜移植的免疫治療藥物主要有環(huán)孢素、他克莫司等。這些藥物可局部或全身應用，使用后可以明顯延長角膜移植術后植片存活時間，但是這些藥物的毒副作用尤其是腎毒性明顯，使這些藥物的臨床應用受到一定限制。雷帕霉素作為一種新型的免疫抑制劑，化學結構與他克莫司相似，但免疫抑制機制與環(huán)孢素和他克莫司截然不同。由于眼球的獨特解剖結構，即存在“血眼屏障”和“角膜屏障”，使得全身用藥和目前的眼用制劑很難達到有效的眼內藥物濃度，制約了雷帕霉素在眼科臨床治療中的應用。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，而提供一種雷帕霉素納米膠束滴眼液的制備方法，制備得到的雷帕霉素納米膠束滴眼液能夠用于防治角膜移植手術后的免疫排斥反應。

本發(fā)明提供了一種雷帕霉素納米膠束滴眼液的制備方法，包括以下步驟：

1)將聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、無水乙醇和葡萄糖混合，得到含有雷帕霉素的混合液；

2)將所述步驟1)得到的含有雷帕霉素的混合液在溫度為38～42℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)55～65min，再在溫度為58～62℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)12～18min成膜；

3)將所述步驟2)得到的膜與磷酸鹽緩沖液混合后，在溫度為38～42℃下水化10～20min，再在溫度為23～27℃下水化170～190min，得到水化后的混合液；

4)將所述步驟3)水化后的混合液冰浴至透明，得到雷帕霉素納米膠束滴眼液。

優(yōu)選的，所述雷帕霉素納米膠束滴眼液中雷帕霉素的質量百分含量為0.37～0.9％。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的雷帕霉素與聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物的質量比為(45～55):(880～920)。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的雷帕霉素的質量與無水乙醇的體積比為(45～55)mg:(8～12)ml。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的雷帕霉素與葡萄糖的質量比為(45～55):(415～435)。

優(yōu)選的，所述步驟2)得到的膜中的雷帕霉素的質量與步驟3)中的磷酸鹽緩沖液的體積比為(45～55)mg:(5～15)ml。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液包括：6.1～6.5mmna2hpo4、13.5～13.9mmnah2po4，所述磷酸鹽緩沖液的ph值為6.0～7.0。

優(yōu)選的，所述冰浴至透明后還包括：將得到的雷帕霉素納米膠束滴眼液再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾。

本發(fā)明還提供了所述滴眼液的制備方法制備得到的雷帕霉素納米膠束滴眼液，包含雷帕霉素、聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、磷酸鹽緩沖液以及葡萄糖。

本發(fā)明提供了一種雷帕霉素納米膠束滴眼液的制備方法，包括以下步驟：1)將聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、無水乙醇和葡萄糖混合，得到含有雷帕霉素的混合液；2)將所述步驟1)得到的含有雷帕霉素的混合液在溫度為38～42℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)55～65min，再在溫度為58～62℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)12～18min成膜；3)將所述步驟2)得到的膜與磷酸鹽緩沖液混合后，在溫度為38～42℃下水化10～20min，再在溫度為23～27℃下水化170～190min，得到水化后的混合液；4)將所述步驟3)水化后的混合液冰浴至透明，得到雷帕霉素納米膠束滴眼液。以聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物為藥物載體得到的納米膠束滴眼液通過增加雷帕霉素的溶解性、靶向性和組織細胞的相容性等提高其在角膜內的有效藥物濃度，進而有效抑制角膜移植免疫排斥反應。

本發(fā)明實施例的結果顯示：經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液治療后，小鼠和兔角膜植片持續(xù)維持透明，而未治療組角膜植片渾濁并伴有角膜新生血管；對照組與雷帕霉素治療組的小鼠角膜植片平均存活時間分別為17.17±1.54天和56.50±1.96天，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0001)，對照組與雷帕霉素治療組的兔角膜植片平均存活時間分別為16.17±0.65天和95.20±3.26天，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0001)，表明雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效延長角膜植片的存活時間；雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效減少炎性細胞浸潤、抑制角膜水腫，維持角膜植片的正常結構；經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液治療后，浸潤到角膜植片中的cd11b⁺巨噬細胞、ly6g⁺中性粒細胞、cd11c⁺樹突狀細胞以及cd4⁺t細胞明顯減少。

