本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年6月7日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?01180039258.7、發(fā)明名稱為“半胱氨酸改造的抗體和偶聯(lián)物”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)是在37cfr§1.53(b)規(guī)定下提交的非臨時(shí)申請(qǐng)，依照35usc§119(e)的規(guī)定要求2010年6月8日提交的流水號(hào)為61/352,728的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，將其引入本文作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用反應(yīng)性半胱氨酸殘基改造的抗體，且更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有治療或診斷應(yīng)用的抗體。可以使半胱氨酸改造的抗體與化療藥；毒素；親和配體，諸如生物素和檢測(cè)標(biāo)記，諸如熒光團(tuán)偶聯(lián)。本發(fā)明還涉及使用抗體和抗體-藥物偶聯(lián)物化合物在體外、原位和體內(nèi)診斷或治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞或相關(guān)病理性情況的方法。發(fā)明背景抗體藥物偶聯(lián)物(adc)是有吸引力的靶向化療分子，因?yàn)樗鼈兘M合抗體和細(xì)胞毒性藥物二者的理想特性，即通過(guò)將有力的細(xì)胞毒性藥物靶向表達(dá)抗原的腫瘤細(xì)胞，由此增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性。針對(duì)給定靶抗原的成功adc開(kāi)發(fā)取決于抗體選擇、接頭穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性藥物效力和接頭-藥物偶聯(lián)抗體的方式的優(yōu)化。常規(guī)附著方式，即通過(guò)共價(jià)鍵連接，藥物部分與抗體一般產(chǎn)生不均一的(heterogeneous)分子混合物，其中藥物部分結(jié)合在抗體上的許多位點(diǎn)上。例如，細(xì)胞毒性藥物一般與抗體通過(guò)抗體的通常大量的賴氨酸殘基偶聯(lián)，從而產(chǎn)生不均一的抗體-藥物偶聯(lián)物混合物。根據(jù)反應(yīng)條件的不同，所述的不均一混合物一般含有抗體和0－約8或8以上附著的藥物部分的分布。此外，在具有特定整數(shù)比的藥物部分與抗體的偶聯(lián)物各亞組內(nèi)可能是不均一的混合物，其中藥物部分結(jié)合在抗體上的不同位點(diǎn)上。分析和制備方法不足以分離和表征由偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的不均一混合物中的抗體-藥物偶聯(lián)物類分子?？贵w為較大的復(fù)雜的并且結(jié)構(gòu)多樣的生物分子，通常帶有許多反應(yīng)性官能基。其與接頭試劑和藥物-接頭中間體的反應(yīng)性取決于如下因素：諸如ph、濃度、鹽濃度和共溶劑。此外，多步驟偶聯(lián)過(guò)程因控制反應(yīng)條件和表征反應(yīng)劑和中間體方面的困難而可能不可再現(xiàn)。半胱氨酸硫醇在中性ph具有反應(yīng)性，這與在接近ph7時(shí)質(zhì)子化和親核性降低的大部分胺類不同。由于游離硫醇(rsh,硫氫基)具有相對(duì)的反應(yīng)性，所以帶有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)通常以其作為二硫化物-連接的寡聚體的氧化形式存在或具有內(nèi)部橋連的二硫化物基團(tuán)?？贵w半胱氨酸硫醇一般對(duì)親電子偶聯(lián)反應(yīng)劑比對(duì)抗體胺或羥基更具反應(yīng)性，即更具親核性。通過(guò)使蛋白質(zhì)的不同氨基酸殘基突變成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸硫醇上的設(shè)計(jì)可能存在問(wèn)題，特別是就未配對(duì)的(游離cys)殘基或那些相對(duì)易于進(jìn)行反應(yīng)或氧化的殘基而言。在蛋白質(zhì)的濃溶液中，無(wú)論是在大腸桿菌(e.coli)的周質(zhì)中，還是在培養(yǎng)物上清液或部分或完全純化的蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)表面上的未配對(duì)的cys殘基可以配對(duì)并且氧化成分子內(nèi)二硫化物和由此的蛋白質(zhì)二聚體或多聚體。二硫化物二聚體的形成使得新的cys無(wú)法與藥物、配體或其它標(biāo)記發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。此外，如果蛋白質(zhì)以氧化方式在新改造的cys和已存在的cys殘基之間形成分子內(nèi)二硫鍵，那么兩種cys基團(tuán)對(duì)活性位點(diǎn)的參與和相互作用而言均無(wú)法利用。此外，可以通過(guò)錯(cuò)誤折疊或喪失三級(jí)結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)失活或賦予其非特異性(zhang等(2002)anal.biochem.311:1-9)。在改造的半胱氨酸可供偶聯(lián)但不擾亂免疫球蛋白折疊和裝配或改變抗原結(jié)合和效應(yīng)器功能的位點(diǎn)處具有半胱氨酸替代的抗體(thiomab)(junutula,etal.,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornanetal(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；wo2009/052249)。然后，這些thiomab可以經(jīng)由改造的半胱氨酸硫醇基偶聯(lián)細(xì)胞毒性藥物以獲得具有統(tǒng)一化學(xué)計(jì)量(約2個(gè)藥物每個(gè)抗體)的thiomab藥物偶聯(lián)物(tdc)。針對(duì)不同抗原的多種抗體的研究顯示了tdc在異種移植物模型中像常規(guī)adc一樣有效，而且在有關(guān)臨床前模型中在更高的劑量得到耐受。thiomab藥物偶聯(lián)物改造成在抗體的不同部分(輕鏈-fab、重鏈-fab和重鏈-fc)附著藥物。由于它們的同質(zhì)性和位點(diǎn)特異性偶聯(lián)細(xì)胞毒性藥物，tdc的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性、功效和pk特性提供勝過(guò)常規(guī)adc的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。概述本發(fā)明包括分離的半胱氨酸改造的抗體，其在重鏈或輕鏈中包含游離半胱氨酸氨基酸。本發(fā)明的一個(gè)方面是制備分離的半胱氨酸改造的抗體的方法，即通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用半胱氨酸替換來(lái)誘變親本抗體的核酸序列，以便編碼半胱氨酸改造的抗體；表達(dá)半胱氨酸改造的抗體；并分離半胱氨酸改造的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是分離的半胱氨酸改造的抗體的偶聯(lián)物，其中抗體共價(jià)附著于捕捉標(biāo)記、檢測(cè)標(biāo)記、藥物部分、或固相支持物。附圖簡(jiǎn)述附圖1a表示通過(guò)x射線晶體坐標(biāo)衍生的hu4d5fabv7抗體片段的三維代表圖。對(duì)重鏈和輕鏈的例示性改造的cys殘基的結(jié)構(gòu)位置進(jìn)行了編號(hào)(按照序列編號(hào)系統(tǒng))。附圖1b表示4d5v7fabh的與kabat編號(hào)方案(下排)對(duì)比在n-末端開(kāi)始的序列編號(hào)方案(上排)。kabat編號(hào)插入由a、b、c標(biāo)注。附圖2a和2b表示通過(guò)與bsa(空心條柱)、her2(具條紋的條柱)或鏈霉抗生物素(實(shí)心條柱)相互作用的pheselector測(cè)定法，使用在450nm處吸光度檢測(cè)的hu4d5fabv8和hu4d5fabv8cys突變體(thiofab)噬菌體變體的結(jié)合測(cè)定值：(a)未生物素化噬菌體-hu4d5fabv8和(b)生物素化噬菌體-hu4d5fabv8(b)。附圖3a和3b表示通過(guò)與bsa(空心條柱)、her2(具條紋的條柱)和鏈霉抗生物素(實(shí)心條柱)相互作用的pheselector測(cè)定法，使用在450nm處吸光度檢測(cè)的hu4d5fabv8(左)和hu4d5fabv8cys突變體(thiofab)的結(jié)合測(cè)定值：(a)未生物素化噬菌體-hu4d5fabv8和(b)生物素化噬菌體-hu4d5fabv8。輕鏈變體位于左側(cè)，而重鏈變體位于右側(cè)。硫醇反應(yīng)性＝鏈霉抗生物素結(jié)合的od450nm÷her2(抗體)結(jié)合的od450nm。附圖4a表示野生型hu4d5fabv8上殘基的表面可接近分?jǐn)?shù)值(fractionalsurfaceaccessibilityvalue)。輕鏈位點(diǎn)位于左側(cè)，而重鏈位點(diǎn)位于右側(cè)。附圖4b表示通過(guò)在450nm處檢測(cè)吸光度測(cè)定的與her2(第2天)、鏈霉抗生物素(sa)(第2天)、her2(第4天)和sa(第4天)的相互作用的生物素化的hu4d5fabv8和hu4d5fabv8cys變體(thiofab)的結(jié)合測(cè)定值。分離噬菌體-hu4d5fabv8cys變體并且儲(chǔ)存在4℃。在第2天或第4天時(shí)進(jìn)行生物素偶聯(lián)，隨后進(jìn)行pheselector分析以便如實(shí)施例2中所述監(jiān)測(cè)其與her2和鏈霉抗生物素的相互作用并且探測(cè)改造的thiofab變體上反應(yīng)性硫醇的穩(wěn)定性。附圖5表示通過(guò)在450nm處檢測(cè)吸光度測(cè)定的生物素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的-hu4d5fabv8(a121c)和未生物素化的野生型hu4d5fabv8在結(jié)合鏈霉抗生物素和her2中的結(jié)合測(cè)定值。在2ng和20ng測(cè)試每種fab。附圖6表示通過(guò)在450nm處檢測(cè)生物素化的abp-hu4d5fabv8野生型(wt)和abp-hu4d5fabv8半胱氨酸突變體v110c和a121c在結(jié)合兔清蛋白、鏈霉抗生物素(sa)和her2中的吸光度的elisa分析。附圖7表示通過(guò)在450nm處檢測(cè)吸光度對(duì)生物素化的abp-hu4d5fabv8半胱氨酸突變體(thiofab變體):(左至右)單cys變體abp-v110c、abp-a121c和雙cys變體abp-v110c-a88c和abp-v110c-a121c的在結(jié)合兔清蛋白、her2和鏈霉抗生物素(sa)并且使用fab-hrp或sa-hrp探測(cè)的elisa分析。附圖8表示生物素化的thiofab噬菌體和抗-噬菌體hrp抗體與her2(上)和鏈霉抗生物素(下)的結(jié)合。附圖9a表示結(jié)合固定的her2的生物素化抗體在結(jié)合用于吸光度檢測(cè)的hrp標(biāo)記的二抗(secondantibody)的卡通畫描繪。附圖9b表示在450nm處檢測(cè)吸光度測(cè)定的生物素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的硫代-曲妥單抗變體(thio-trastuzumabvariant)和未-生物素化的野生型曲妥單抗結(jié)合固定的her2的結(jié)合測(cè)定。從左至右:v110c(單cys),a121c(單cys),v110c/a121c(雙cys)和曲妥單抗。以1、10和100ng測(cè)試了各thioigg變體和曲妥單抗。附圖10a表示結(jié)合固定的her2的生物素化抗體和用于吸光度檢測(cè)的生物素與抗-igg-hrp結(jié)合的卡通圖描繪。附圖10b表示在450nm下檢測(cè)吸光度的生物素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的-硫代曲妥單抗變體和未-生物素化的野生型曲妥單抗在結(jié)合固定的鏈霉抗生物素中的結(jié)合測(cè)定值。從左至右:v110c(單cys)，a121c(單cys)，v110c/a121c(雙cys)和曲妥單抗。以1、10和100ng測(cè)試了各thioigg變體和曲妥單抗。附圖11表示制備由細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的用于偶聯(lián)的半胱氨酸改造的抗體(thiomab)的一般方法。典型實(shí)施方案的詳細(xì)描述詳細(xì)內(nèi)容參照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，其實(shí)施例在附帶的結(jié)構(gòu)和通式中例示。盡管結(jié)合列舉的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解它們并非指定用于將本發(fā)明限定到那些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明覆蓋所有的備選、變型和等同技術(shù)方案，它們均包括在如權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以用于實(shí)施本發(fā)明的與本文所述的那些相似或等同的許多方法和物質(zhì)。本發(fā)明決不限于所述的方法和物質(zhì)。除非另做陳述，否則，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義并且與如下文獻(xiàn)中所述一致：singleton等(1994)dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,2nded.,j.wiley&sons,newyork,ny；和janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immonobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork。定義除非另做陳述，否則，本文所用的下列術(shù)語(yǔ)和措詞具有如下含義：當(dāng)本文中使用商品名時(shí)，申請(qǐng)人意欲獨(dú)立地包括產(chǎn)品的商品名產(chǎn)品制劑、仿制藥和商品名產(chǎn)品的活性藥物組分。本文的術(shù)語(yǔ)“抗體”以其最廣泛的含義使用并且特別覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物活性(miller等(2003)jour.ofimmunology170:4854-4861)?？贵w可以為鼠、人、人源化、嵌合的抗體或來(lái)源于其它物種?？贵w為由能夠識(shí)別和結(jié)合特異性抗原的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork).靶抗原一般具有由多種抗體的cdrs識(shí)別的大量結(jié)合位點(diǎn)，也稱作表位。特異性結(jié)合不同表位的各抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可以具有一種以上相應(yīng)的抗體?？贵w包括全-長(zhǎng)免疫球蛋白分子或全-長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結(jié)合所關(guān)注靶標(biāo)的抗原或其部分的分子，這類靶標(biāo)包括，但不限于癌細(xì)胞或產(chǎn)生與自身免疫性疾病相關(guān)的自身免疫抗體的細(xì)胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意類型(例如igg、ige、igm、igd和iga)、類別(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亞類。免疫球蛋白可以來(lái)源于任意的物種。然而，在一個(gè)方面中，免疫球蛋白來(lái)源于人、鼠或兔。"抗體片段"包含全長(zhǎng)抗體的一部分，一般為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括：fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；線性抗體；微抗體(minibody)(olafsen等(2004)proteineng.design&sel.17(4):315-323)；fab表達(dá)文庫(kù)制備的片段；抗-獨(dú)特型(抗-id)抗體；cdr(互補(bǔ)決定區(qū))；和以免疫特異性方式結(jié)合癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-結(jié)合片段；單-鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。本文的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本上同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體，即除可能少量存在的天然發(fā)生的可能突變之外，包含在該群體中的各抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的靶向單個(gè)抗原位點(diǎn)的抗體。而且，與典型地包括靶向不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體只靶向抗原上的單一決定簇。除其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于它們可以以不被其它抗體污染的方式合成。修飾語(yǔ)“單克隆”表示獲自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體特性，并非解釋為需要由任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，可以通過(guò)首先由kohler等(1975)nature256:495描述的雜交瘤方法制備用于本發(fā)明的單克隆抗體或可以通過(guò)重組dna方法制備(例如，參見(jiàn):us4816567；us5807715)。例如，還可以使用clackson等(1991)nature,352:624-628；marks等(1991)j.mol.biol.,222:581-597所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離單克隆抗體。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與來(lái)源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞型的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，本文還包括嵌合抗體的片段，只要它們展示期望的生物學(xué)活性(us4816567；和morrison等(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。本文關(guān)注的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)化(primatized)”抗體，其包含來(lái)源于非人的靈長(zhǎng)類(例如oldworldmonkey、ape等)的可變區(qū)抗原-結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。本文的“完整抗體”為包含vl和vh結(jié)構(gòu)域以及輕鏈恒定域(cl)和重鏈恒定域ch1、ch2和ch3的抗體。恒定域可以為天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。完整抗體可以具有一種或多種“效應(yīng)子功能”，意旨?xì)w因于抗體的fc恒定區(qū)(天然序列fc區(qū)或氨基酸序列變體fc區(qū))的那些生物活性?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括c1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(adcc)；胞吞作用；和細(xì)胞表面受體，諸如b細(xì)胞受體和bcr的減量調(diào)節(jié)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列的不同，可以將完整抗體指定為不同“類別”。存在5種主要類別的完整免疫球蛋白抗體:iga、igd、ige、igg和igm，且可以將其中的幾種進(jìn)一步分成“亞類”(亞型)，例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。對(duì)應(yīng)于不同抗體類別的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型為眾所周知的。ig型包括鉸鏈-修飾型或無(wú)鉸鏈型(roux等(1998)j.immunol.161:4083-4090；lund等(2000)eur.j.biochem.267:7246-7256；us2005/0048572；us2004/0229310)?！癳rbb受體”為屬于受體erbb受體家族的蛋白酪氨酸激酶，其成員為細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介導(dǎo)物。erbb受體家族包括4種不同的成員，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr、erbb1、her1)、her2(erbb2或p185neu)、her3(erbb3)和her4(erbb4或tyro2)。已經(jīng)使用人乳腺腫瘤細(xì)胞系skbr3表征了一組抗-erbb2抗體(hudziak等(1989)mol.cell.biol.9(3):1165-1172。使用稱作4d5的抑制細(xì)胞增殖達(dá)56％的抗體獲得最大抑制作用。在本試驗(yàn)的一組抗體中的其它抗體降低細(xì)胞增殖的程度較弱。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗體4d5可以使過(guò)表達(dá)erbb2的乳腺腫瘤細(xì)胞系對(duì)tnf-α的細(xì)胞毒性效應(yīng)敏感(us5677171)。