由此可以得出，雷帕霉素納米膠束滴眼液可用于防治角膜移植手術后的免疫排斥反應。

附圖說明

圖1為雷帕霉素納米膠束滴眼液維持小鼠角膜植片的透明性；

圖2為帕霉素納米膠束滴眼液延長小鼠角膜植片的存活時間；

圖3為雷帕霉素納米膠束滴眼液對小鼠角膜植片病理改變的影響；

圖4為雷帕霉素膠束滴眼液對小鼠角膜植片中炎性細胞浸潤的影響；

圖5為雷帕霉素膠束滴眼液對兔高危角膜移植模型中角膜植片透明性的影響；

圖6為雷帕霉素膠束滴眼液對兔高危移植角膜植片存活時間的影響；

圖7為雷帕霉素納米膠束滴眼液對兔角膜植片中炎性細胞浸潤的影響。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種雷帕霉素納米膠束滴眼液的制備方法，包括以下步驟：

1)將聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、無水乙醇和葡萄糖混合，得到含有雷帕霉素的混合液；

2)將所述步驟1)得到的含有雷帕霉素的混合液在溫度為38～42℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)55～65min，再在溫度為58～62℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)12～18min成膜；

3)將所述步驟2)得到的膜與磷酸鹽緩沖液混合后，在溫度為38～42℃下水化10～20min，再在溫度為23～27℃下水化170～190min，得到水化后的混合液；

4)將所述步驟3)水化后的混合液冰浴至透明，得到雷帕霉素納米膠束滴眼液。

在本發(fā)明中，所述雷帕霉素納米膠束滴眼液中雷帕霉素的質量百分含量優(yōu)選為0.37～0.9％，更優(yōu)選為0.43～0.6％，最優(yōu)選為0.5％。

本發(fā)明將聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、雷帕霉素、無水乙醇和葡萄糖混合，得到含有雷帕霉素的混合液。

在本發(fā)明中，所述雷帕霉素與聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物的質量比優(yōu)選為(45～55):(880～920)，更優(yōu)選為(48～52):(890～910)，最優(yōu)選為50:900；所述雷帕霉素的質量與無水乙醇的體積比優(yōu)選為(45～55)mg:(8～12)ml，更優(yōu)選為(48～52)mg:(9～11)ml，最優(yōu)選為50mg:10ml；所述雷帕霉素與葡萄糖的質量比優(yōu)選為(45～55):(415～435)，更優(yōu)選為(48～52):(420～430)，最優(yōu)選為50:425。本發(fā)明對上述試劑的來源沒有特殊限定，采用本領域技術人員常規(guī)選用的市售產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，所述聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物為basf(中國)有限公司提供

在本發(fā)明中，所述混合優(yōu)選為將所述聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和雷帕霉素溶于無水乙醇中，溶解后再加入葡萄糖混合。

本發(fā)明將得到的含有雷帕霉素的混合液經(jīng)過蒸發(fā)成膜，所述含有雷帕霉素的混合液在溫度為38～42℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)55～65min，再在溫度為58～62℃和壓強為0.085～0.095mpa下蒸發(fā)12～18min；優(yōu)選為在溫度為39～41℃和壓強為0.088～0.092mpa下蒸發(fā)58～62min，再在溫度為59～61℃和壓強為0.088～0.092mpa下蒸發(fā)13～17min；更優(yōu)選為在溫度為40℃和壓強為0.090mpa下蒸發(fā)60min，再在溫度為60℃和壓強為0.090mpa下蒸發(fā)15min。本發(fā)明對所述蒸發(fā)使用的儀器沒有特殊限定，在本發(fā)明實施例中具體采用旋轉蒸發(fā)儀。

本發(fā)明將得到的膜與磷酸緩沖液混合，再經(jīng)過水化，得到水化后的溶液。

在本發(fā)明中，所述膜中的雷帕霉素的質量與磷酸鹽緩沖液的體積比優(yōu)選為(45～55)mg:(5～15)ml，更優(yōu)選為(48～52)mg:(8～12)ml，最優(yōu)選為50mg:10ml。本發(fā)明對上述試劑的來源沒有特殊限定，采用本領域技術人員常規(guī)選用的市售產(chǎn)品即可。

在本發(fā)明中，所述水化的條件包括：在溫度為38～42℃下水化10～20min，再在溫度為23～27℃下水化170～190min；優(yōu)選為在39～41℃下水化12～18min，再在溫度為24～26℃下水化175～185min；更優(yōu)選為在40℃下水化15min，再在溫度為25℃下水化180min。

在本發(fā)明中，所述磷酸鹽緩沖液優(yōu)選包括：6.1～6.5mmna2hpo4、13.5～13.9mmnah2po4，更優(yōu)選包括6.15～6.4mmna2hpo4、13.6～13.8mmnah2po4，最優(yōu)選包括6.301mmna2hpo4、13.703mmnah2po4；所述磷酸鹽的ph值優(yōu)選為6.0～7.0，更優(yōu)選為6.3～6.8，最優(yōu)選為6.5。

本發(fā)明將水化后的溶液置于冰上，進行冰浴，直至水化后的溶液透明，得到雷帕霉素納米膠束滴眼液。在本發(fā)明中，所述冰浴的時間優(yōu)選為180～480min，更優(yōu)選為240～420min，最優(yōu)選為360min。

在本發(fā)明中，所述冰浴至透明后優(yōu)選還包括：將得到的雷帕霉素納米膠束滴眼液再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾。

本發(fā)明將經(jīng)過微孔濾膜過濾的雷帕霉素納米膠束滴眼液用無菌磷酸鹽溶液稀釋，得到雷帕霉素的質量百分含量為0.1％的雷帕霉素納米膠束滴眼液，所述經(jīng)磷酸鹽溶液稀釋后的雷帕霉素納米膠束滴眼液的ph值優(yōu)選為6.5～7.0，更優(yōu)選為6.7～6.8。

在本發(fā)明中，所述無菌磷酸鹽溶液優(yōu)選包括：6.1～6.5mmna2hpo4、13.5～13.9mmnah2po4，更優(yōu)選為6.15～6.4mmna2hpo4、13.6～13.8mmnah2po4，最優(yōu)選為6.301mmna2hpo4、13.703mmnah2po4。在本發(fā)明中，將配置好的磷酸鹽緩沖溶液采用0.22μm微孔濾膜過濾，得到無菌磷酸鹽緩沖溶液。

本發(fā)明還提供了上述技術方案制備得到的雷帕霉素納米膠束滴眼液，包含雷帕霉素、聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、磷酸鹽緩沖液和葡萄糖。

下面結合實施例對本發(fā)明提供的一種雷帕霉素納米膠束滴眼液及其制備方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

將900.0mg聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和50.0mg雷帕霉素溶于10.0ml無水乙醇，充分溶解后加入425.0mg的葡萄糖混合；再置于旋轉蒸發(fā)儀上，在溫度為40.0℃、壓強為0.09mpa的條件下蒸發(fā)60.0min，隨后在溫度為60.0℃、壓強為0.09mpa的條件下蒸發(fā)15.0min成膜；再加入10.0ml磷酸鹽緩沖液，然后在40.0℃下水化15.0min，再在25℃下水化180.0min；再冰浴至溶液透明，獲得雷帕霉素的質量百分含量為0.5％的納米膠束滴眼液；滴眼液采用0.22μm微孔濾膜無菌過濾后，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋，得到雷帕霉素質量百分含量為0.1％的納米膠束滴眼液，調節(jié)滴眼液的ph值為6.8。