hudziak等討論的抗-erbb2抗體進(jìn)一步在下列文獻(xiàn)中得到表征：fendly等(1990)cancerresearch50:1550-1558；kotts等(1990)invitro26(3):59a；sarup等(1991)growthregulation1:72-82；shepard等j.(1991)clin.immunol.11(3):117-127；kumar等(1991)mol.cell.biol.11(2):979-986；lewis等(1993)cancerimmunol.免疫ther.37:255-263；pietras等(1994)oncogene9:1829-1838；vitetta等(1994)cancerresearch54:5301-5309；sliwkowski等(1994)j.biol.chem.269(20):14661-14665；scott等(1991)j.biol.chem.266:14300-5；d'souza等proc.natl.acad.sci.(1994)91:7202-7206；lewis等(1996)cancerresearch56:1457-1465；和schaefer等(1997)oncogene15:1385-1394。erbb受體通常包含胞外結(jié)構(gòu)域，其可以結(jié)合erbb配體；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和包含幾個(gè)可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基-末端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。erbb受體可以為“天然序列”erbb受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選erbb受體為天然序列人erbb受體。因此，“erbb受體家族的成員”包括egfr(erbb1)、erbb2、erbb3、erbb4。術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列變體”意旨在一定程度上具有不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。氨基酸序列變體一般與天然erbb配體的至少一種受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與天然erbb受體的至少一種配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少約70％的序列同一性，并且優(yōu)選它們至少約80％，更優(yōu)選至少約90％的序列與這類受體或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)的某些位置上具有替代、缺失和/或插入。按照常規(guī)的名稱，即一字母密碼和三字母密碼命名氨基酸。將“序列同一性”定義為對(duì)序列進(jìn)行序列對(duì)比排列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后氨基酸序列變體中相同的殘基的百分率。用于進(jìn)行序列對(duì)比的方法和計(jì)算機(jī)程序?yàn)楸绢I(lǐng)域眾所周知的。一種這類計(jì)算機(jī)程序?yàn)間enentech,inc.創(chuàng)建的“align2”，其中歸檔為1991年12月10日在unitedstatescopyrightoffice,washington,dc20559的用戶文件。“天然抗體”通常為由兩種相同的輕(l)鏈和兩種相同的重(h)鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚化糖蛋白。每一輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)量在不同免疫球蛋白同種型中可變。每一重鏈和輕鏈還具有有規(guī)則間隔的鏈間二硫鍵。每一重鏈在一端上帶有可變域(vh)，隨后是大量恒定域。每一輕鏈在一端上帶有可變(vl)，而在另一端上帶有恒定域。將輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域進(jìn)行序列對(duì)比并且將輕鏈的可變域與重鏈的可變域進(jìn)行序列對(duì)比。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈域重鏈可變域之間形成界面。術(shù)語(yǔ)“可變的”指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段。可變區(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(fr)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個(gè)fr，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)fr非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見(jiàn)kabat等人，1991，《sequencesofproteinsofimmunologicalinterest》，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(adcc)中抗體的參與。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)及重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等人，見(jiàn)上文)和/或那些來(lái)自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)及重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothiaandlesk(1987)j.mol.biol.196:901-917)?！翱蚣軈^(qū)”或“fr”殘基指可變區(qū)中除了本文中所定義的高變區(qū)殘基以外的那些殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作“fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余“fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)f(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?！癴v”是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在vh-vl二聚體表面確定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(ch1)。fab’片段因在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與fab片段有所不同，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。fab’-sh是本文中對(duì)其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的fab’的稱謂。f(ab')2抗體片段最初是作為成對(duì)fab’片段生成的，在fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體的“輕鏈”可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)?！皢捂渇v”或“scfv”抗體片段包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該fv多肽在vh和vl結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scfv能夠形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scfv的綜述參見(jiàn)plückthun，《thepharmacologyofmonoclonalantibodies》，vol.113，rosenburg和moore編，springer-verlag，newyork，pp.269-315，1994。抗erbb2抗體scfv片段描述于wo93/16185；美國(guó)專利5,571,894；和5,587,458。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。人源化是將鼠抗原結(jié)合信息轉(zhuǎn)移至非免疫原性人抗體受體的方法，并且已經(jīng)產(chǎn)生了許多治療上有用的藥物。人源化方法一般通過(guò)將所有6個(gè)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)轉(zhuǎn)移至人抗體框架開(kāi)始(jones等,(1986)nature321:522-525)。這些cdr移植的抗體一般不會(huì)保持其對(duì)抗原結(jié)合的最初親和力，并且事實(shí)上，親和力通常嚴(yán)重受損。除cdr外，還必須引入選定的非人抗體框架殘基以便維持正確的cdr構(gòu)象(chothia等(1989)nature342:877)。已經(jīng)證實(shí)，將關(guān)鍵的小鼠框架殘基轉(zhuǎn)移至人受體以便支持所移植cdr的結(jié)構(gòu)構(gòu)象恢復(fù)抗原結(jié)合和親和力(riechmann等(1992)j.mol.biol.224,487-499；foote和winter,(1992)j.mol.biol.224:487-499；presta等(1993)j.immunol.151,2623-2632；werther等(1996)j.immunol.methods157:4986-4995；和presta等(2001)thromb.haemost.85:379-389)。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變區(qū)，其中整個(gè)或基本上整個(gè)高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個(gè)或基本上整個(gè)fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗體任選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)us6,407,213；jonesetal.(1986)nature321:522-525；riechmannetal.(1988)nature332:323-329；presta(1992)curr.op.struct.biol.2:593-596?！坝坞x半胱氨酸氨基酸”指已經(jīng)改造到親本抗體中，帶有硫醇官能基(-sh)，并且未作為分子內(nèi)或分子間二硫鍵配對(duì)的半胱氨酸氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“硫醇反應(yīng)性值”為游離半胱氨酸氨基酸的反應(yīng)性的定量表征。硫醇反應(yīng)性值為半胱氨酸改造的抗體中與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的游離半胱氨酸氨基酸的百分比，并且換算成最大值1。例如，半胱氨酸改造的抗體上以100％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑諸如生物素-馬來(lái)酰亞胺試劑起反應(yīng)而形成生物素標(biāo)記的抗體的游離半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的以80％產(chǎn)率與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個(gè)半胱氨酸氨基酸具有約0.8的硫醇反應(yīng)性值。改造到相同或不同親本抗體中的完全無(wú)法與硫醇反應(yīng)性試劑起反應(yīng)的另一個(gè)半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇反應(yīng)性值。可以通過(guò)elisa測(cè)定法、質(zhì)譜法、液相層析法、放射自顯影法或其它定量分析試驗(yàn)測(cè)定特定半胱氨酸的硫醇反應(yīng)性值。"親本抗體"為所含氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基將用一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基替代的抗體。親本抗體可以包含天然或野生型序列。親本抗體可以具有相對(duì)于其它天然、野生型或修飾形式的抗體而言預(yù)先存在的氨基酸序列修飾(諸如添加、缺失和/或替代)。親本抗體可以針對(duì)所關(guān)注的靶抗原，例如生物學(xué)上重要的多肽。還關(guān)注針對(duì)非多肽抗原(諸如腫瘤相關(guān)糖脂抗原；參見(jiàn)us5,091,178)的抗體。例示性親本抗體包括對(duì)細(xì)胞表面和跨膜受體和腫瘤相關(guān)抗原(taa)具有親和力和選擇性的抗體?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)lowry方法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95％，最優(yōu)選重量超過(guò)99％，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的n-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的sds-page，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備?！敖Y(jié)合”分子靶標(biāo)或所關(guān)注抗原例如erbb2抗原的抗體為能夠以足夠親和力結(jié)合抗原，使得該抗體可用于靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的抗體。如果抗體為結(jié)合erbb2的抗體，那么它通常優(yōu)先結(jié)合erbb2勝過(guò)其它erbb受體，并且可以為不會(huì)與其它蛋白質(zhì)，諸如egfr、erbb3或erbb4發(fā)生顯著交叉反應(yīng)的抗體。在這類實(shí)施方案中，抗體與這些非erbb2蛋白質(zhì)結(jié)合(例如對(duì)內(nèi)源受體的細(xì)胞表面結(jié)合)的程度將低于10％，正如通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(facs)分析或放射性免疫沉淀(ria)測(cè)定的。有時(shí)，抗erbb2抗體不會(huì)與大鼠neu蛋白發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)，例如如schecter等(1984)nature312:513和drebin等(1984)nature312:545-548中所述。本發(fā)明所涵蓋的抗體的分子靶標(biāo)包括cd蛋白及其配體，諸如，但不限于：(i)cd3、cd4、cd8、cd19、cd20、cd22、cd34、cd40、cd79α(cd79a)和cd79β(cd79b)；(ii)erbb受體家族的成員，諸如egf受體、her2、her3或her4受體；(iii)細(xì)胞粘附分子，諸如lfa-1、mac1、p150,95、vla-4、icam-1、vcam和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗體)；(iv)生長(zhǎng)因子，諸如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(ob)受體；mpl受體；ctla-4；蛋白c、br3、c-met、組織因子、β7等；和(v)細(xì)胞表面和跨膜腫瘤相關(guān)抗原(taa)。除非另做陳述，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體4d5”指具有或衍生自鼠4d5抗體(atcccrl10463)的抗原結(jié)合殘基的抗體。例如，單克隆抗體4d5可以為鼠單克隆抗體4d5或其變體，諸如人源化4d5。例示性人源化4d5抗體包括如us5,821,337中所述的humab4d5-1、humab4d5-2、humab4d5-3、humab4d5-4、humab4d5-5、humab4d5-6、humab4d5-7和humab4d5-8(曲妥單抗(trastuzumab),)。術(shù)語(yǔ)“治療”和“處理”指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者，其中目標(biāo)是預(yù)防或減緩(減輕)不想要的生理學(xué)變化或紊亂，諸如癌癥的形成或傳播。為了本發(fā)明，有利或期望的臨床結(jié)果包括但不限于：緩解癥狀、削弱疾病的程度、疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)、延遲或減緩疾病進(jìn)展、改善或減輕疾病狀態(tài)、及康復(fù)(無(wú)論是部分的還是完全的)，無(wú)論是可檢測(cè)的還是不可檢測(cè)的。“治療”或“處理”還可以指與不接受治療的預(yù)期存活相比延長(zhǎng)存活。需要治療的受試者包括早就患有狀況或紊亂的受試者以及傾向于患上狀況或紊亂的受試者或者要預(yù)防狀況或紊亂的受試者。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指在哺乳動(dòng)物中有效治療疾病或紊亂的藥物量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。在藥物可阻止生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度上，它可以是抑制細(xì)胞的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥療法，可通過(guò)例如評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)間(ttp)和/或測(cè)定響應(yīng)速率(rr)來(lái)測(cè)量功效。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)節(jié)的生理狀況?！澳[瘤”包含一個(gè)或多個(gè)癌性細(xì)胞。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌(“nsclc”)、肺的腺癌和肺的鱗狀癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、以及頭和頸癌?！氨磉_(dá)erbb的癌”指包含在其細(xì)胞表面上存在erbb蛋白質(zhì)的細(xì)胞的癌?！氨磉_(dá)erbb2的癌”指在其細(xì)胞表面上生成足夠水平的erbb2，使得抗erbb2抗體可與其結(jié)合并對(duì)癌產(chǎn)生治療效果的癌?！斑^(guò)表達(dá)”抗原性受體的癌指與同一組織類型的非癌性細(xì)胞相比，在其細(xì)胞表面上具有顯著更高水平的受體諸如erbb2的癌。此類過(guò)表達(dá)可以是由基因擴(kuò)增或者是由轉(zhuǎn)錄或翻譯提高引起的。可在診斷或預(yù)后測(cè)定法中通過(guò)評(píng)估細(xì)胞表面上存在的受體蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定法；ihc)來(lái)確定受體過(guò)表達(dá)。或者/另外，可測(cè)量細(xì)胞中受體編碼核酸的水平，例如通過(guò)熒光原位雜交(fish；參見(jiàn)wo98/45479)、southern印跡、或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)，諸如實(shí)時(shí)定量pcr(rt-pcr)。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括：放射性同位素，例如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、c60和lu的放射性同位素；化療劑；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其合成類似物和衍生物。“噬菌體展示”是將變異多肽作為與外殼蛋白的融合蛋白展示在噬菌體例如絲狀噬菌體顆粒的表面上的技術(shù)。噬菌體展示的一種效用在于可對(duì)隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體的大型文庫(kù)快速且有效的分選那些以高親和力結(jié)合靶分子的序列的事實(shí)。在噬菌體上展示肽和蛋白質(zhì)文庫(kù)已經(jīng)用于對(duì)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的多肽篩選具有特定結(jié)合特性的多肽。多價(jià)噬菌體展示方法已經(jīng)用于展示肽和小蛋白質(zhì)的小型文庫(kù)，通常通過(guò)與絲狀噬菌體的piii或pviii融合(wellsandlowman,(1992)curr.opin.struct.biol.3:355-362及其引用的參考文獻(xiàn))。在單價(jià)噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫(kù)與噬菌體外殼蛋白或其部分融合，且在存在野生型蛋白質(zhì)時(shí)以低水平表達(dá)。親合力效果與多價(jià)噬菌體相比降低，使得分選基于內(nèi)在配體親和力，并使用簡(jiǎn)化dna操作的噬菌粒載體。lowmanandwells,(1991)methods:acompaniontomethodsinenzymology3:205-0216。噬菌體展示包括用于生成抗體樣分子的技術(shù)(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik,(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork,p627-628；leeetal.)。“噬菌?！笔蔷哂屑?xì)菌復(fù)制起點(diǎn)例如co1e1和一個(gè)拷貝的噬菌體基因區(qū)間的噬菌體載體。噬菌?？捎糜谌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和λ形噬菌體。質(zhì)粒通常還將包含抗生素抗性的選擇標(biāo)志?？寺〉竭@些載體中的dna區(qū)段可以像質(zhì)粒一樣增殖。當(dāng)包含這些載體的細(xì)胞中配有生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制方式改變成滾環(huán)復(fù)制以生成質(zhì)粒dna的一條鏈的拷貝并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。