磷酸鹽緩沖溶液包括：na2hpo4·12h2o6.301mm，nah2po4·2h2o13.703mm，ph6.5。

實施例2

將920.0mg聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和55.0mg雷帕霉素溶于12.0ml無水乙醇，充分溶解后加入425.0mg的葡萄糖混合；再置于旋轉蒸發(fā)儀上，在溫度為42.0℃、壓強為0.09mpa的條件下蒸發(fā)65.0min，隨后在溫度為62.0℃、壓強為0.09mpa的條件下蒸發(fā)20.0min成膜；再加入10.0ml磷酸鹽緩沖液，然后在42.0℃下水化20.0min，再在25℃下水化190.0min；再冰浴至溶液透明，獲得雷帕霉素的質量百分含量為0.55％的納米膠束滴眼液；滴眼液采用0.22μm微孔濾膜無菌過濾后，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋，得到雷帕霉素質量百分含量為0.1％的納米膠束滴眼液，調節(jié)滴眼液的ph值為7.0。

磷酸鹽緩沖溶液包括：na2hpo4·12h2o6.301mm，nah2po4·2h2o13.703mm，ph6.5。

實施例3

將880.0mg聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物和45.0mg雷帕霉素溶于10.0ml無水乙醇，充分溶解后加入425.0mg的葡萄糖混合；再置于旋轉蒸發(fā)儀上，在溫度為38.0℃、壓強為0.09mpa的條件下蒸發(fā)55.0min，隨后在溫度為58.0℃、壓強為0.09mpa的條件下蒸發(fā)12.0min成膜；再加入10.0ml磷酸鹽緩沖液，然后在38.0℃下水化10.0min，再在25℃下水化170.0min；再冰浴至溶液透明，獲得雷帕霉素的質量百分含量為0.45％的納米膠束滴眼液；滴眼液采用0.22μm微孔濾膜無菌過濾后，再用無菌磷酸鹽緩沖液稀釋，得到雷帕霉素質量百分含量為0.1％的納米膠束滴眼液，調節(jié)滴眼液的ph值為6.5。

磷酸鹽緩沖溶液包括：na2hpo4·12h2o6.301mm，nah2po4·2h2o13.703mm，ph6.5。

實施例4實施例1制備得到的0.1％雷帕霉素納米膠束滴眼液可維持小鼠角膜植片的透明性

(1)小鼠穿透性角膜移植模型構建：

以c57bl/6小鼠為角膜供體、balb/c小鼠作為角膜移植的受體構建穿透性角膜移植模型，主要手術過程如下：

①散瞳：于角膜移植術前1天用1％阿托品眼膏涂眼1次，術前1小時用復方托吡卡胺眼液點眼0.005ml×2次，使瞳孔散大；

②麻醉與消毒：鹽酸氯胺酮注射液和鹽酸氯丙嗪注射液混合液行腹腔注射麻醉(0.45ml/只小鼠)，倍諾喜滴眼液表面麻醉0.005ml×3次，并用0.5％安爾碘ⅲ型(無醇型)消毒術眼及周圍毛發(fā)；

③供體角膜植片制作：手術全過程在顯微鏡下進行，顯微鏡的放大倍率為16倍；取直徑為2mm的環(huán)鉆于供體小鼠角膜中央鉆切直至角膜某象限穿通，然后眼前房注入眼用無菌粘彈劑，維納斯剪取下角膜植片，放置于hbss緩沖液中備用成分：nacl137mm，kcl5.4mm，mgso4.7h2o6.301mm，mgcl2.6h2o0.5mm，na2hpo4·2h2o0.3mm，kh2po40.4mm，葡萄糖5.6mm，cacl21.3mm，nahco34.2mm)；

④角膜植床制備：取同樣大小的環(huán)鉆在角膜中央鉆切，達角膜1/2深度左右時，用15度角的剪刀斜形加深切口并入前房，然后用維納斯剪沿切口剪下角膜片，使植床邊緣為一斜面；

⑤植片縫合：將供體角膜植片置于植床上，11-0尼龍線8-12針間斷縫合并使線結外漏；32號針頭注入無菌空氣形成前房；涂0.3％氧氟沙星眼膏，10-0縫線間斷1-2針縫合眼瞼。術后繼續(xù)涂0.3％氧氟沙星眼膏，每日2-3次，3天拆除眼瞼縫線，7天拆除角膜縫線。

(2)實驗分組及藥物干預

將角膜移植后的小鼠隨機分為對照組和實驗組；對照組利用不含雷帕霉素的空載納米膠束滴眼液進行點眼治療，每次大約0.005ml，每天3次，實驗組用0.1％的雷帕霉素納米膠束滴眼液進行點眼治療，每次大約0.005ml，每天3次，連續(xù)點眼60天，并采用裂隙燈觀察角膜植片的透明性，結果見圖1。

根據(jù)圖1可以得出，經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液治療后，小鼠角膜植片持續(xù)維持透明，而對照組角膜植片渾濁并伴有角膜新生血管。

實施例5實施例1制備的雷帕霉素納米膠束滴眼液有效延長小鼠角膜植片的存活時間

具體操作同實施例4，利用裂隙燈實時觀察每組小鼠角膜植片渾濁度的變化，連續(xù)觀察60天，并記錄角膜植片發(fā)生渾濁的時間，然后利用kaplan-meier統(tǒng)計學方法繪制角膜植片生存曲線，結果見圖2。

根據(jù)圖2可以得出，對照組的角膜植片平均存活時間為17.17±1.54天，雷帕霉素納米膠束滴眼液治療組的角膜植片平均存活時間為56.50±1.96天，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0001)，表明雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效延長角膜植片的存活時間。

實施例6：實施例1制備的雷帕霉素納米膠束滴眼液對小鼠角膜植片病理改變的影響

具體操作同實施例4，于角膜移植術后的第60天取小鼠眼球并用后續(xù)的角膜植片病理改變分析。

(1)小鼠眼球組織石蠟標本制作

①標本固定：將眼球浸泡在4％多聚甲醛內，4℃下固定24h；

②脫水：75％乙醇2h；85％乙醇2h；90％乙醇1.5h；95％乙醇1h；無水乙醇1h×2次；

③透明：無水乙醇/二甲苯(1:1)15min；二甲苯15min×2次；

④浸蠟：石蠟在52-58℃下處理45min，然后再在52-58℃下處理15min；

⑤包埋：將眼球以眼軸水平位置于一次性包埋盒中，加入熱石蠟使其沒過組織，待蠟表面凝固后輕輕將石蠟標本轉移到冰上，加速凝固；

⑥切片：石蠟切片機切取5μm厚度切片，然后置于40℃水浴展片鍋內，用平鑷輕輕分開蠟片，載玻片撈取蠟片，并將其置于60℃烘片機，烤片30-60min；

(2)蘇木素-伊紅染色

①脫蠟：將石蠟切片置于二甲苯溶液中脫蠟10min×3次；

②水化：無水乙醇溶液2min；95％乙醇溶液2min；80％乙醇溶液2min；蒸餾水沖洗；

③蘇木素染色：蘇木素染液5-10min，水洗；1％鹽酸乙醇溶液分化40秒左右；0.5％-1％氨水返藍，至細胞核呈藍色；

④伊紅染色：流水沖洗2min，伊紅染色2-5min；

⑤脫水：80％乙醇溶液1min；90％乙醇溶液1min；95％乙醇溶液1min；無水乙醇溶液1min；

⑥封片與鏡檢：中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，結果見圖3。

根據(jù)圖3可以得出，與對照組相比較，雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效減少炎性細胞浸潤、抑制角膜水腫，維持角膜植片的正常結構。