該術(shù)語(yǔ)包括包含噬菌體外殼蛋白基因或其片段且其與異源多肽基因連接成基因融合物，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒表面上的噬菌粒。“接頭”、“接頭單元”或“連接物”指包含使抗體與藥物模塊共價(jià)連接的共價(jià)鍵或原子鏈的化學(xué)模塊。在各個(gè)實(shí)施方案中，將接頭指定為l。接頭包括：二價(jià)基，諸如亞烴基(alkyldiyl)、亞芳基、亞雜芳基，諸如-(cr2)no(cr2)n-、烴氧基重復(fù)單元(例如聚亞乙基氧基(polyethylenoxy)、peg、聚亞甲基氧基(polymethyleneoxy))和烴氨基(例如聚乙烯氨基，jeffaminetm)等模塊；及二酸酯和酰胺類，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指可以共價(jià)附著于抗體并發(fā)揮如下功能的任何模塊：(i)提供可檢測(cè)信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記相互作用以改變由第一或第二標(biāo)記提供的可檢測(cè)信號(hào)，例如fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；(iii)穩(wěn)定與抗原或配體的相互作用或提供與之結(jié)合的親和力；(iv)通過(guò)電荷、疏水性、形狀或其它物理參數(shù)影響遷移率例如電泳遷移率或細(xì)胞通透性；或(v)提供捕捉模塊，以調(diào)節(jié)配體親和力、抗體/抗原結(jié)合、或離子絡(luò)合。本文中使用的立體化學(xué)的定義和規(guī)則一般遵循s.p.parker,ed.,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；eliel,e.andwilen,s.,stereochemistryoforganiccompunds(1994)johnwiley&sons,inc.,newyork。許多有機(jī)化合物以旋光形式存在，即它們有能力旋轉(zhuǎn)平面偏振光的平面。在描述旋光化合物時(shí)，前綴d和l或r和s用于表示分子關(guān)于其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型。前綴d和l或(+)和(-)用于表示化合物對(duì)平面偏振光的旋轉(zhuǎn)的標(biāo)記，其中(-)或1指化合物是左旋的。以(+)或d為前綴的化合物是右旋的。對(duì)于指定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，只是它們互為鏡像。特定的立體異構(gòu)體還可稱作對(duì)映體，此類異構(gòu)體的混合物通常稱作對(duì)映混合物。對(duì)映體的50:50混合物稱作外消旋混合物或外消旋物，它們可以在沒(méi)有立體選擇性或立體特異性的化學(xué)反應(yīng)或方法中存在。術(shù)語(yǔ)“外消旋混合物”和“外消旋物”指兩種對(duì)映體等摩爾混合從而喪失旋光性的混合物。短語(yǔ)“藥學(xué)可接受鹽”在用于本文時(shí)指adc的藥學(xué)可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽。例示性的鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和撲酸鹽(即1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。藥學(xué)可接受鹽可能牽涉包含另一種分子，諸如乙酸鹽離子、琥珀酸鹽離子或其它抗衡離子?？购怆x子可以是穩(wěn)定母體化合物電荷的任何有機(jī)或無(wú)機(jī)模塊。另外，藥學(xué)可接受鹽可以在其結(jié)構(gòu)中具有超過(guò)一種帶電荷原子。在多種帶電荷原子作為藥學(xué)可接受鹽的組成部分的情況中可以具有多種抗衡離子。因此，藥學(xué)可接受鹽可具有一種或多種帶電荷原子和/或一種或多種抗衡離子?！八帉W(xué)可接受溶劑化物”指一個(gè)或多個(gè)溶劑分子和adc的結(jié)合。形成藥學(xué)可接受溶劑化物的溶劑的例子包括但不限于水、異丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。半胱氨酸改造的抗體本發(fā)明的化合物包括半胱氨酸改造的抗體，其中野生型或親代抗體中的一種或多種氨基酸被半胱氨酸氨基酸替代。由此可以改造任意形式的抗體，即使其突變。例如，可以將親代fab抗體片段改造成半胱氨酸改造的fab，在本文中稱作“thiofab”。類似地，可以將親代單克隆抗體改造成“thiomab”。應(yīng)注意單一位點(diǎn)突變?cè)趖hiofab中產(chǎn)生單一改造的半胱氨酸殘基(singleengineeredcysteineresidue)，而單一位點(diǎn)突變?cè)趖hiomab中產(chǎn)生兩個(gè)改造的半胱氨酸殘基，這是因igg抗體的二聚化特性所致。評(píng)價(jià)被半胱氨酸(cys)殘基替代的(“改造的”)突變體的新引入的改造的半胱氨酸硫醇反應(yīng)性。硫醇反應(yīng)值為0－1.0范圍內(nèi)的相對(duì)數(shù)值范圍并且可以測(cè)定任意半胱氨酸改造的抗體的該值。本發(fā)明半胱氨酸改造的抗體的硫醇反應(yīng)值在0.6－1.0；0.7－1.0；或0.8－1.0的范圍。本發(fā)明的設(shè)計(jì)、選擇和制備方法能夠使半胱氨酸改造的抗體能夠與親電子官能基(functionability)反應(yīng)。這些方法進(jìn)一步能夠使抗體偶聯(lián)物化合物，諸如抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)化合物與藥物分子在指定、設(shè)計(jì)、選擇的位點(diǎn)上反應(yīng)。抗體表面上的反應(yīng)性半胱氨酸殘基能夠通過(guò)硫醇反應(yīng)基，諸如馬來(lái)酰亞胺或鹵代乙?；禺愋缘嘏悸?lián)藥物部分。cys殘基的硫醇官能基與馬來(lái)酰亞胺基的親核反應(yīng)性約高于蛋白質(zhì)中任意其它氨基酸官能基，諸如賴氨酸殘基的氨基或n-末端氨基約1000倍。碘乙酰試劑和馬來(lái)酰亞胺試劑中的硫醇特異性官能基可以與胺基反應(yīng)，但需要更高的ph(>9.0)和更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(garman,1997,non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london)。本發(fā)明半胱氨酸改造的抗體優(yōu)選保持其野生型親代抗體對(duì)應(yīng)物的抗原結(jié)合能力。因此，半胱氨酸改造的抗體能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合抗原。這類抗原包括：例如腫瘤-相關(guān)抗原(taa)、細(xì)胞表面受體蛋白和其它細(xì)胞表面分子、跨膜蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子、與組織發(fā)育或分化相關(guān)(例如，已知或懷疑在功能上相關(guān))的分子、淋巴因子、細(xì)胞因子、涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的分子、涉及血管發(fā)生的分子和與血管發(fā)生相關(guān)(例如，已知或懷疑在功能上相關(guān))的分子。腫瘤-相關(guān)抗原可以為分化簇因子(即cd蛋白)。能夠結(jié)合半胱氨酸改造的抗體的抗原可以為上述類型之一的亞組中的成員，其中所述類型中另一亞組包含具有不同特性的其它分子/抗原(就所關(guān)注的抗原而言)。親代抗體還可以為選自如上所述的us5821337的表3中所述的humab4d5-1、humab4d5-2、humab4d5-3、humab4d5-4、humab4d5-5、humab4d5-6、humab4d5-7和humab4d5-8(曲妥單抗,)的人源化抗體，特別將該文獻(xiàn)引入本文作為參考；人源化520c9(wo93/21319)和如本文所述的人源化2c4抗體。本發(fā)明的半胱氨酸改造的抗體可以位點(diǎn)-特異性和有效地與硫醇-反應(yīng)試劑偶聯(lián)。硫醇-反應(yīng)試劑可以為多官能接頭試劑(multifunctionallinkerreagent)；捕捉物，即親和、標(biāo)記試劑(例如生物素-接頭試劑)；檢測(cè)試劑(例如熒光團(tuán)試劑)；固相固定化試劑(例如sepharosetm、聚苯乙烯或玻璃)或藥物-接頭中間體(drug-linkerintermediate)。硫醇-反應(yīng)試劑的一個(gè)實(shí)例為n-乙基馬來(lái)酰亞胺(nem)。在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，thiofab與生物素-接頭試劑反應(yīng)得到生物素化的thiofab，通過(guò)這種方式可以檢測(cè)和測(cè)定改造的半胱氨酸殘基的存在和反應(yīng)性。thiofab與多官能接頭試劑反應(yīng)得到帶有可以與藥物部分試劑或其它標(biāo)記進(jìn)一步反應(yīng)的官能化接頭的thiofab。thiofab與藥物-接頭中間體反應(yīng)得到thiofab藥物偶聯(lián)物。本文所述的典型方法一般可以應(yīng)用于鑒定和生產(chǎn)抗體，并且更一般地通過(guò)使用本文所述的設(shè)計(jì)和篩選步驟用于其它蛋白質(zhì)。這類手段可以應(yīng)用于偶聯(lián)其它硫醇反應(yīng)試劑，其中反應(yīng)基為例如馬來(lái)酰亞胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其它硫醇反應(yīng)偶聯(lián)配偶體(haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,1997,non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)bioconjugatechem.1:2；hermanson,g.inbioconjugatetechniques(1996)academicpress,sandiego,pp.40-55,643-671)。所述的配偶體可以為細(xì)胞毒性劑(例如毒素，諸如多柔比星(doxorubicin)或百日咳毒素)；熒光團(tuán)，諸如熒光染料類熒光素或若丹明；用于成像的螯合劑或放射性治療金屬；肽基或非-肽基標(biāo)記或檢測(cè)標(biāo)記；或清除-改進(jìn)劑(clearance-modifyingagent)，諸如聚乙二醇的不同異構(gòu)體；結(jié)合第三種成分的肽或另一種碳水化合物或親脂性試劑。在本文典型抗體片段hu4d5fabv8上鑒定的位點(diǎn)主要位于抗體的恒定域中，其在所有抗體種類之間為充分保守的。這些位點(diǎn)可廣泛適用于其它抗體，而無(wú)需進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)或有關(guān)特異性抗體結(jié)構(gòu)的知識(shí)，并且不會(huì)干擾對(duì)抗體可變域而言固有的抗原結(jié)合特性?？梢杂糜谥委煱┌Y的半胱氨酸改造的抗體包括，但不限于針對(duì)細(xì)胞表面受體和腫瘤-相關(guān)抗原(taa)的抗體。這類抗體可以用作裸抗體(未與藥物或標(biāo)記部分偶聯(lián))或用作式i抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)。腫瘤-相關(guān)抗原為本領(lǐng)域中公知的并且可以制備它們以便用于使用本領(lǐng)域眾所周知的方法和信息生產(chǎn)抗體。在發(fā)現(xiàn)用于癌癥診斷和療法的有效細(xì)胞靶標(biāo)的嘗試中，研究人員尋求鑒定與一種或多種正常非癌細(xì)胞相比在一種或多種特定類型的癌細(xì)胞表面上特異性表達(dá)的跨膜多肽，或腫瘤相關(guān)多肽。與非癌細(xì)胞相比，通常這類腫瘤-相關(guān)多肽更大量地在癌細(xì)胞表面上表達(dá)。對(duì)這類腫瘤-相關(guān)細(xì)胞表面抗原多肽的鑒定已經(jīng)使人們能夠特異性靶向癌細(xì)胞，通過(guò)基于抗體的療法對(duì)其進(jìn)行破壞。taa的實(shí)例包括，但不限于下述taa(1)-(36)。為方便起見(jiàn)，均為本領(lǐng)域公知的有關(guān)這些抗原的信息如下所列，并且按照nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)的核酸和蛋白質(zhì)序列鑒定規(guī)定，包括名稱，可選擇的名稱，genbank登記號(hào)和主要參考文獻(xiàn)。相當(dāng)于taa(1)-(36)的核酸和蛋白質(zhì)序列可以在公共數(shù)據(jù)庫(kù)，諸如genbank中獲得。由抗體靶向的腫瘤-相關(guān)抗原包括所有氨基酸序列變體和同種型，它們與引述的參考文獻(xiàn)中鑒定的序列相比具有至少約70％，80％，85％，90％或95％序列同一性，或表現(xiàn)出基本上與具有引述參考文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的序列的taa相同的生物特性或特征。例如，具有變體序列的taa一般能夠特異性結(jié)合文獻(xiàn)中所示相應(yīng)序列taa特異性結(jié)合的抗體。特別將本文特別引述的參考文獻(xiàn)中的序列和披露內(nèi)容引入作為參考。腫瘤相關(guān)抗原(1)-(36):(1)bmpr1b(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-ib型(bonemorphogeneticreceptor-typeib),genbank登記號(hào)nm_001203)tendijke,p.,等science264(5155):101-104(1994),oncogene14(11):1377-1382(1997))；wo2004063362(權(quán)利要求2)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；us2003134790-a1(38-39頁(yè))；wo2002102235(權(quán)利要求13；頁(yè)296)；wo2003055443(91-92頁(yè))；wo200299122(實(shí)施例2；528-530頁(yè))；wo2003029421(權(quán)利要求6)；wo2003024392(權(quán)利要求2；附圖112)；wo200298358(權(quán)利要求1；183頁(yè))；wo200254940(100-101頁(yè))；wo200259377(349-350頁(yè))；wo200230268(權(quán)利要求27；376頁(yè))；wo200148204(實(shí)施例；附圖4)；np_001194骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體,ib型/pid＝np_001194.1.交叉參考:mim:603248；np_001194.1；ay065994(2)e16(lat1,slc7a5,genbank登記號(hào)nm_003486)biochem.biophys.res.commun.255(2),283-288(1999),nature395(6699):288-291(1998),gaugitsch,h.w.,等(1992)j.biol.chem.267(16):11267-11273)；wo2004048938(實(shí)施例2)；wo2004032842(實(shí)施例iv)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200278524(實(shí)施例2)；wo200299074(權(quán)利要求19；頁(yè)127-129)；wo200286443(權(quán)利要求27；222,393頁(yè))；wo2003003906(權(quán)利要求10；293頁(yè))；wo200264798(權(quán)利要求33；頁(yè)93-95)；wo200014228(權(quán)利要求5；133-136頁(yè))；us2003224454(附圖3)；wo2003025138(權(quán)利要求12；150頁(yè))；np_003477溶質(zhì)載體家族7(solutecarrierfamily7)(陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cationicaminoacidtransporter),y+系統(tǒng)),成員5/pid＝np_003477.3–人類；交叉參考:mim:600182；np_003477.3；nm_015923；nm_003486_1(3)steap1(前列腺的六跨膜上皮細(xì)胞抗原(sixtransmembraneepithelialantigenofprostate),genbank登記號(hào)nm_012449)；cancerres.61(15),5857-5860(2001),hubert,r.s.,等(1999)proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(25):14523-14528)；wo2004065577(權(quán)利要求6)；wo2004027049(附圖1l)；ep1394274(實(shí)施例11)；wo2004016225(權(quán)利要求2)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；us2003157089(實(shí)施例5)；us2003185830(實(shí)施例5)；us2003064397(附圖2)；wo200289747(實(shí)施例5；頁(yè)618-619)；wo2003022995(實(shí)施例9；附圖13a,實(shí)施例53；173頁(yè),實(shí)施例2；附圖2a)；np_036581前列腺的六跨膜上皮抗原；交叉參考:mim:604415；np_036581.1；nm_012449_1(4)0772p(ca125,muc16,genbank登記號(hào)af361486)；j.biol.chem.276(29):27371-27375(2001))；wo2004045553(權(quán)利要求14)；wo200292836(權(quán)利要求6；附圖12)；wo200283866(權(quán)利要求15；116-121頁(yè))；us2003124140(實(shí)施例16)；交叉參考p：gi:34501467；aak74120.3；af361486_1(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子(megakaryocytepotentiatingfactor),mesothelin,genbank登記號(hào)nm_005823)yamaguchi,n.,等biol.chem.269(2),805-808(1994),proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(20):11531-11536(1999),proc.natl.acad.sci.u.s.a.93(1):136-140(1996),j.biol.chem.270(37):21984-21990(1995))；wo2003101283(權(quán)利要求14)；(wo2002102235(權(quán)利要求13；287-288頁(yè))；wo2002101075(權(quán)利要求4；頁(yè)308-309)；wo200271928(320-321頁(yè))；wo9410312(52-57頁(yè))；交叉參考:mim:601051；np_005814.2；nm_005823_1(6)napi3b(napi-3b,nptiib,slc34a2,溶質(zhì)載體家族(solutecarrierfamily)34(磷酸鈉),成員2,ii型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b,genbank登記號(hào)nm_006424)j.biol.chem.277(22):19665-19672(2002),genomics62(2):281-284(1999),feild,j.a.,等(1999)biochem.biophys.res.commun.258(3):578-582)；wo2004022778(權(quán)利要求2)；ep1394274(實(shí)施例11)；wo2002102235(權(quán)利要求13；326頁(yè))；ep875569(權(quán)利要求1；17-19頁(yè))；wo200157188(權(quán)利要求20；329頁(yè))；wo2004032842(實(shí)施例iv)；wo200175177(權(quán)利要求24；139-140頁(yè))；交叉參考:mim:604217；np_006415.1；nm_006424_1(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,腦信號(hào)蛋白(semaphorin)5bhlog,sema結(jié)構(gòu)域,七血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)(seventhrombospondinrepeats)(1型(type1)和類1型(type1-like)),跨膜結(jié)構(gòu)域(tm)和短胞質(zhì)域,(腦信號(hào)蛋白)5b,genbank登記號(hào)ab040878)；nagaset.,等(2000)dnares.7(2):143-150)；wo2004000997(權(quán)利要求1)；wo2003003984(權(quán)利要求1)；wo200206339(權(quán)利要求1；50頁(yè))；wo200188133(權(quán)利要求1；頁(yè)41-43,48-58)；wo2003054152(權(quán)利要求20)；wo2003101400(權(quán)利要求11)；登記號(hào):q9p283；embl；ab040878；baa95969.1.genew；hgnc:10737(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因,genbank登記號(hào)ay358628)；ross等(2002)cancerres.62:2546-2553；us2003129192(權(quán)利要求2)；us2004044180(權(quán)利要求12)；us2004044179(權(quán)利要求11)；us2003096961(權(quán)利要求11)；us2003232056(實(shí)施例5)；wo2003105758(權(quán)利要求12)；us2003206918(實(shí)施例5)；ep1347046(權(quán)利