實施例7實施例1制備的雷帕霉素膠束滴眼液對小鼠角膜植片中炎性細胞浸潤的影響

具體操作同實施例4，于角膜移植術后第60天取小鼠眼球用于制備冰凍切片并通過免疫熒光技術分析角膜植片中炎性細胞浸潤情況。

(1)冰凍切片制備

將眼球以眼軸水平位包埋于oct冰凍切片包埋劑中，置于-80℃冰箱中保存，切片時將標本置于冰凍切片機內，制作厚度為7μm的冰凍切片并貼附于多聚賴氨酸包被的防脫載玻片上，存入-20℃冰箱待染。

(2)免疫熒光技術

①冷凍膠清除：切片自-20℃冰箱取出后，室溫復溫30min；pbs洗5min×3次，去除殘留的冷凍膠；

②固定：4％的多聚甲醛固定15min，pbs洗5min×3次；

③透化：0.1％tritonx-100透化5min，pbs洗5min×3次；

④封閉：免疫組化筆在標本周圍劃圈，滴加5％bsa，室溫封閉1h；

⑤抗體孵育：分別滴加抗cd11b、ly6g、cd11c以及cd4的抗體(稀釋比例為1:100-1:200)，4℃濕盒內孵育過夜；

⑥熒光標記二抗孵育：pbs洗5min×3次，滴加熒光標記的二抗(稀釋比例為1:200)，37℃水浴鍋避光孵育1h；

⑦細胞核染色：pbs洗5min×3次，dapi染細胞核5min，pbs5min×1次；

⑧封片與鏡檢：滴加防淬滅劑后封片，熒光顯微鏡鏡下觀察，結果見圖4。

根據(jù)圖4可以得出，與對照組相比較，經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液干預治療后，浸潤到角膜植片中的cd11b⁺巨噬細胞、ly6g⁺中性粒細胞、cd11c⁺樹突狀細胞以及cd4⁺t細胞明顯減少。

實施例8實施例1制備的雷帕霉素膠束滴眼液對兔高危角膜移植模型中角膜植片透明性的影響

(1)新西蘭大白兔角膜新生血管誘導

使用5-0絲線于右眼角膜各象限間斷縫合一針，跨距2mm，深度達角膜深基質層，每周裂隙燈顯微鏡觀察3次，待3個或3個以上象限新生血管長入角膜≥4mm時，于表面麻醉下拆除縫線備用。

(2)穿透性角膜移植

①麻醉與消毒：氯胺酮(25mg/kg)和氯丙嗪(25mg/kg)混合后行肌肉注射進行全身麻醉(平均5.0ml/只兔)，術前0.5％安爾碘iii型涂抹術眼及周圍毛發(fā)；

②角膜植片制備：在供體角膜中央以直徑7.75mm的環(huán)鉆鉆切，15度刀做穿刺口，角膜剪剪下植片，置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中防止干涸；

③角膜植床制備：在受體角膜中央以直徑7.5mm的環(huán)鉆鉆切，15度刀做穿刺口，注入少許卡巴膽堿及醫(yī)用透明質酸鈉，角膜剪剪下角膜；

④角膜植片縫合：將角膜植片置于植床，以10-0尼龍線間斷縫合16針至水密狀態(tài)。術中局部使用1000u/ml肝素鈉防治纖維膜形成，術畢注入平衡鹽溶液形成前房。

(3)實驗分組及干預

將移植術后的新西蘭大白兔隨機分成對照組和實驗組，其中對照組用空載納米膠束滴眼液進行點眼治療，每次0.05ml，每天3次，實驗組用0.1％的雷帕霉素納米膠束滴眼液進行點眼治療，每次0.05ml，每天3次，連續(xù)點眼100天，并采用裂隙燈實時觀察角膜植片的透明性的變化，結果見圖5。

根據(jù)圖6可以得出，經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液治療后的兔角膜植片透明性顯著改善，而未治療組角膜植片渾濁，并可見角膜植片新生血管。