要求1)；wo2003025148(權(quán)利要求20)；交叉參考:gi:37182378；aaq88991.1；ay358628_1(9)etbr(內(nèi)皮縮血管肽b型受體(endothelintypebreceptor),genbank登記號(hào)ay275463)；nakamutam.,等biochem.biophys.res.commun.177,34-39,1991；ogaway.,等biochem.biophys.res.commun.178,248-255,1991；araih.,等jpn.circ.j.56,1303-1307,1992；araih.,等j.biol.chem.268,3463-3470,1993；sakamotoa.,yanagisawam.,等biochem.biophys.res.commun.178,656-663,1991；elshourbagyn.a.,等j.biol.chem.268,3873-3879,1993；haendlerb.,等j.cardiovasc.pharmacol.20,s1-s4,1992；tsutsumim.,等gene228,43-49,1999；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；bourgeoisc.,等j.clin.endocrinol.metab.82,3116-3123,1997；okamotoy.,等biol.chem.272,21589-21596,1997；verheijj.b.,等am.j.med.genet.108,223-225,2002；hofstrar.m.w.,等eur.j.hum.genet.5,180-185,1997；puffenbergere.g.,等cell79,1257-1266,1994；attiet.,etal,hum.mol.genet.4,2407-2409,1995；auricchioa.,等hum.mol.genet.5:351-354,1996；amielj.,等hum.mol.genet.5,355-357,1996；hofstrar.m.w.,等nat.genet.12,445-447,1996；svenssonp.j.,等hum.genet.103,145-148,1998；fuchss.,等mol.med.7,115-124,2001；pingaultv.,等(2002)hum.genet.111,198-206；wo2004045516(權(quán)利要求1)；wo2004048938(實(shí)施例2)；wo2004040000(權(quán)利要求151)；wo2003087768(權(quán)利要求1)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200261087(附圖1)；wo2003016494(附圖6)；wo2003025138(權(quán)利要求12；144頁(yè))；wo200198351(權(quán)利要求1；頁(yè)124-125)；ep522868(權(quán)利要求8；附圖2)；wo200177172(權(quán)利要求1；頁(yè)297-299)；us2003109676；us6518404(附圖3)；us5773223(權(quán)利要求1a；col31-34)；wo2004001004(10)msg783(rnf124,推定蛋白(hypotheticalprotein)flj20315,genbank登記號(hào)nm_017763)；wo2003104275(權(quán)利要求1)；wo2004046342(實(shí)施例2)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo2003083074(權(quán)利要求14；頁(yè)61)；wo2003018621(權(quán)利要求1)；wo2003024392(權(quán)利要求2；附圖93)；wo200166689(實(shí)施例6)；交叉參考:locusid:54894；np_060233.2；nm_017763_1(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相關(guān)基因1,前列腺癌相關(guān)蛋白1,前列腺的六跨膜上皮細(xì)胞抗原2,六跨膜前列腺蛋白,genbank登記號(hào)af455138)；lab.invest.82(11):1573-1582(2002))；wo2003087306；us2003064397(權(quán)利要求1；附圖1)；wo200272596(權(quán)利要求13；頁(yè)54-55)；wo200172962(權(quán)利要求1；附圖4b)；wo2003104270(權(quán)利要求11)；wo2003104270(權(quán)利要求16)；us2004005598(權(quán)利要求22)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；us2003060612(權(quán)利要求12；附圖10)；wo200226822(權(quán)利要求23；附圖2)；wo200216429(權(quán)利要求12；附圖10)；交叉參考:gi:22655488；aan04080.1；af455138_1(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬時(shí)型受體電位陽(yáng)離子通道(transientreceptorpotentialcationchannel),亞族m,成員4,genbank登記號(hào)nm_017636)；xu,x.z.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(19):10692-10697(2001),cell109(3):397-407(2002),j.biol.chem.278(33):30813-30820(2003))；us2003143557(權(quán)利要求4)；wo200040614(權(quán)利要求14；頁(yè)100-103)；wo200210382(權(quán)利要求1；附圖9a)；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo200230268(權(quán)利要求27；391頁(yè))；us2003219806(權(quán)利要求4)；wo200162794(權(quán)利要求14；附圖1a-d)；交叉參考:mim:606936；np_060106.2；nm_017636_1(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎瘤-衍生的生長(zhǎng)因子(teratocarcinoma-derivedgrowthfactor),genbank登記號(hào)np_003203或nm_003212)；ciccodicola,a.,等emboj.8(7):1987-1991(1989),am.j.hum.genet.49(3):555-565(1991))；us2003224411(權(quán)利要求1)；wo2003083041(實(shí)施例1)；wo2003034984(權(quán)利要求12)；wo200288170(權(quán)利要求2；頁(yè)52-53)；wo2003024392(權(quán)利要求2；附圖58)；wo200216413(權(quán)利要求1；頁(yè)94-95,105)；wo200222808(權(quán)利要求2；附圖1)；us5854399(實(shí)施例2；col17-18)；us5792616(附圖2)；交叉參考:mim:187395；np_003203.1；nm_003212_1(14)cd21(cr2(補(bǔ)體受體2)或c3dr(c3d/eb病毒受體(epsteinbarrvirusreceptor))或hs.73792genbank登記號(hào)m26004)；fujisaku等(1989)j.biol.chem.264(4):2118-2125)；weisj.j.,等j.exp.med.167,1047-1066,1988；moorem.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.84,9194-9198,1987；barelm.,等mol.immunol.35,1025-1031,1998；weisj.j.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.83,5639-5643,1986；sinhas.k.,等(1993)j.immunol.150,5311-5320；wo2004045520(實(shí)施例4)；us2004005538(實(shí)施例1)；wo2003062401(權(quán)利要求9)；wo2004045520(實(shí)施例4)；wo9102536(附圖9.1-9.9)；wo2004020595(權(quán)利要求1)；登記號(hào):p20023；q13866；q14212；embl；m26004；aaa35786.1(15)cd79b(cd79b,cd79β,igb(免疫球蛋白-相關(guān)β(immunoglobulin-associatedbeta),b29,genbank登記號(hào)nm_000626或11038674)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(7):4126-4131,blood(2002)100(9):3068-3076,muller等(1992)eur.j.immunol.22(6):1621-1625)；wo2004016225(權(quán)利要求2,附圖140)；wo2003087768,us2004101874(權(quán)利要求1,頁(yè)102)；wo2003062401(權(quán)利要求9)；wo200278524(實(shí)施例2)；us2002150573(權(quán)利要求5,頁(yè)15)；us5644033；wo2003048202(權(quán)利要求1,306和309頁(yè))；wo99/558658,us6534482(權(quán)利要求13,附圖17a/b)；wo200055351(權(quán)利要求11,1145-1146頁(yè))；交叉參考:mim:147245；np_000617.1；nm_000626_1(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含有sh2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶錨定蛋白1a(sh2domaincontainingphosphataseanchorprotein1a),spap1b,spap1c,genbank登記號(hào)nm_030764,ay358130)；genomeres.13(10):2265-2270(2003),immunogenetics54(2):87-95(2002),blood99(8):2662-2669(2002),proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(17):9772-9777(2001),xu,m.j.,等(2001)biochem.biophys.res.commun.280(3):768-775；wo2004016225(權(quán)利要求2)；wo2003077836；wo200138490(權(quán)利要求5；附圖18d-1-18d-2)；wo2003097803(權(quán)利要求12)；wo2003089624(權(quán)利要求25)；交叉參考:mim:606509；np_110391.2；nm_030764_1(17)her2(erbb2,genbank登記號(hào)m11730)；coussensl.,等science(1985)230(4730):1132-1139)；yamamotot.,等nature319,230-234,1986；sembak.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.82,6497-6501,1985；swierczj.m.,等j.cellbiol.165,869-880,2004；kuhnsj.j.,等j.biol.chem.274,36422-36427,1999；choh.-s.,等nature421,756-760,2003；ehsania.,等(1993)genomics15,426-429；wo2004048938(實(shí)施例2)；wo2004027049(附圖1i)；wo2004009622；wo2003081210；wo2003089904(權(quán)利要求9)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；us2003118592；wo2003008537(權(quán)利要求1)；wo2003055439(權(quán)利要求29；附圖1a-b)；wo2003025228(權(quán)利要求37；附圖5c)；wo200222636(實(shí)施例13；95-107頁(yè))；wo200212341(權(quán)利要求68；附圖7)；wo200213847(71-74頁(yè))；wo200214503(頁(yè)114-117)；wo200153463(權(quán)利要求2；41-46頁(yè))；wo200141787(15頁(yè))；wo200044899(權(quán)利要求52；附圖7)；wo200020579(權(quán)利要求3；附圖2)；us5869445(權(quán)利要求3；col31-38)；wo9630514(權(quán)利要求2；頁(yè)56-61)；ep1439393(權(quán)利要求7)；wo2004043361(權(quán)利要求7)；wo2004022709；wo200100244(實(shí)施例3；附圖4)；登記號(hào):p04626；embl；m11767；aaa35808.1.embl；m11761；aaa35808.1(18)nca(ceacam6,genbank登記號(hào)m18728)；barnettt.,等genomics3,59-66,1988；tawaragiy.,等biochem.biophys.res.commun.150,89-96,1988；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:16899-16903,2002；wo2004063709；ep1439393(權(quán)利要求7)；wo2004044178(實(shí)施例4)；wo2004031238；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo200278524(實(shí)施例2)；wo200286443(權(quán)利要求27；頁(yè)427)；wo200260317(權(quán)利要求2)；登記號(hào):p40199；q14920；embl；m29541；aaa59915.1.embl；m18728(19)mdp(dpep1,genbank登記號(hào)bc017023)；proc.natl.acad.sci.u.s.a.99(26):16899-16903(2002))；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200264798(權(quán)利要求33；85-87頁(yè))；jp05003790(附圖6-8)；wo9946284(附圖9)；交叉參考:mim:179780；aah17023.1；bc017023_1(20)il20rα(il20ra,zcytor7,genbank登記號(hào)af184971)；clarkh.f.,等genomeres.13,2265-2270,2003；mungalla.j.,等nature425,805-811,2003；blumbergh.,等cell104,9-19,2001；dumoutierl.,等j.immunol.167,3545-3549,2001；parrish-novakj.,等j.biol.chem.277,47517-47523,2002；pletnevs.,等(2003)biochemistry42:12617-12624；sheikhf.,等(2004)j.immunol.172,2006-2010；ep1394274(實(shí)施例11)；us2004005320(實(shí)施例5)；wo2003029262(74-75頁(yè))；wo2003002717(權(quán)利要求2；63頁(yè))；wo200222153(45-47頁(yè))；us2002042366(20-21頁(yè))；wo200146261(57-59頁(yè))；wo200146232(63-65頁(yè))；wo9837193(權(quán)利要求1；55-59頁(yè))；登記號(hào)：q9uhf4；q6uwa9；q96sh8；embl；af184971；aaf01320.1(21)brevican(bcan,behab,genbank登記號(hào)af229053)；garys.c.,等gene256,139-147,2000；clarkh.f.,等genomeres.13,2265-2270,2003；strausbergr.l.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；us2003186372(權(quán)利要求11)；us2003186373(權(quán)利要求11)；us2003119131(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119122(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119126(權(quán)利要求1)；us2003119121(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119129(權(quán)利要求1)；us2003119130(權(quán)利要求1)；us2003119128(權(quán)利要求1；附圖52)；us2003119125(權(quán)利要求1)；wo2003016475(權(quán)利要求1)；wo200202634(權(quán)利要求1)(22)ephb2r(drt,erk,hek5,epht3,tyro5,genbank登記號(hào)nm_004442)；chan,j.和watt,v.m.,oncogene6(6),1057-1061(1991)oncogene10(5):897-905(1995),annu.rev.neurosci.21:309-345(1998),int.rev.cytol.196:177-244(2000))；wo2003042661(權(quán)利要求12)；wo200053216(權(quán)利要求1；頁(yè)41)；wo2004065576(權(quán)利要求1)；wo2004020583(權(quán)利要求9)；wo2003004529(128-132頁(yè))；wo200053216(權(quán)利要求1；42頁(yè))；交叉參考:mim:600997；np_004433.2；nm_004442_1(23)aslg659(b7h,genbank登記號(hào)ax092328)；us20040101899(權(quán)利要求2)；wo2003104399(權(quán)利要求11)；wo2004000221(附圖3)；us2003165504(權(quán)利要求1)；us2003124140(實(shí)施例2)；us2003065143(附圖60)；wo2002102235(權(quán)利要求13；299頁(yè))；us2003091580(實(shí)施例2)；wo200210187(權(quán)利要求6；附圖10)；wo200194641(權(quán)利要求12；附圖7b)；wo200202624(權(quán)利要求13；附圖1a-1b)；us2002034749(權(quán)利要求54；45-46頁(yè))；wo200206317(實(shí)施例2；320-321頁(yè),權(quán)利要求34；321-322頁(yè))；wo200271928(468-469頁(yè))；wo200202587(實(shí)施例1；附圖1)；wo200140269(實(shí)施例3；頁(yè)190-192)；wo200036107(實(shí)施例2；205-207頁(yè))；wo2004053079(權(quán)利要求12)；wo2003004989(權(quán)利要求1)；wo200271928(233-234,452-453頁(yè))；wo0116318(24)psca(前列腺干細(xì)胞抗原前體(prostatestemcellprecursor),genbank登記號(hào)aj297436)；reiterr.e.,等proc.natl.acad.sci.u.s.a.95,1735-1740,1998；guz.,等oncogene19,1288-1296,2000；biochem.biophys.res.commun.