實施例9實施例2制備的雷帕霉素膠束滴眼液對兔高危移植角膜植片存活時間的影響

具體操作同實施例7，利用裂隙燈實時觀察兔角膜植片渾濁度的變化，連續(xù)觀察100天，并記錄角膜植片渾濁的時間，然后利用kaplan-meier統(tǒng)計學方法繪制角膜植片生存曲線，結果見圖6。

根據(jù)圖6可以得出，對照組的角膜植片平均存活時間為16.17±0.65天，雷帕霉素納米膠束滴眼液治療組的角膜植片平均存活時間為95.20±3.26天，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0001)，表明雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效延長角膜植片的存活時間。

實施例10實施例3制備的雷帕霉素納米膠束滴眼液對兔角膜植片中炎性細胞浸潤的影響

具體操作同實施例7，于角膜移植術后的第100天取小鼠眼球并用多聚甲醛進行固定，然后進行脫水、浸蠟、包埋等一系列過程制備石蠟切片(步驟詳見實施例6)，最后通過免疫組織化學技術研究rapa納米膠束滴眼液對角膜植片中炎性細胞浸潤的影響。免疫組織化學步驟如下：

①脫蠟：將石蠟切片置于二甲苯溶液中脫蠟10min×3次；

②水化：無水乙醇溶液2min；95％乙醇溶液2min；80％乙醇溶液2min；蒸餾水沖洗；

③抗原修復：取500ml蒸餾水，加入5ml檸檬酸鹽抗原修復液，ph值為6.0，加入高壓鍋，修復液量必須浸沒切片，大火加熱至沸騰，將組織切片放入沸騰的修復液中2min，然后自然冷卻至室溫；蒸餾水沖2次，pbs洗洗5min×3次；

④阻斷滅活內源性過氧化物酶：3％過氧化氫，封閉過氧化物酶，室溫放置10分鐘，pbs洗5min×3次；

⑤抗原封閉：吸水紙拭去標本周圍水分，載玻片標本周圍使用免疫組化筆劃圈(盡量小)，滴加山羊血清封閉抗原，37℃水浴鍋孵育15min，吸水紙拭去封閉液，不洗；

⑥抗體孵育：分別滴加抗cd4、cd8的抗體4℃冰箱孵育過夜，pbs沖洗3×5min；

⑦生物素標記二抗孵育：滴加生物素標記二抗，37℃水浴鍋孵育30min，pbs洗5min×3次；

⑧dab顯色：加入dab顯色液，顯微鏡下觀察染色結果，顯色3-10min，蒸餾水洗終止反應。組織內見細胞漿染為棕黃色為陽性；

⑨蘇木素復染：蘇木素染2min，至細胞核呈藍色；

⑩脫水、封片、鏡檢：80％乙醇溶液1min；90％乙醇溶液1min；95％乙醇溶液1min；無水乙醇溶液1min。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，結果見圖7。

根據(jù)圖7可以得出，與對照組相比較，雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效減少角膜植片中cd4⁺t細胞、cd8⁺t細胞的浸潤。

根據(jù)以上實施例可以得出，經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液治療后，小鼠和兔角膜植片持續(xù)維持透明，而未治療組角膜植片渾濁并伴有角膜新生血管；對照組與雷帕霉素治療組的小鼠角膜植片平均存活時間分別為17.17±1.54天和56.50±1.96天，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0001)，對照組與雷帕霉素治療組的兔角膜植片平均存活時間分別為16.17±0.65天和95.20±3.26天，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0001)，表明雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效延長角膜植片的存活時間；雷帕霉素納米膠束滴眼液可有效減少炎性細胞浸潤、抑制角膜水腫，維持角膜植片的正常結構；經(jīng)雷帕霉素納米膠束滴眼液治療后，浸潤到角膜植片中的cd11b⁺巨噬細胞、ly6g⁺中性粒細胞、cd11c⁺樹突狀細胞以及cd4⁺t細胞明顯減少。由此可以得出，雷帕霉素納米膠束滴眼液能夠用于防治角膜移植手術后的免疫排斥反應。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。