(2000)275(3):783-788；wo2004022709；ep1394274(實(shí)施例11)；us2004018553(權(quán)利要求17)；wo2003008537(權(quán)利要求1)；wo200281646(權(quán)利要求1；頁(yè)164)；wo2003003906(權(quán)利要求10；頁(yè)288)；wo200140309(實(shí)施例1；附圖17)；us2001055751(實(shí)施例1；附圖1b)；wo200032752(權(quán)利要求18；附圖1)；wo9851805(權(quán)利要求17；頁(yè)97)；wo9851824(權(quán)利要求10；94頁(yè))；wo9840403(權(quán)利要求2；附圖1b)；登記號(hào):o43653；embl；af043498；aac39607.1(25)geda(genbank登記號(hào)ay260763)；aap14954脂肪瘤hmgic融合-配偶體-類蛋白(lipomahmgicfusion-partner-likeprotein)/pid＝aap14954.1-人類(人)；wo2003054152(權(quán)利要求20)；wo2003000842(權(quán)利要求1)；wo2003023013(實(shí)施例3,權(quán)利要求20)；us2003194704(權(quán)利要求45)；交叉參考:gi:30102449；aap14954.1；ay260763_1(26)baff-r(b細(xì)胞-活化因子受體,blys受體3,br3,genbank登記號(hào)af116456)；baff受體/pid＝np_443177.1-人類：thompson,j.s.,等science293(5537),2108-2111(2001)；wo2004058309；wo2004011611；wo2003045422(實(shí)施例；32-33頁(yè))；wo2003014294(權(quán)利要求35；附圖6b)；wo2003035846(權(quán)利要求70；615-616頁(yè))；wo200294852(col136-137)；wo200238766(權(quán)利要求3；133頁(yè))；wo200224909(實(shí)施例3；附圖3)；交叉參考:mim:606269；np_443177.1；nm_052945_1；af132600(27)cd22(b-細(xì)胞受體cd22-b同種型,bl-cam,lyb-8,lyb8,siglec-2,flj22814,genbank登記號(hào)ak026467)；wilson等(1991)j.exp.med.173:137-146；wo2003072036(權(quán)利要求1；附圖1)；交叉參考:mim:107266；np_001762.1；nm_001771_1(28)cd79a(cd79a，cd79α，免疫球蛋白-相關(guān)α，一種b細(xì)胞-特異性蛋白，其與igβ(cd79b)共價(jià)相互作用并且在表面上與igm分子形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及b-細(xì)胞分化的信號(hào)),pi:4.84,mw:25028tm:2[p]genechromosome:19q13.2,genbank登記號(hào)np_001774.10)；wo2003088808,us20030228319；wo2003062401(權(quán)利要求9)；us2002150573(權(quán)利要求4,13-14頁(yè))；wo9958658(權(quán)利要求13,附圖16)；wo9207574(附圖1)；us5644033；ha等(1992)j.immunol.148(5):1526-1531；mueller等(1992)eur.j.biochem.22:1621-1625；hashimoto等(1994)immunogenetics40(4):287-295；preud’homme等(1992)clin.exp.immunol.90(1):141-146；yu等(1992)j.immunol.148(2)633-637；sakaguchi等(1988)emboj.7(11):3457-3464(29)cxcr5(伯基特淋巴瘤受體1(burkitt’slymphomareceptor1)，一種g蛋白偶聯(lián)受體，由cxcl13趨化因子活化，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中起作用，在hiv-2感染中起作用和可能在aids、淋巴瘤、黑素瘤和白血病發(fā)生中起作用)；372aa,pi:8.54mw:41959tm:7[p]genechromosome:11q23.3,genbank登記號(hào)np_001707.1)；wo2004040000；wo2004015426；us2003105292(實(shí)施例2)；us6555339(實(shí)施例2)；wo200261087(附圖1)；wo200157188(權(quán)利要求20,頁(yè)269)；wo200172830(12-13頁(yè))；wo200022129(實(shí)施例1,152-153頁(yè),實(shí)施例2,254-256頁(yè))；wo9928468(權(quán)利要求1,頁(yè)38)；us5440021(實(shí)施例2,col49-52)；wo9428931(56-58頁(yè))；wo9217497(權(quán)利要求7,附圖5)；dobner等(1992)eur.j.immunol.22:2795-2799；barella等(1995)biochem.j.309:773-779(30)hla-dob(mhcii類分子的β亞單位(ia抗原)，其與肽結(jié)合并且將其呈遞給cd4+t淋巴細(xì)胞)；273aa,pi:6.56,mw:30820.tm:1[p]genechromosome:6p21.3,genbank登記號(hào)np_002111.1)；tonnelle等(1985)emboj.4(11):2839-2847；jonsson等(1989)immunogenetics29(6):411-413；beck等(1992)j.mol.biol.228:433-441；strausberg等(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903；servenius等(1987)j.biol.chem.262:8759-8766；beck等(1996)j.mol.biol.255:1-13；naruse等(2002)tissueantigens59:512-519；wo9958658(權(quán)利要求13,附圖15)；us6153408(col35-38)；us5976551(col168-170)；us6011146(col145-146)；kasahara等(1989)immunogenetics30(1):66-68；larhammar等(1985)j.biol.chem.260(26):14111-14119(31)p2x5(嘌呤能受體p2x配體門控離子通道5(purinergicreceptorp2xligand-gatedionchannel5)，即由胞外atp門控的離子通道，可能涉及突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，其缺陷可以促使特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定病理生理學(xué)情況)；422aa),pi:7.63,mw:47206tm:1[p]genechromosome:17p13.3,genbank登記號(hào)np_002552.2)；le等(1997)febslett.418(1-2):195-199；wo2004047749；wo2003072035(權(quán)利要求10)；touchman等(2000)genomeres.10:165-173；wo200222660(權(quán)利要求20)；wo2003093444(權(quán)利要求1)；wo2003087768(權(quán)利要求1)；wo2003029277(82頁(yè))；(32)cd72(b-細(xì)胞分化抗原cd72,lyb-2；359aa),pi:8.66,mw:40225tm:1[p]genechromosome:9p13.3,genbank登記號(hào)np_001773.1)；wo2004042346(權(quán)利要求65)；wo2003026493(51-52,57-58頁(yè))；wo200075655(105-106頁(yè))；vonhoegen等(1990)j.immunol.144(12):4870-4877；strausberg等(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903(33)ly64(淋巴細(xì)胞抗原64(rp105)，即富含亮氨酸重復(fù)(lrr)家族i型膜蛋白(typeimemberaneproteinoftheleucinerichrepeatfamily)，調(diào)節(jié)b-細(xì)胞細(xì)胞活化和程序性細(xì)胞死亡，其功能缺失與患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者的疾病活動(dòng)增加有關(guān))；661aa,pi:6.20,mw:74147tm:1[p]genechromosome:5q12,genbank登記號(hào)np_005573.1)；us2002193567；wo9707198(權(quán)利要求11,39-42頁(yè))；miura等(1996)genomics38(3):299-304；miura等(1998)blood92:2815-2822；wo2003083047；wo9744452(權(quán)利要求8,57-61頁(yè))；wo200012130(24-26頁(yè))(34)fcrh1(fc受體-樣蛋白1(fcreceptor-likeprotein1)，即含有c2型ig-樣結(jié)構(gòu)域和itam結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的推定受體，可能在b-淋巴細(xì)胞分化中起作用)；429aa,pi:5.28,mw:46925tm:1[p]genechromosome:1q21-1q22,genbank登記號(hào)np_443170.1)；wo2003077836；wo200138490(權(quán)利要求6,附圖18e-1-18-e-2)；davis等(2001)proc.natl.acad.sciusa98(17):9772-9777；wo2003089624(權(quán)利要求8)；ep1347046(權(quán)利要求1)；wo2003089624(權(quán)利要求7)(35)irta2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，即在b細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤的生成中具有可能的作用的推定的免疫受體；由于易位所導(dǎo)致的基因失調(diào)在某些b細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)生)；977aa,pi:6.88,mw:106468,tm:1[p]genechromosome:1q21,genbank登記號(hào)人:af343662,af343663,af343664,af343665,af369794,af397453,ak090423,ak090475,al834187,ay358085；小鼠:ak089756,ay158090,ay506558；np_112571.1；wo2003024392(權(quán)利要求2,附圖97)；nakayama等(2000)biochem.biophys.res.commun.277(1):124-127；wo2003077836；wo200138490(權(quán)利要求3,附圖18b-1-18b-2)(36)tenb2(tmeff2,tomoregulin,tpef,hpp1,tr,與egf/調(diào)蛋白(heregulin)家族生長(zhǎng)因子和卵泡抑素(follistatin)有關(guān)的推定的跨膜蛋白聚糖)；374aa,ncbi登記號(hào):aad55776,aaf91397,aag49451,ncbirefseq:np_057276；ncbi基因:23671；omim:605734；swissprotq9uik5；genbank登記號(hào)af179274；ay358907,caf85723,cq782436；wo2004074320；jp2004113151；wo2003042661；wo2003009814；ep1295944(69-70頁(yè))；wo200230268(329頁(yè))；wo200190304；us2004249130；us2004022727；wo2004063355；us2004197325；us2003232350；us2004005563；us2003124579；horie等(2000)genomics67:146-152；uchida等(1999)biochem.biophys.res.commun.266:593-602；liang等(2000)cancerres.60:4907-12；glynne-jones等(2001)intjcancer.oct15；94(2):178-84。親代抗體還可以為包含清蛋白-結(jié)合肽(abp)序列的融合蛋白(dennis等(2002)“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins”jbiolchem.277:35035-35043；wo01/45746)。本發(fā)明的抗體包括具有下列文獻(xiàn)中教導(dǎo)的abp序列的融合蛋白:(i)dennis等(2002)jbiolchem.277:35035-35043，表iii和iv,35038頁(yè)；(ii)us20040001827，在[0076]；和(iii)wo01/45746，在12-13頁(yè)，并且將所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。誘變可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的多種方法制備編碼起始多肽的氨基酸序列變體的dna。這些方法包括，但不限于通過(guò)位點(diǎn)-定向(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、pcr誘變和對(duì)編碼所述多肽的較早制備的dna的盒式誘變制備。還可以通過(guò)限制片段操作或通過(guò)使用合成寡核苷酸的重疊延伸pcr構(gòu)建重組抗體的變體。誘變引物編碼半胱氨酸密碼子替代物。標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)可以用于產(chǎn)生編碼這類突變的半胱氨酸改造的抗體的dna。一般指導(dǎo)原則可以在下列文獻(xiàn)中找到：sambrook等molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；和ausubel等currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishing和wiley-interscience,newyork,n.y.,1993。位點(diǎn)-定向誘變?yōu)橐环N制備替代變體，即突變蛋白的方法。這項(xiàng)技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知(例如，參見(jiàn),carter(1985)等nucleicacidsres.13:4431-4443；ho等(1989)基因(amst.)77:51-59；和kunkel等(1987)proc.natl.acad.sci.usa82:488)。簡(jiǎn)言之，在進(jìn)行dna位點(diǎn)-定向誘變過(guò)程中，通過(guò)首先使編碼所需突變的寡核苷酸與這類起始dna的單鏈雜交來(lái)改變起始dna。在雜交后，將dna聚合酶用于使用雜交的寡核苷酸作為引物并且使用起始dna單鏈作為模板合成完整的第二鏈。因此，將編碼所需突變的寡核苷酸摻入所得雙鏈dna。位點(diǎn)-定向誘變可以在表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)預(yù)進(jìn)行誘變的蛋白質(zhì)的基因中進(jìn)行，并且可以對(duì)所得質(zhì)粒測(cè)序以便證實(shí)引入了所需的半胱氨酸替代突變(liu等(1998)j.biol.chem.273:20252-20260)。位點(diǎn)-定向方案和方式，包括那些商購(gòu)的方案和方式，例如multisite-directedmutagenesiskit(stratagene,lajolla,ca)。pcr誘變還適合于制備起始多肽的氨基酸序列變體。參見(jiàn)higuchi,(1990)：pcrprotocols,pp.177-183,academicpress；ito等(1991)基因102:67-70；bernhard等(1994)bioconjugatechem.5:126-132；和vallette等(1989)nuc.acidsres.17:723-733。簡(jiǎn)言之，當(dāng)將少量模板dna用作pcr中的起始物時(shí)，在序列方面稍不同于模板dna中相應(yīng)區(qū)的引物可以用于產(chǎn)生相對(duì)大量的特異性dna片段，這些片段僅在引物不同于模板的位置上不同于模板序列。用于制備變體的另一種方法，即盒式誘變基于wells等(1985)基因34:315-323所述的技術(shù)。起始物為包含預(yù)突變的起始多肽dna的質(zhì)粒(或其它載體)。鑒定預(yù)突變的起始dna中的密碼子。在鑒定的突變位點(diǎn)的每側(cè)上必須存在獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。如果不存在這類限制位點(diǎn)，那么可以使用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法產(chǎn)生它們，以便將其引入起始多肽dna的適當(dāng)位置上。在這些位點(diǎn)上切割質(zhì)粒dna以使其線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)操作步驟合成編碼在限制位點(diǎn)之間但含有所需突變的dna序列的雙鏈寡核苷酸。其中分別合成寡核苷酸的兩條鏈然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此雜交。通過(guò)亞磷酰胺合成法(phosphoramiditesynthesismethod)制備寡核苷酸(us4415732；us4458066；beaucage,s.和iyer,r.(1992)"advancesinthesynthesisofoligonucleotidesbythephosphoramiditeapproach",tetrahedron48:2223-2311).這種雙鏈寡核苷酸稱作盒(cassette)。將這種盒設(shè)計(jì)成具有與線性化質(zhì)粒末端相容的5'和3'末端，使得它可以直接連接質(zhì)粒。這種質(zhì)粒目前含有突變的dna序列?？梢酝ㄟ^(guò)dna測(cè)序證實(shí)含有編碼的半胱氨酸替代物的突變dna。還通過(guò)寡核苷酸定向誘變，使用經(jīng)pcr的誘變的雙鏈質(zhì)粒dna作為模板產(chǎn)生單突變(sambrook和russel,(2001)molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition；zoller等(1983)methodsenzymol.100:468-500；zoller,m.j.和smith,m.(1982)nucl.acidsres.10:6487-6500)。在本發(fā)明中，在m13噬菌體上展示的hu4d5fabv8(gerstner等(2002)“sequenceplasticityintheantigen-bindingsiteofatherapeuticanti-her2antibody”,jmolbiol.321:851-62)作為模型系統(tǒng)用于實(shí)驗(yàn)。將半胱氨酸突變引入hu4d5fabv8-噬菌體、hu4d5fabv8和abp-hu4d5fabv8構(gòu)建體。如上所述使用聚乙二醇(peg)沉淀法進(jìn)行hu4d5-thiofab-噬菌體制備(lowman,henryb.(1998)methodsinmolecularbiology(totowa,newjersey)87(combinatorialpeptidelibraryprotocols)249-264)。pheselector測(cè)定pheselector(用于選擇反應(yīng)性硫醇的噬菌體elisa)測(cè)定法能夠以elisa噬菌體方式檢測(cè)抗體中反應(yīng)性半胱氨酸基團(tuán)。實(shí)施例2中詳細(xì)描述了在孔表面上包被所關(guān)注的蛋白質(zhì)(例如抗體)，隨后與噬菌粒一起溫育且然后使用吸光度檢測(cè)hrp標(biāo)記的二抗的過(guò)程。可以以快速、有力和高流通量方式篩選噬菌體上展示的突變蛋白?？梢允褂脧目贵w或其它蛋白的隨機(jī)蛋白質(zhì)-噬菌體文庫(kù)鑒定游離cys摻入的適當(dāng)反應(yīng)位點(diǎn)相同的手段生產(chǎn)半胱氨酸改造的抗體的文庫(kù)并且進(jìn)行結(jié)合篩選。這項(xiàng)技術(shù)包括使噬菌體上展示的半胱氨酸突變體與也為硫醇反應(yīng)性的親和試劑或報(bào)告基團(tuán)反應(yīng)。附圖8通過(guò)描繪fab或thiofab與her2(上)和生物素化的thiofab與鏈霉抗生物素(下)結(jié)合的示意圖例示了pheselector測(cè)定。蛋白質(zhì)表達(dá)和純化易于使用常規(guī)操作步驟(例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)分離編碼半胱氨酸改造的抗體的dna并且對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞用作這類dna的來(lái)源。一旦分離，就可以將dna放入表達(dá)載體，然后將其轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴cos細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞或其它不額外產(chǎn)生抗體蛋白的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，諸如骨髓瘤細(xì)胞(us5807715；us2005/0048572；us2004/0229310)，以便獲得重組宿主中合成的單克隆抗體。hu4d5fabv8半胱氨酸改造的抗體的產(chǎn)率與野生型hu4d5fabv8相似。有關(guān)細(xì)菌中編碼抗體的dna的重組表達(dá)的綜述文章包括skerra等(1993)curr.opinioninimmunol.5:256-262和plückthun(1992)immumol.revs.130:151-188。在設(shè)計(jì)和選擇后，可以通過(guò)下列方式生產(chǎn)具有高度反應(yīng)性的未配對(duì)的cys殘基的半胱氨酸改造的抗體，例如thiofab：(i)在細(xì)菌，例如大腸桿菌系統(tǒng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)(wo01/00245)，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho)；和(ii)使用常用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化(lowman等(1991)j.biol.chem.266(17):10982-10988)。在34b8，即非-阻抑性大腸桿菌菌株中誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)thiofab(baca等(1997)journalbiologicalchemistry272(16):10678-84)。參見(jiàn)實(shí)施例3a。將收集的細(xì)胞沉淀重新懸浮于pbs(磷酸緩沖鹽水)中，通過(guò)經(jīng)過(guò)微流化儀(microfluidizer)進(jìn)行總細(xì)胞裂解并且通過(guò)使用蛋白質(zhì)gsepharosetm(amersham)的親和層析法純化thiofab。如上所述使thiofab與生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)并且通過(guò)superdex-200tm(amersham)凝膠過(guò)濾層析法進(jìn)一步純化生物素化-thiofab，從而消除了游離的生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺和thiofab的寡聚化級(jí)分。質(zhì)譜分析使用液相層析電噴射離子化質(zhì)譜(lc-esi-ms)分析對(duì)生物素偶聯(lián)的fab進(jìn)行精確分子量測(cè)定(cole,r.b.electrosprayionizationmassspectrometry:fundamentals,instrumentationandapplications.(1997)wiley,newyork)。通過(guò)胰蛋白酶消化，隨后通過(guò)lc-esi-串聯(lián)ms分析測(cè)定生物素化的hu4d5fabv8(a121c)的氨基酸序列(表4,實(shí)施例3b)?？贵wfab片段hu4d5fabv8含有約445個(gè)氨基酸殘基，包括10個(gè)cys殘基(5個(gè)在輕鏈上，且5個(gè)在重鏈上)。已經(jīng)確立了人源化4d5可變片段(fv4d5)的高分辨結(jié)構(gòu)，參見(jiàn):eigenbrot等“x-raystructuresoftheantigen-bindingdomainsfromthreevariantofhumanizedanti-p185her2antibody4d5和comparisonwithmolecularmodeling”(1993)jmolbiol.229:969-995)。所有的cys殘基均以二硫鍵形式存在，由此這些殘基不具有任何與藥物-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的反應(yīng)性硫醇(reactive-thiolgroup)(除非用還原劑處理)。因此，新改造的cys殘基可以保持不配對(duì)并且能夠與親電子接頭試劑或藥物-接頭中間體(drug-linkerintermediate)，諸如藥物-馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)，即與之偶聯(lián)。附圖1a表示x-射線晶體坐標(biāo)衍生的hu4d5fabv8抗體片段的三維示意圖。按照順序標(biāo)號(hào)系統(tǒng)給重鏈和輕鏈的改造的cys殘基的結(jié)構(gòu)位置編號(hào)。這種順序編號(hào)系統(tǒng)(sequentialnumberingsystem)與kabat編號(hào)系統(tǒng)相關(guān)(kabat等,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)，而kabat編號(hào)系統(tǒng)用于附圖1b的曲妥單抗(trastuzumab)的4d5v7fabh變體，該附圖表示從n-末端開(kāi)始的順序編號(hào)方案(上行)，它不同于kabat編號(hào)方案(下行)的方面在于a、b、c標(biāo)注的插入。使用kabat編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可以含有相當(dāng)于可變域的fr或cdr的縮短或插入的較少或額外的氨基酸。通過(guò)下表中的順序編號(hào)和kabat編號(hào)方案鑒定半胱氨酸改造的重鏈變體位點(diǎn)：與fab蛋白比較可以快速篩選m13噬菌粒-cys突變體fab(附圖3a和3b)。可以通過(guò)在elisa平板上分別包被her2和鏈霉抗生物素，隨后如實(shí)施例2中所述和附圖8中描繪的用抗-fab-hrp(辣根過(guò)氧化物酶)探測(cè)測(cè)試結(jié)合抗原和鏈霉抗生物素的噬菌粒-thiofab。該方法能夠用改造的cys殘基/偶聯(lián)的生物素分子同時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)抗原結(jié)合和硫醇反應(yīng)性的作用。此外，該方法可以應(yīng)用于篩選在m13噬菌體上展示的任意蛋白質(zhì)的反應(yīng)性硫醇。通過(guò)單純peg沉淀純化偶聯(lián)或未偶聯(lián)的噬菌粒-thiofab。人源化4d5的抗原-結(jié)合片段(hu4d5fab)在大腸桿菌中充分表達(dá)并且已經(jīng)在噬菌體上得到展示(garrard等(1993)基因128:103-109)。在基于elisa的測(cè)定法中在作為模型系統(tǒng)的m13噬菌體上展示抗體fab片段hu4d5fabv8以便探測(cè)硫醇反應(yīng)性。附圖8為pheselector測(cè)定法的示意圖，其描繪了生物素化的thiofab噬菌體和抗-噬菌體hrp抗體與her2(上)和鏈霉抗生物素(下)的結(jié)合。最初從作為距抗原結(jié)合表面較遠(yuǎn)的晶體結(jié)構(gòu)信息中選擇5個(gè)氨基酸殘基(l-ala43、h-ala40、h-ser119、h-ala121和h-ser122)(eigenbrot等(1993)jmolbiol.229:969-995)。將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)x-射線晶體結(jié)構(gòu)命名為1fvc。通過(guò)位點(diǎn)定向誘變?cè)谶@些位置上改造cys殘基。分離thiofab-噬菌體制品并且使其與生物素化試劑反應(yīng)。使用基于elisa的pheselector測(cè)定法(附圖8,實(shí)施例2)與hrp(辣根過(guò)氧化物酶)-偶聯(lián)的抗-噬菌體抗體測(cè)試生物素偶聯(lián)和未偶聯(lián)物的變體的her2和鏈霉抗生物素結(jié)合。通過(guò)顯色標(biāo)準(zhǔn)hrp反應(yīng)并且在450nm處測(cè)定吸光度用抗-m13-辣根過(guò)氧化物酶(hrp)抗體監(jiān)測(cè)未-生物素化的噬菌體-hu4d5fabv8(附圖2a)和生物素化的噬菌體-hu4d5fabv8(附圖2b)與bsa(空心條)、her2(灰色條)或鏈霉抗生物素(實(shí)心條)的相互作用。在450nm處測(cè)定因顯色底物的更新(turnover)產(chǎn)生的吸光度。thiofab與her2的反應(yīng)性確定抗原結(jié)合。thiofab與鏈霉抗生物素的反應(yīng)性確定生物素化程度。thiofab與bsa的反應(yīng)性為非特異性相互作用的陰性對(duì)照。正如在附圖2a中觀察到的，所有thiofab-噬菌體變體均具有與野生型hu4d5fabv8-噬菌體相似的與her2的結(jié)合。此外，與生物素偶聯(lián)不會(huì)干擾thiofab與her2結(jié)合(附圖2b)。令人驚奇和出人意料的是，thiofab-噬菌體樣品表現(xiàn)出可變水平的鏈霉抗生物素結(jié)合活性。在來(lái)自所有測(cè)試的噬菌體-thiofab中，a121c半胱氨酸改造的抗體表現(xiàn)出最大的硫醇反應(yīng)性。盡管將野生型hu4d5fabv8-噬菌體與相同量的生物素-馬來(lái)酰亞胺一起孵育，但是這些噬菌體幾乎沒(méi)有鏈霉抗生物素結(jié)合，表明預(yù)先存在來(lái)自hu4d5fabv8和m13噬菌體包膜蛋白的半胱氨酸殘基(涉及二硫鍵形成)不會(huì)干擾生物素-馬來(lái)酰亞胺的位點(diǎn)-特異性偶聯(lián)。這些結(jié)果表明可以將噬菌體elisa測(cè)定法成功地用于篩選fab表面上的反應(yīng)性硫醇。pheselector測(cè)定法能夠篩選抗體中的反應(yīng)性硫醇。通過(guò)該方法鑒定a121c變體是典型的?？梢杂行У匮芯客暾膄ab分子以便鑒定更多的帶有反應(yīng)性硫醇的thiofab變體。參數(shù)，表面可接近分?jǐn)?shù)(fractionalsurfaceaccessibility)，用于鑒定和定量溶劑與多肽中的氨基酸殘基的可接近性。將表面可接近性表示為可以由溶劑分子，例如水接觸的表面積水占據(jù)的空間近似為半徑球體。軟件為自由可獲得的或經(jīng)許可的(secretarytoccp4,daresburylaboratory,warrington,wa44ad,unitedkingdom,fax:(+44)1925603825，或通過(guò)因特網(wǎng)：www.ccp4.ac.uk/dist/html/index.html)，如使用計(jì)算具有已知x射線衍射晶體分析法衍生的坐標(biāo)的每種蛋白質(zhì)的氨基酸的表面可接近性的算法的晶體學(xué)程序ccp4suite(“theccp4suite:programsforproteincrystallography”(1994)acta.cryst.d50:760-763)。執(zhí)行表面可接近性計(jì)算的兩種典型的軟件模塊為“areaimol”和“surface”，其基于b.lee和f.m.richards的算法(1971)j.mol.biol.55:379-400。areaimol將蛋白質(zhì)的溶劑可接近表面定義為探針球(probesphere)(代表溶劑分子)中心的位置，此時(shí)它在蛋白質(zhì)的vanderwaals表面上翻轉(zhuǎn)。areaimol計(jì)算溶劑可接近的表面積，通過(guò)在有關(guān)每一原子的擴(kuò)充的球體上產(chǎn)生表面點(diǎn)(在距等于原子和探針半徑總和的原子中心的距離處)，并且消除屬于與相鄰原子結(jié)合的等同球體內(nèi)的那些點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。areaimol測(cè)定了pdb坐標(biāo)文件中原子的溶劑可接近面積并且概括了殘基、鏈和完整分子的可接近面積?？梢詫⒏髟拥目山咏娣e(或面積差)存儲(chǔ)成假擬-pdb輸出文件。areaimol推定了每一成分的單一半徑并且僅識(shí)別有限數(shù)量的不同成分。將未知原子類型(即那些在areaimol內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的原子類型)指定為的缺省半徑。識(shí)別的原子的列表為：areaimol和surface報(bào)導(dǎo)了絕對(duì)可接近性，即數(shù)。通過(guò)參比多肽內(nèi)的相關(guān)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)計(jì)算表面可接近分?jǐn)?shù)。參比狀態(tài)為三肽gly-x-gly，其中x為所關(guān)注的氨基酸，且參比狀態(tài)應(yīng)為'擴(kuò)展的'構(gòu)象，即如那些在β-鏈中的構(gòu)象。擴(kuò)展的構(gòu)象使可接近性x達(dá)到最大值。用計(jì)算的可接近面積除以gly-x-gly三肽參比狀態(tài)中可接近的面積并且報(bào)導(dǎo)商數(shù)，其為可接近分?jǐn)?shù)?？山咏园俜直葹榭山咏?jǐn)?shù)乘以100。計(jì)算表面可接近性的另一種典型算法基于程序xsae的solv模塊(broger,c.,f.hoffman-laroche,basel)，它基于多肽的x-射線坐標(biāo)計(jì)算氨基酸殘基與水球體的可接近分?jǐn)?shù)。使用晶體結(jié)構(gòu)信息計(jì)算hu4d5fabv7中的每個(gè)氨基酸的表面可接近分?jǐn)?shù)(eigenbrot等(1993)jmolbiol.229:969-995；us7521541)。將下列兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于鑒定可以改造以便用cys殘基替代的hu4d5fabv8的殘基：1.消除完全掩蔽的氨基酸殘基，即小于10％的表面可接近分?jǐn)?shù)。hu4d5fabv8中存在大于10％可接近性(表面可接近分?jǐn)?shù))的134(輕鏈)和151(重鏈)個(gè)殘基。選擇上部的10個(gè)最可接近的ser、ala和val殘基是因其它氨基酸與cys的結(jié)構(gòu)更相似，從而由新改造的cys向抗體中引入了僅為最小的結(jié)構(gòu)約束。還可以篩選其它半胱氨酸替代位點(diǎn)并且可以用于偶聯(lián)。2.基于其在fab的功能和結(jié)構(gòu)相互作用中的作用分選殘基。進(jìn)一步選擇抗原相互作用中未涉及并且遠(yuǎn)離存在的二硫鍵的殘基。新改造的cys殘基應(yīng)不參與(distinctfrom)并且不干擾抗原結(jié)合，也不會(huì)與二硫鍵形成中涉及的半胱氨酸錯(cuò)配。硫醇反應(yīng)性可以廣泛化至任意的抗體，其中氨基酸被反應(yīng)性半胱氨酸氨基酸替代在選自下列的輕鏈范圍內(nèi)進(jìn)行：l-10－l-20；l-38－l-48；l-105－l-115；l-139－l-149；l-163－l-173；和選自下列的重鏈范圍內(nèi)進(jìn)行：h-35－h(huán)-45；h-83－h(huán)-93；h-114－h(huán)-127；和h-170－h(huán)-184；和選自下列范圍的fc區(qū)中進(jìn)行：h-268－h(huán)-291；h-319－h(huán)-344；h-370－h(huán)-380；和h-395－h(huán)-405。硫醇反應(yīng)性可以廣泛化至抗體的某些結(jié)構(gòu)域，諸如輕鏈恒定域(cl)和重鏈恒定域ch1、ch2和ch3。產(chǎn)生約0.8和0.8以上硫醇反應(yīng)值的半胱氨酸替代可以在如下完整抗體的重鏈恒定域α、δ、ε、γ和μ中進(jìn)行：分別為iga、igd、ige、igg和igm，包括igg亞類：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。從晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)中顯然可以看出選擇的10種cys突變體遠(yuǎn)離抗原-結(jié)合部位，諸如在這種情況下的與her2的界面。可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試這些突變體對(duì)功能相互作用的間接影響。測(cè)定所有cysfab變體的硫醇反應(yīng)性并且如實(shí)施例1和2中所述計(jì)算且列在表1中。殘基l-v15c、l-v110c、h-a88c和h-a121c具有反應(yīng)性且穩(wěn)定的硫醇(附圖3a和3b)。突變體v15c、v110c、a144c、s168c為輕鏈cys變體。突變體a88c、a121c、a175c、s179c為重鏈cys變體。令人驚奇和出人意料的是具有高表面可接近分?jǐn)?shù)的位點(diǎn)不具有通過(guò)pheselector測(cè)定法計(jì)算的最高硫醇反應(yīng)性(表1)。換句話說(shuō)，表面可接近分?jǐn)?shù)(附圖1a)與硫醇反應(yīng)性不相關(guān)(表1)。實(shí)際上，在具有20％－80％的中度表面可接近性的位點(diǎn)上改造的cys殘基(附圖4a)或部分暴露的位點(diǎn)，如ala或val殘基表現(xiàn)出優(yōu)于在ser殘基上引入的cys的硫醇反應(yīng)性，即>0.6(附圖3b,表1)，由此必須在硫醇反應(yīng)位點(diǎn)篩選中使用pheselector測(cè)定，因?yàn)閮H晶體結(jié)構(gòu)信息不足以選擇這些位點(diǎn)(附圖3b和4a)。硫醇反應(yīng)性數(shù)據(jù)如附圖3a和3b中對(duì)4d5thiofabcys突變體:(3a)未-生物素化(對(duì)照組)和(3b)生物素化的噬菌體-thiofab的氨基酸殘基所示。通過(guò)對(duì)未-生物素化的噬菌體-hu4d5fabv8(3a)和生物素化的噬菌體-hu4d5fabv8(3b)與bsa(空心條)、her2(灰色條)或鏈霉抗生物素(實(shí)心條)相互作用的pheselector測(cè)定分析鑒定抗體/fab上的反應(yīng)性硫醇。如實(shí)施例2中所述進(jìn)行測(cè)定。輕鏈變體位于左側(cè)，而重鏈變體位于右側(cè)。未-生物素化的4d5thiofabcys突變體的結(jié)合如所預(yù)計(jì)的低，但與her2的強(qiáng)力結(jié)合得到保持。與鏈霉抗生物素和與生物素化的4d5thiofabcys突變體的her2結(jié)合比得到表1中的硫醇反應(yīng)值。在450nm處的背景吸光度或生物素化的4d5thiofabcys突變體與bsa的少量非特異性蛋白結(jié)合也在附圖3b中顯而易見(jiàn)。被cys殘基替代的選擇的氨基酸殘基的表面可接近分?jǐn)?shù)值如附圖4a中所示。根據(jù)可得到的hu4d5fabv7結(jié)構(gòu)計(jì)算表面可接近分?jǐn)?shù)(eigenbrot等(1993)jmolbiol.229:969-995)。hu4d5fabv7和hu4d5fabv8結(jié)構(gòu)的構(gòu)象參數(shù)高度一致并且能夠測(cè)定hu4d5fabv7的表面可接近分?jǐn)?shù)計(jì)算與hu4d5fabv8半胱氨酸突變體的硫醇反應(yīng)性之間的任何相關(guān)性。在部分暴露的殘基(ala或val)上引入的噬菌體thiofabcys殘基的經(jīng)測(cè)定的硫醇反應(yīng)性具有優(yōu)于在ser殘基上引入的cys殘基硫醇反應(yīng)性(表1)。從來(lái)自表1的thiofabcys突變體中可以觀察到在硫醇反應(yīng)性值與表面可接近分?jǐn)?shù)之間幾乎沒(méi)有或無(wú)相關(guān)性?？贵w的l-15、l-43、l-110、l-144、l-168、h-40、h-88、h-119、h-121、h-122、h-175和h-179位置上的氨基酸一般可以被游離半胱氨酸氨基酸突變(替代)。在這些位置的每側(cè)上約5個(gè)氨基酸殘基內(nèi)的范圍也可以被游離半胱氨酸替代，即l-10－l-20；l-38－l-48；l-105－l-115；l-139－l-149；l-163－l-173；h-35－h(huán)-45；h-83－h(huán)-93；h-114－h(huán)-127；和h-170－h(huán)-184，以及選自下列的fc區(qū)的范圍內(nèi)：h-268－h(huán)-291；h-319－h(huán)-344；h-370－h(huán)-380；和h-395－h(huán)-405，從而得到本發(fā)明的半胱氨酸改造的抗體。表1噬菌體-thiofab的硫醇反應(yīng)性l＝輕鏈,h＝重鏈,a＝丙氨酸,s＝絲氨酸,v＝纈氨酸,c＝半胱氨酸*將硫醇反應(yīng)性測(cè)定為鏈霉抗生物素結(jié)合的od450nm與her2(抗體)結(jié)合的od450nm之比(實(shí)施例2)。硫醇反應(yīng)性值為1表示半胱氨酸硫醇的完全生物素化。選擇兩種來(lái)自輕鏈的cys變體(l-v15c和l-v110c)和兩種來(lái)自重鏈的cys變體(h-a88c和h-a121c)用于進(jìn)一步分析，因?yàn)檫@些變體表現(xiàn)出最高的硫醇反應(yīng)性(表1)。不同于噬菌體純化，fab制備可能需要2-3天，這取決于生產(chǎn)規(guī)模。在此期間，因氧化而導(dǎo)致硫醇反應(yīng)性喪失。為了探測(cè)hu4d5fabv8-噬菌體上硫醇的穩(wěn)定性，測(cè)定了噬菌體-thiofab的硫醇反應(yīng)性的穩(wěn)定性(附圖4b)。在第1天、第2天和第4天進(jìn)行thiofab-噬菌體純化后，使所有樣品與生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)并且用噬菌體elisa測(cè)定法(pheselector)探測(cè)以測(cè)試her2和鏈霉抗生物素結(jié)合。l-v15c、l-v110c、h-a88c和h-a121c與其它thiofab變體相比保持了顯著的硫醇反應(yīng)性(附圖4b)。標(biāo)記的半胱氨酸改造的抗體本發(fā)明的半胱氨酸改造的抗體可以與任意標(biāo)記部分(labelmoiety)偶聯(lián)，所述的標(biāo)記部分可以通過(guò)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇與該抗體共價(jià)結(jié)合(singh等(2002)anal.biochem.304:147-15；harlowe.和lane,d.(1999)usingantibody:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny；lundbladr.l.(1991)chemical試劑forproteinmodification,2nded.crcpress,bocaraton,fl)。結(jié)合的標(biāo)記可以起如下作用：(i)提供可檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)；(ii)與第二種標(biāo)記發(fā)生相互作用以改變由第一種或第二種標(biāo)記提供的可檢測(cè)信號(hào)，例如得到fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；(iii)使相互作用穩(wěn)定或增加與抗原或配體的結(jié)合親和力；(iv)通過(guò)電荷、親水性、形狀或其它物理參數(shù)影響運(yùn)動(dòng)性，例如電泳遷移率或細(xì)胞滲透性；或(v)提供捕捉部分(capturemoiety)，以調(diào)節(jié)配體親和力、抗體/抗原結(jié)合或離子絡(luò)合。標(biāo)記的半胱氨酸改造的抗體可以用于診斷試驗(yàn)，例如用于檢測(cè)所關(guān)注抗原在特異性細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)。就診斷應(yīng)用而言，一般用可檢測(cè)部分標(biāo)記該抗體?？衫么罅繕?biāo)記，一般可以將它們分成如下類：(a)放射性同位素(放射性核素)，諸如3h、11c、14c、18f、32p、35s、64cu、68ga、86y、89zr、99tc、111in、123i、124i、125i、131i、133xe、177lu、211at、或213bi。放射性同位素標(biāo)記的抗體用于受體靶向的成像實(shí)驗(yàn)。可以使用currentprotocolsinimmunology,(1991)volumes1和2,coligen等,ed.wiley-interscience,newyork,ny,pubs.中所述的技術(shù)用配體試劑標(biāo)記抗體，所述配體試劑結(jié)合、螯合乃至復(fù)合放射性同位素金屬，其中所述試劑與改造的抗體的半胱氨酸硫醇反應(yīng)。可以復(fù)合金屬離子的螯合配體包括dota、dotp、dotma、dtpa和teta(macrocyclics,dallas,tx)。可以通過(guò)與本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物復(fù)合靶向放射性核素(wu等(2005)naturebiotechnology23(9):1137-1146)。dota-馬來(lái)酰亞胺試劑與半胱氨酸改造的抗體的游離半胱氨酸氨基酸反應(yīng)并且得到抗體上的金屬?gòu)?fù)合配體(lewis等(1998)bioconj.chem.9:72-86)。螯合接頭標(biāo)記試劑，諸如dota-nhs(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸一(n-羥基琥珀酰亞胺酯)為商購(gòu)的(macrocyclics,dallas,tx)。使用放射性核素標(biāo)記的抗體成像的受體靶標(biāo)可以通過(guò)檢測(cè)和定量腫瘤組織中抗體的進(jìn)行性蓄積提供活化途徑標(biāo)記(albert等(1998)bioorg.med.chem.lett.8:1207-1210)。用于成像實(shí)驗(yàn)的適合于作為抗體標(biāo)記的金屬-螯合物復(fù)合物(us2010/0111856；us5342606；us5428155；us5316757；us5480990；us5462725；us5428139；us5385893；us5739294；us5750660；us5834456；hnatowich等(1983)j.immunol.methods65:147-157；meares等(1984)anal.biochem.142:68-78；mirzadeh等(1990)bioconjugatechem.1:59-65；meares等(1990)j.cancer1990,suppl.10:21-26；izard等(1992)bioconjugatechem.3:346-350；nikula等(1995)nucl.med.biol.22:387-90；camera等(1993)nucl.med.biol.20:955-62；kukis等(1998)j.nucl.med.39:2105-2110；verel等(2003)j.nucl.med.44:1663-1670；camera等(1994)j.nucl.med.21:640-646；ruegg等(1990)cancerres.50:4221-4226；verel等(2003)j.nucl.med.44:1663-1670；lee等(2001)cancerres.61:4474-4482；mitchell,等(2003)j.nucl.med.44:1105-1112；kobayashi等(1999)bioconjugatechem.10:103-111；miederer等(2004)j.nucl.med.45:129-137；denardo等(1998)clinicalcancerresearch4:2483-90；blend等(2003)cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals18:355-363；nikula等(1999)j.nucl.med.40:166-76；kobayashi等(1998)j.nucl.med.39:829-36；mardirossian等(1993)nucl.med.biol.20:65-74；roselli等(1999)cancerbiotherapy&radiopharmaceuticals,14:209-20)。(b)熒光標(biāo)記，諸如稀土元素螯合物(銪螯合物)；熒光素類，包括fitc、5-羧基熒光素、6-羧基熒光素；若丹明類，包括tamra；丹酰；麗絲胺(lissamine)；花青(cyanines)；藻紅蛋白；德克薩斯紅；及其類似物。例如，可以使用同上文的currentprotocolsinimmunology中披露的技術(shù)使熒光標(biāo)記與抗體偶聯(lián)。熒光染料和熒光標(biāo)記試劑包括商購(gòu)自invitrogen/molecularprobes(eugene,or)和piercebiotechnology,inc.(rockford,il)的那些熒光染料和熒光標(biāo)記試劑。檢測(cè)標(biāo)記，諸如熒光染料和化學(xué)發(fā)光染料(briggs等(1997)"synthesisoffunctionalisedfluorescentdyes和theircouplingtoaminesandaminoacids,"j.chem.soc.,perkin-trans.1:1051-1058)提供了可檢測(cè)信號(hào)并且一般應(yīng)用于標(biāo)記抗體，這些抗體優(yōu)選具有如下特性：(i)標(biāo)記的抗體應(yīng)產(chǎn)生極高的信號(hào)與低背景，使得可以在無(wú)細(xì)胞和基于細(xì)胞的試驗(yàn)中靈敏地檢測(cè)少量抗體；和(ii)標(biāo)記的抗體應(yīng)是光穩(wěn)定的，以便可以觀察、監(jiān)測(cè)和記錄熒光信號(hào)，而無(wú)顯著的光漂白。就涉及標(biāo)記抗體與膜或細(xì)胞表面，尤其是活細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合的應(yīng)用而言，標(biāo)記優(yōu)選(iii)具有良好的水溶性以便獲得有效偶聯(lián)物濃度和檢測(cè)靈敏度和(iv)對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒性，以便不會(huì)破壞細(xì)胞的正常代謝過(guò)程或?qū)е逻^(guò)早細(xì)胞死亡。(c)各種酶-底物標(biāo)記為可得到的或披露的(us4275149)。酶一般催化可以使用各種技術(shù)測(cè)定的顯色底物的化學(xué)改變。例如，酶可催化底物中的顏色改變，而這種改變可以通過(guò)分光光度法測(cè)定。或者，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。用于定量熒光改變的技術(shù)如上所述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)變成電激發(fā)的且然后可以發(fā)射可測(cè)定的光(例如使用化學(xué)發(fā)光計(jì))或給熒光接受器提供能量。酶促標(biāo)記的實(shí)例包括：熒光素酶(例如熒火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；us4737456)；螢光素；2,3-二酞嗪二酮類；蘋果酸脫氫酶；尿素酶；過(guò)氧化物酶，諸如辣根過(guò)氧化物酶(hrp)；堿性磷酸酶(ap)；β-半乳糖苷酶；葡萄糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)；雜環(huán)氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)；乳過(guò)氧化物酶；微過(guò)氧化物酶等。用于使酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)描述在o'sullivan等(1981)“methodsforthepreparationofenzyme-antibodycojugateforuseinenzymeimmunoassay”：methodsinenzym.(edj.langone&h.vanvunakis),academicpress,newyork,73:147-166中。酶-底物組合的實(shí)例(us4275149；us4318980)包括，例如：(i)辣根過(guò)氧化物酶(hrp)與作為底物的過(guò)氧化氫酶，其中過(guò)氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(opd)或3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(tmb))；(ii)堿性磷酸酶(ap)與作為顯色底物的磷酸對(duì)-硝基苯基酯；和(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)與顯色底物(例如對(duì)-硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-d-半乳糖苷酶。標(biāo)記可以與半胱氨酸改造的抗體間接偶聯(lián)。例如，抗體可以與生物素偶聯(lián)，并且上述三大類標(biāo)記中的任意類可以與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素偶聯(lián)，或反之亦然。生物素選擇性地結(jié)合鏈霉抗生物素，且由此標(biāo)記可以按照這種間接方式與抗體偶聯(lián)?；蛘?，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與多肽變體的間接偶聯(lián)，使多肽變體與小的半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)并且上述不同類型標(biāo)記之一與抗-半抗原多肽變體偶聯(lián)(例如抗-地高辛抗體)。因此，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與多肽變體的間接偶聯(lián)(hermanson,g.(1996)inbiocojugatetechniquesacademicpress,sandiego)。本發(fā)明的多肽變體可以用于任意已知的測(cè)定方法中，諸如elisa、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法、直接和間接夾心式測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定法(zola,(1987)monoclonalantibodies:amanualoftechniques,pp.147-158,crcpress,inc.).檢測(cè)標(biāo)記可以用于定位、顯影和定量結(jié)合或識(shí)別結(jié)果。本發(fā)明標(biāo)記的抗體可以檢測(cè)細(xì)胞-表面受體。另一種用于檢測(cè)標(biāo)記的抗體的應(yīng)用在于基于珠的免疫捕捉，包含使珠與熒光標(biāo)記的抗體偶聯(lián)并且檢測(cè)配體結(jié)合時(shí)的熒光信號(hào)。類似的結(jié)合檢測(cè)方法使用表面等離子共振(spr)效應(yīng)以測(cè)定和檢測(cè)抗體-抗原相互作用。本發(fā)明標(biāo)記的半胱氨酸改造的抗體用作生物醫(yī)學(xué)和分子成像的各種方法和技術(shù)的成像生物標(biāo)記物和探針，所述的方法和技術(shù)諸如：(i)mri(磁共振成像)；(ii)microct(電子計(jì)算機(jī)化斷層x線攝影法)；(iii)spect(單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層術(shù))；(iv)pet(正電子發(fā)射斷層照相術(shù))tinianow,j.etal(2010)nuclearmedicineandbiology,37(3):289-297；chen等(2004)bioconjugatechem.15:41-49；us2010/0111856；(v)生物發(fā)光；(vi)熒光；和(vii)超聲。免疫閃爍成像為一種成像方法，其中將放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗體給予動(dòng)物或人體患者并且取抗體定位的部位的圖像(us6528624)?？梢钥陀^測(cè)定成像生物標(biāo)記物并且作為正常生理過(guò)程、病理過(guò)程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理反應(yīng)的指示評(píng)價(jià)。生物標(biāo)記物可以具有幾種類型：0型為疾病的天然歷史標(biāo)記物并且與已知的臨床指標(biāo)縱向相關(guān)，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中滑液炎癥的mri評(píng)價(jià)；i型標(biāo)記捕捉按照作用機(jī)制干預(yù)的作用，即使該機(jī)制與臨床結(jié)果無(wú)關(guān)；ii型標(biāo)記作為替代終點(diǎn)(surrogateendpoint)起作用，其中生物標(biāo)記的改變或信號(hào)預(yù)測(cè)臨床有益性以便“驗(yàn)證”靶向的反應(yīng)，諸如通過(guò)ct在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中測(cè)定的骨質(zhì)侵蝕。成像生物標(biāo)記物由此可以提供有關(guān)下列的藥效(pd)治療信息：(i)靶蛋白的表達(dá)；(ii)治療劑與靶蛋白的結(jié)合，即選擇性；和(iii)清除和半衰期藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。與基于實(shí)驗(yàn)室的生物標(biāo)記物有關(guān)的體內(nèi)成像生物標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)包括：非-侵害性治療；可定量；整體評(píng)價(jià)；重復(fù)給藥和評(píng)價(jià)，即多時(shí)間點(diǎn)；和從前期臨床(小動(dòng)物)到臨床(人)結(jié)果的潛在可轉(zhuǎn)移的作用。就某些應(yīng)用而言，生物成像替代了前期臨床研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或?qū)⑵浯螖?shù)減少到了最低限度。肽標(biāo)記方法為眾所周知的。參見(jiàn)haugland,2003,molecularprobeshandbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,inc.；brinkley,1992,bioconjugatechem.3:2；garman,(1997)non-radioactivelabelling:apracticalapproach,academicpress,london；means(1990)biogconjugatechem.1:2；glazer等(1975)chemicalmodificationofproteins.laboratorytechniquesinbiochemistry和molecularbiology(t.s.work和e.work,eds.)americanelsevierpublishingco.,newyork；lundblad,r.l.和noyes,c.m.(1984)chemicalreagentsforproteinmodification,vols.i和ii,crcpress,newyork；pfleiderer,g.(1985)“chemicalmodificationofproteins”,modernmethodsinproteinchemistry,h.tschesche,ed.,walterdegryter,berlin和newyork；和wong(1991)chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,bocaraton,fla.)；deleon-rodriguez等(2004)chem.eur.j.10:1149-1155；lewis等(2001)bioconjugatechem.12:320-324；li等(2002)bioconjugatechem.13:110-115；mier等(2005)bioconjugatechem.16:240-237。使用兩部分，即熒光報(bào)道基團(tuán)和猝滅物標(biāo)記的肽類和蛋白質(zhì)能夠充分近似地進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)。報(bào)道基團(tuán)一般為由一定波長(zhǎng)的光激發(fā)的熒光染料并且可以將能量轉(zhuǎn)移至接受或猝滅基團(tuán)，其中對(duì)于在最大亮度時(shí)發(fā)射而言存在適當(dāng)?shù)膕tokes偏移。熒光染料包括具有延長(zhǎng)的芳香性的分子，諸如熒光素和若丹明及其衍生物?？梢酝ㄟ^(guò)完整肽的猝滅物部分部分或明顯地使熒光報(bào)道分子猝滅。在通過(guò)肽酶或蛋白酶裂解肽時(shí)，可以測(cè)定熒光中的可檢測(cè)到的增加(knight,c.(1995)“fluorimetricassaysofproteolyticenzymes”,methodsinenzymology,academicpress,248:18-34)。還可以將本發(fā)明標(biāo)記的抗體用作親和純化試劑。在該方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法將標(biāo)記的抗體固定在固相上，諸如sephadex樹(shù)脂或?yàn)V紙上。使固定化抗體與含有預(yù)純化的抗原的樣品接觸，且此后用可基本上除去樣品中除預(yù)純化的抗原外的所有物質(zhì)的適當(dāng)溶劑洗滌支持物，所述抗原與固定的多肽變體結(jié)合。最終用另一種合適的溶劑，諸如ph5.0的甘氨酸緩沖液洗滌支持物，該溶劑能夠使所述抗原從所述多肽變體中釋放。標(biāo)記試劑一般具有反應(yīng)性官能基，它可以與：(i)半胱氨酸改造的抗體的半胱氨酸硫醇直接反應(yīng)而形成標(biāo)記的抗體；(ii)與接頭試劑反應(yīng)而形成接頭-標(biāo)記中間體；或(iii)與接頭抗體反應(yīng)而形成標(biāo)記的抗體。標(biāo)記試劑的反應(yīng)性官能基包括：馬來(lái)酰亞胺、鹵代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亞胺基酯(例如nhs，n-羥基琥珀酰亞胺)、異硫氰酸酯、磺酰氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亞磷酰胺，不過(guò)，也可以使用其它的官能基。生物素-馬來(lái)酰亞胺與thiofab的偶聯(lián)在有噬菌體存在下建立上述thiofab特性，因?yàn)閒ab與噬菌體包膜蛋白的融合體能夠改變cys硫醇可接近性或反應(yīng)性。因此，將thiofab構(gòu)建體在堿性磷酸酶啟動(dòng)子控制下克隆入表達(dá)載體(chang等(1987)gene55:189-196)并且通過(guò)使大腸桿菌細(xì)胞在不含磷酸鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)誘導(dǎo)thiofab表達(dá)。使用蛋白質(zhì)gsepharosetm柱純化thiofab并且使用還原和非-還原sds-page凝膠分析。這些分析能夠評(píng)價(jià)thiofab是否可以保持其反應(yīng)性硫醇或因形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵而被失活。通過(guò)蛋白質(zhì)-gsepharosetm柱層析法表達(dá)和純化thiofabl-v15c、l-v110c、h-a88c和h-a121c(參見(jiàn)方法的詳細(xì)描述部分)。使用sds-page凝膠在還原(使用dtt)和非-還原(不用dtt)條件下分析純化的蛋白質(zhì)。其它還原劑，諸如bme(β-硫醇乙醇)可以用于凝膠以便裂解鏈間二硫鍵。從sds-page凝膠分析中顯而易見(jiàn)thiofab的主要(～90％)級(jí)分為單體形式，而野生型hu4d5fabv8基本上為單體形式(47kda)。將thiofab(a121c)和野生型hu4d5fabv8與100倍過(guò)量的生物素-馬來(lái)酰亞胺一起在室溫溫育3小時(shí)并且使生物素化的fab上樣至superdex-200tm凝膠過(guò)濾柱。該純化步驟用于從寡聚化fab并且還從過(guò)量的游離生物素-馬來(lái)酰亞胺(或游離細(xì)胞毒性藥物)中分離單體fab。附圖5表示在沒(méi)有噬菌體背景存在下thiofab變體特性的驗(yàn)證。表達(dá)不含噬菌體融合體、hu4d5fabv8和hu4d5fabv8-a121c(thiofab-a121c)的蛋白質(zhì)并且使用蛋白質(zhì)-g瓊脂糖柱純化，隨后與100倍摩爾過(guò)量的生物素-馬來(lái)酰亞胺一起溫育。比較生物素化的cys改造的thiofab和未-生物素化的野生型fab的鏈霉抗生物素和her2結(jié)合。通過(guò)elisa分析監(jiān)測(cè)生物素偶聯(lián)程度(與鏈霉抗生物素相互作用)及其與her2的結(jié)合能力。以2ng和20ng測(cè)試每種fab。生物素化的a121cthiofab保持與野生型hu4d5fabv8相差無(wú)幾的her2結(jié)合性(附圖5)。通過(guò)凝膠過(guò)濾柱層析法純化野生型fab和a121c-thiofab。通過(guò)elisa，使用山羊抗-fab-hrp作為二抗測(cè)試兩種樣品的her2和鏈霉抗生物素結(jié)合性。野生型(空心條)和thiofab(帶虛線的條)均具有與her2的類似結(jié)合性，但僅thiofab保持鏈霉抗生物素結(jié)合性。使用未-生物素化的野生型hu4d5fabv8僅觀察到與鏈霉抗生物素背景水平的相互作用(附圖5)。對(duì)生物素化-thiofab(a121c)的質(zhì)譜(lc-esi-ms)分析產(chǎn)生了與野生型hu4d5fabv8(47737道爾頓)相比具有48294.5道爾頓的主峰。在兩種分子之間存在537.5道爾頓差正相當(dāng)于與thiofab偶聯(lián)的單一生物素-馬來(lái)酰亞胺。質(zhì)譜蛋白質(zhì)測(cè)序(lc-esi-串聯(lián)質(zhì)譜分析(lc-esi-tandemmassspecanalysis))結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了偶聯(lián)的生物素分子是在新改造的cys殘基上(表8,實(shí)施例3b)。生物素-馬來(lái)酰亞胺與清蛋白結(jié)合肽(abp)-thiofab的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)血漿蛋白結(jié)合可以為改善短壽命分子的藥代動(dòng)力學(xué)特性的有效方式。清蛋白為血漿中最豐富的蛋白質(zhì)。血清清蛋白結(jié)合肽類(abp)可以改變?nèi)诤系幕钚越Y(jié)構(gòu)域蛋白的藥效學(xué)特性，包括組織攝取、滲透和擴(kuò)散的改變。可以通過(guò)特異性選擇合適的血清清蛋白結(jié)合肽序列調(diào)節(jié)這些藥效學(xué)參數(shù)(us20040001827)。通過(guò)噬菌體展示篩選鑒定一系列清蛋白結(jié)合肽(dennis等(2002)“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins”jbiolchem.277:35035-35043；wo01/45746)。本發(fā)明的化合物包括由下列文獻(xiàn)中教導(dǎo)的abp序列：(i)dennis等(2002)jbiolchem.277:35035-35043，表iii和iv,35038頁(yè)；(ii)us20040001827，[0076]；和(iii)wo01/45746，12-13頁(yè)，并且將所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。通過(guò)按照1:1(1abp/1fab)化學(xué)計(jì)算比融合清蛋白結(jié)合肽與fab重鏈的c-末端改造清蛋白結(jié)合(abp)-fab。經(jīng)證實(shí)這些abp-fab與清蛋白結(jié)合將其在兔和小鼠中的半衰期增加了25倍以上。由此可以將上述反應(yīng)性cys殘基引入這些abp-fab并且用于與細(xì)胞毒性藥物的位點(diǎn)-特異性偶聯(lián)，隨后進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物研究。典型的清蛋白結(jié)合肽序列包括，但不限于seqidno:1-5中所列的氨基酸序列：清蛋白結(jié)合肽(abp)序列結(jié)合來(lái)自多物種(小鼠、大鼠、兔、牛、獼猴、狒狒和人)的清蛋白，具有的kd(兔)＝0.3μm。清蛋白結(jié)合肽不與已知配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合清蛋白并且在兔中具有的半衰期(t1/2)為2.3小時(shí)。如上述部分中所述使用bsa-sepharosetm純化abp-thiofab蛋白，隨后進(jìn)行生物素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)并且使用superdex-s200柱層析法純化。純化的生物素化的蛋白質(zhì)為均一性的(homogeneous)并且無(wú)任何寡聚化形式(實(shí)施例4)。附圖6表示清蛋白結(jié)合肽(abp)-thiofab變體的特性。進(jìn)行elisa分析以測(cè)試abp-hu4d5fabv8-wt、abp-hu4d5fabv8-v110c和abp-hu4d5fabv8-a121c與兔清蛋白、鏈霉抗生物素和her2的結(jié)合能力。生物素化的abp-thiofab能夠以與野生型abp-hu4d5fabv8相似的親和力結(jié)合清蛋白和her2，正如通過(guò)elisa(附圖6)和biacore結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析(表2)所證實(shí)的。如所述的給elisa平板包被清蛋白、her2和sa。用抗-fabhrp探測(cè)生物素化的abp-thiofab與清蛋白、her2和sa的結(jié)合。與非生物素化的對(duì)照abp-hu4d5fabv8-wt相比，生物素化的abp-thiofab能夠結(jié)合鏈霉抗生物素，這表明abp-thiofab與生物素馬來(lái)酰亞胺類thiofab以位點(diǎn)特異性方式偶聯(lián)，因?yàn)橄嗤腸ys突變體用于兩種變體(附圖6)。表2生物素化的abp-hu4d5fabv8野生型和thiofab結(jié)合her2和兔清蛋白的biacore動(dòng)力學(xué)分析抗體kon(m-1s-1)koff(s-1)kd(nm)her2結(jié)合野生型4.57x1054.19x10-50.0917v110c4.18x1054.05x10-50.097a121c3.91x1054.15x10-50.106兔清蛋白結(jié)合野生型1.66x1050.0206124v110c2.43x1050.0331136a121c1.70x1050.0238140abp＝清蛋白結(jié)合肽或者，可以通過(guò)經(jīng)接頭部分的共價(jià)結(jié)合使清蛋白-結(jié)合肽與抗體連接。每個(gè)fab使用兩個(gè)游離硫醇基對(duì)abp-thiofab改造上述結(jié)果表明所有四種(l-v15c、l-v110c、h-a88c和h-a121c)thiofab(半胱氨酸改造的fab抗體)變體具有可以用于與標(biāo)記試劑、接頭試劑或藥物-接頭中間體的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的反應(yīng)性硫醇。可以表達(dá)和純化l-v15c，但產(chǎn)率相對(duì)低。然而，l-v110c、h-a88c和h-a121c變體的表達(dá)和純化產(chǎn)率與hu4d5fabv8的類似。因此，這些突變體可以用于進(jìn)一步分析并且重組成每個(gè)fab中有一個(gè)以上硫醇基。為了這一目的，構(gòu)建輕鏈上的一個(gè)硫醇和重鏈上的一個(gè)硫醇以獲得每個(gè)fab分子中有兩個(gè)硫醇(l-v110c/h-a88c和l-v110c/h-a121c)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)這兩種雙cys變體并且純化。發(fā)現(xiàn)純化的生物素化的abp-thiofab的均一性(homogeneity)與單cys變體的均一性類似。研究每個(gè)fab中改造兩個(gè)反應(yīng)性cys殘基的作用(附圖7)。通過(guò)使用鏈霉抗生物素-hrp探測(cè)生物素化的abp-thiofab與sa的結(jié)合測(cè)試第二生物素的存在(附圖7)。為了進(jìn)行her2/fab分析，用her2包被elisa平板并且使用抗-fabhrp探測(cè)。為了進(jìn)行sa/fab分析，用sa包被elisa平板并且用抗-fabhrp探測(cè)，為了進(jìn)行sa/sa分析，用sa包被elisa平板并且用sa-hrp探測(cè)。附圖7。elisa分析了生物素化的abp-hu4d5fabv8cys變體與her2、鏈霉抗生物素(sa)的相互作用。her2/fab、sa/fab和sa/sa分別表示通過(guò)抗-fab-hrp、sa-hrp監(jiān)測(cè)其相互作用。sa/fab監(jiān)測(cè)每個(gè)fab中存在的單一生物素并且通過(guò)sa/sa分析監(jiān)測(cè)每個(gè)fab的一個(gè)以上生物素。her2與雙cys突變體結(jié)合與her2同單cys變體的結(jié)合類似(附圖7)。然而，雙cys突變體上生物素化程度高于單cys變體，這是因每個(gè)fab分子中有一個(gè)以上游離硫醇基所致(附圖7)。曲妥單抗的thioigg變體的改造將半胱氨酸引入全長(zhǎng)單克隆抗體曲妥單抗(genentechinc.)的某些殘基上。通過(guò)在含有1mm半胱氨酸的培養(yǎng)基中瞬時(shí)發(fā)酵在cho(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞中表達(dá)曲妥單抗的單cys突變體h-a88c、h-a121c和l-v110c和曲妥單抗的雙cys突變體v110c-a121c和v110c-a121c。a88c突變體重鏈序列(450aa)為seqidno:6。a121c突變體重鏈序列(450aa)為seqidno:7。v110c突變體輕鏈序列(214aa)為seqidno:8。evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslrcedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:6evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvsscstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:7diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikrtcaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgecseqidno:8按照一個(gè)實(shí)施方案，半胱氨酸改造的thio-曲妥單抗抗體包含下列具有游離半胱氨酸氨基酸的可變區(qū)重鏈序列(seqidno:9-16)中的一種或多種。突變體序列seqidno:a40cwvrqcpgkglseqidno:9a88cnslrcedtavseqidno:10s119clvtvcsastkgpsseqidno:11s120clvtvscastkgpsseqidno:12a121clvtvsscstkgpsseqidno:13s122clvtvssactkgpsseqidno:14a175chtfpcvlqssglysseqidno:15s179chtfpavlqcsglysseqidno:16按照另一個(gè)實(shí)施方案，半胱氨酸改造的硫代-曲妥單抗抗體包含下列具有游離半胱氨酸氨基酸的可變區(qū)輕鏈序列(seqidno:17-27)中的一種或多種。突變體序列seqidno:v15cslsascgdrvtseqidno:17a43cqkpgkcpklliseqidno:18v110ceikrtcaapsvseqidno:19s114ctcaapcvfifppseqidno:20s121cfifppcdeqlkseqidno:21s127cdeqlkcgtasvseqidno:22a144cfypreckvqwkseqidno:23a153cwkvdnclqsgnseqidno:24n158calqsgcsqesvseqidno:25s168cvteqdckdstyseqidno:26v205cglsspctksfnseqidno:27檢測(cè)所得全長(zhǎng)硫代-曲妥單抗igg變體的硫醇反應(yīng)性和her2結(jié)合活性。附圖9a表示生物素化抗體結(jié)合固定化her2和hrp標(biāo)記的用于吸光度檢測(cè)的二抗的卡通畫描繪。附圖9b表示在450nm處對(duì)下列(左至右)物質(zhì)進(jìn)行吸光度檢測(cè)的與固定化her2的結(jié)合測(cè)定值：非-生物素化的野生型曲妥單抗(wt)、生物素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的硫代-曲妥單抗變體v110c(單cys)、a121c(單cys)和v110c-a121c(雙cys)。在1、10和100ng測(cè)試每種thioigg變體和曲妥單抗。測(cè)定值表示生物素化的抗-her2thiomab保持her2結(jié)合活性。附圖10a表示結(jié)合固定化her2的生物素化抗體在用于吸光度檢測(cè)的生物素與抗-igg-hrp結(jié)合方面的卡通圖描繪。附圖10b表示在450nm檢測(cè)吸光度的生物素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的-硫代曲妥單抗變體和未-生物素化的野生型曲妥單抗在結(jié)合鏈霉抗生物素中的結(jié)合測(cè)定值。從左至右：v110c(單cys)、a121c(單cys)、v110c/a121c(雙cys)和曲妥單抗。在1、10和100ng測(cè)試每種thioigg曲妥單抗變體和親代曲妥單抗。測(cè)定值表示her2thiomab具有高硫醇反應(yīng)性。將半胱氨酸引入全長(zhǎng)2h9抗-ephb2r抗體的某些殘基上。通過(guò)在含有1mm半胱氨酸的培養(yǎng)基中瞬時(shí)發(fā)酵在cho(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞中表達(dá)2h9的單cys突變體h-a121c。a121c2h9突變體重鏈序列(450aa)為seqidno:28。evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftsywmhwvrqapgkglewvgfinpstgytdynqkfkdrftisadtskntaylqmnslraedtavyyctrrpkiprhanvfwgqgtlvtvsscstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:28半胱氨酸改造的thio-2h9抗體包含下列具有游離半胱氨酸氨基酸的fc恒定區(qū)重鏈序列(seqidno:29-38)。突變體序列seqidno:v273chedpeckfnwyvdgvevhnaktkprseqidno:29v279chedpevkfnwycdgvevhnaktkprseqidno:30v282chedpevkfnwyvdgcevhnaktkprseqidno:31v284chedpevkfnwyvdgvechnaktkprseqidno:32a287chedpevkfnwyvdgvevhncktkprseqidno:33s324cykckvcnkalpseqidno:34s337ciektickakgqprseqidno:35a339ciektiskckgqprseqidno:36s375ckgfypcdiaveseqidno:37s400cppvldcdgsffseqidno:38將半胱氨酸引入全長(zhǎng)3a5抗-muc16抗體的某些殘基上。通過(guò)在含有1mm半胱氨酸的培養(yǎng)基中瞬時(shí)發(fā)酵在cho(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞中表達(dá)3a5的單cys突變體h-a121c。a121c3a5突變體重鏈序列(446aa)包含seqidno:39。dvqlqesgpglvnpsqslsltctvtgysitndyawnwirqfpgnklewmgyinysgyttynpslksrisitrdtsknqfflhlnsvttedtatyycarwdggltywgqgtlvtvsacstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkseqidno:39半胱氨酸改造的thio-3a5抗-muc16抗體包含下列具有游離半胱氨酸氨基酸(seqidno:40-44)的可變區(qū)重鏈序列。突變體序列seqidno:f45cnwirqcpgnkseqidno:40a90clnscttedtatseqidno:41a121cgqgtlvtvsacstkgpsvfplseqidno:42a175chtfpcvlqssglysseqidno:43v176chtfpaclqssglysseqidno:44半胱氨酸改造的thio-3a5抗-muc16抗體包含下列具有游離半胱氨酸氨基酸的可變區(qū)輕鏈序列(seqidno:45-49)。突變體序列seqidno:l15cflsvscggrvtseqidno:45a43cqkpgncprlliseqidno:46v110ceikrtcaapsvseqidno:47a144cfypreckvqwkseqidno:48s168cvteqdckdstyseqidno:494d5抗her2thiofab的改造和硫醇反應(yīng)性將半胱氨酸導(dǎo)入抗her2hu4d5fabv8fab片段抗體的重鏈和輕鏈的每一個(gè)位置。依照本文所述方法制備了所有440個(gè)重鏈突變體和輕鏈突變體。依照pheselector測(cè)定法測(cè)量了硫醇反應(yīng)性。重鏈序列依照順序編號(hào)系統(tǒng)來(lái)編號(hào)。輕鏈序列遵循kabat編號(hào)系統(tǒng)。在輕鏈中，kabat和順序編號(hào)二者表示相同的數(shù)。對(duì)重鏈hu4d5fabv8突變體選擇對(duì)her2受體蛋白的有效結(jié)合(附圖2和3)和與生物素化試劑biotin-peo-馬來(lái)酰亞胺的硫醇反應(yīng)性(實(shí)施例1和2)。某些重鏈突變體具有有限的或受損的對(duì)her2ecd的結(jié)合，因?yàn)槲挥诳贵w-fab可變區(qū)cdr中的殘基對(duì)于抗原結(jié)合(her2)是重要的。一些位于fab恒定域中的殘基也產(chǎn)生較差的her2結(jié)合，因?yàn)檫@些殘基可促進(jìn)fab的結(jié)構(gòu)和折疊，由此導(dǎo)致在m13噬菌體上的4d5-fab展示較差(junutula,j.r.etal.(2008)j.immunolmethods,332:41-52)。具有較差her2ecd結(jié)合的重鏈hu4d5fabv8突變體包括位置1,21,31,33-36,38,48-50,59,87,95,101,104,129,131,132,136,153,155,159,166,169,170,172,197,198,202,215,219處的半胱氨酸突變。測(cè)量了野生型半胱氨酸變體22,96,147,203,223。其它重鏈突變體具有有限的與生物素化試劑的硫醇反應(yīng)性。游離半胱氨酸氨基酸殘基位于中央，側(cè)翼殘基在表3中欄的序列中。左欄表示重鏈中的替代氨基酸和位置。表3seqidno:50-98重鏈hu4d5fabv8突變體保留了her2結(jié)合和約0.8或0.8以上的硫醇反應(yīng)性值，排除野生型半胱氨酸變體。具有seqidno:50-98(表3)的抗體展現(xiàn)出硫醇反應(yīng)性且可用于形成與捕捉標(biāo)記、檢測(cè)標(biāo)記、藥物部分、或固相支持物的共價(jià)附著。表3的重鏈突變體可以偶聯(lián)成thiofab或thiomab，例如抗體-藥物偶聯(lián)物。表3有效結(jié)合、硫醇反應(yīng)性重鏈hu4d5fabv8突變體對(duì)輕鏈hu4d5fabv8突變體選擇對(duì)her2受體蛋白的有效結(jié)合(附圖2和3)和與生物素化試劑biotin-peo-馬來(lái)酰亞胺的硫醇反應(yīng)性(實(shí)施例1和2)。某些輕鏈突變體具有有限的或受損的對(duì)her2的結(jié)合，因?yàn)槲挥诳贵w-fab可變區(qū)cdr中的殘基對(duì)于抗原結(jié)合(her2)是重要的。一些位于fab恒定域中的殘基也產(chǎn)生較差的her2結(jié)合，因?yàn)檫@些殘基可促進(jìn)fab的結(jié)構(gòu)和折疊，由此導(dǎo)致在m13噬菌體上的4d5-fab展示較差(junutula,j.r.etal.(2008)j.immunolmethods,332:41-52)。具有較差her2結(jié)合的輕鏈hu4d5fabv8突變體包括位置4,29-32,35,36,50,82,86,89-91,113,115,117,120,126,128,139,141,146,148,179,186,192,202處的半胱氨酸突變體。測(cè)量了野生型半胱氨酸變體23,134,194,214。其它輕鏈突變體具有有限的與生物素化試劑的硫醇反應(yīng)性。游離半胱氨酸氨基酸殘基位于中央，側(cè)翼殘基在表4中欄的序列中。左欄表示輕鏈中的替代氨基酸和位置。表4seqidno:99-147輕鏈hu4d5fabv8突變體保留了her2結(jié)合和約0.8或0.8以上的硫醇反應(yīng)性值，排除野生型半胱氨酸變體。具有seqidno:99-147(表4)的抗體展現(xiàn)出硫醇反應(yīng)性且可用于形成與捕捉標(biāo)記、檢測(cè)標(biāo)記、藥物部分、或固相支持物的共價(jià)附著。表4的輕鏈突變體可以偶聯(lián)成thiofab或thiomab，例如抗體-藥物偶聯(lián)物。表4有效結(jié)合、硫醇反應(yīng)性輕鏈hu4d5fabv8突變體thiomab的硫醇反應(yīng)性通過(guò)生物素化和鏈霉抗生物素結(jié)合(us7521541)測(cè)定全長(zhǎng)igg半胱氨酸改造的抗體(thiomab)的硫醇反應(yīng)性。設(shè)定蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)以篩選與生物素-馬來(lái)酰亞胺特異性偶聯(lián)的thiomab。在本試驗(yàn)中，在還原sds-page上分析抗體并且通過(guò)與鏈霉抗生物素-hrp一起溫育特異性探測(cè)生物素的存在。正如從附圖18中看出的，根據(jù)使用哪種改造的cys變體和使用野生型未觀察到相互作用的不同，在重鏈或輕鏈中觀察到了鏈霉抗生物素-hrp相互作用，表明thiomab變體特異性偶聯(lián)改造的cys殘基上的生物素。附圖18表示在固定化抗-igg-hrp(上部凝膠)和鏈霉抗生物素-hrp(下部凝膠)上捕捉后還原的生物素化的thio-igg變體的變性凝膠分析。泳道1:3a5h-a121c。泳道2:3a5l-v110c。泳道3:2h9h-a121c。泳道4:2h9l-v110c。泳道5:抗-ephb2r2h9親代野生型。通過(guò)使用hrp檢測(cè)(上部)，使用抗-igg捕捉每種突變體(泳道1-4)，表明保持了選擇性和親和力。通過(guò)使用hrp檢測(cè)(下部)固定化鏈霉抗生物素的捕捉證實(shí)了生物素在重鏈和輕鏈上的位置。在泳道1和3中半胱氨酸改造的抗體上的半胱氨酸突變位置為重鏈。在泳道2和4中半胱氨酸改造的抗體上的半胱氨酸突變位置為輕鏈。半胱氨酸突變位點(diǎn)經(jīng)歷與生物素-馬來(lái)酰亞胺試劑的偶聯(lián)。lc/ms對(duì)附圖18的thiomab半胱氨酸改造的抗體和2h9v15c變體的分析給出了對(duì)硫醇反應(yīng)性的定量表示(表5).表5thiomab的生物素化的lc/ms定量-硫醇反應(yīng)性thiomab變體每個(gè)thiomab中生物素的數(shù)目2h9wt0.02h9l-v15c0.62h9l-v110c0.52h9h-a121c2.03a5l-v110c1.03a5h-a121c2.0半胱氨酸改造在igg抗體的恒定域，即fc區(qū)中進(jìn)行。將多種氨基酸位點(diǎn)轉(zhuǎn)化成半胱氨酸位點(diǎn)并且評(píng)價(jià)表達(dá)的突變體，即半胱氨酸改造的抗體的硫醇反應(yīng)性。在elisa測(cè)定法中通過(guò)hrp定量，經(jīng)在固定化鏈霉抗生物素捕捉評(píng)價(jià)生物素化的2h9thiomabfc變體的硫醇反應(yīng)性(附圖19)。建立快速篩選具有反應(yīng)性硫醇的cys殘基的elisa測(cè)定法。正如附圖19的示意圖中所示，通過(guò)用抗-igg-hrp探測(cè)，隨后在450nm處測(cè)定吸光度監(jiān)測(cè)鏈霉抗生物素-生物素相互作用。這些結(jié)果證實(shí)2h9-thiofc變體v282c、a287c、a339c、s375c和s400c具有中度到最高的硫醇反應(yīng)性。通過(guò)如表6中報(bào)導(dǎo)的ls/ms分析對(duì)2h9thiomabfc變體的生物素偶聯(lián)程度定量。ls/ms分析證實(shí)a282c、s375c和s400c變體具有100％生物素偶聯(lián)且v284c和a339c具有50％的偶聯(lián)，表明存在反應(yīng)性半胱氨酸硫醇。其它thiofc變體和親代野生型2h9有極弱的生物素化或沒(méi)有生物素化。表62h9fcthiomab的生物素化的lc/ms定量thio-4d5fab輕鏈變體的硫醇反應(yīng)性正如通過(guò)附圖8的pheselector測(cè)定法測(cè)定的，篩選抗erbb2抗體4d5的多種半胱氨酸改造的輕鏈變體fab得到了大量具有0.6和0.6以上硫醇反應(yīng)值的變體(表7)。將表7的硫醇反應(yīng)值對(duì)設(shè)定為100％的重鏈4d5thiofab變體(hc-a121c)校準(zhǔn)，推定hc-a121c變體完全生物素化并且表示為百分比值。表74d5thiofab輕鏈變體的硫醇反應(yīng)性百分比值4d5thiofab變體硫醇反應(yīng)性值(％)v15c100v110c95s114c78s121c75s127c75a153c82n158c77v205c78(hc-a121c)100(4d5野生型)25抗體-藥物偶聯(lián)物本發(fā)明的半胱氨酸改造的抗體可以與任意的治療劑，即藥物部分偶聯(lián)，所述的治療劑可以通過(guò)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇與抗體共價(jià)結(jié)合。抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)化合物的典型實(shí)施方案包含半胱氨酸改造的抗體(ab)和藥物部分(d)，其中抗體具有一個(gè)或多個(gè)游離半胱氨酸氨基酸，并且抗體通過(guò)連接d的接頭部分(l)與一個(gè)或多個(gè)游離半胱氨酸氨基酸附著(結(jié)合)；該組成具有式i：ab-(l-d)pi其中p為1、2、3或4?？梢酝ㄟ^(guò)硫醇反應(yīng)接頭部分與抗體分子偶聯(lián)的藥物部分的數(shù)量受到通過(guò)本文所述方法引入的半胱氨酸殘基數(shù)量的限制。式i的典型adc由此包含具有1、2、3或4個(gè)改造的半胱氨酸氨基酸的抗體?？贵w-藥物偶聯(lián)物化合物(adc)的另一個(gè)典型實(shí)施方案包含半胱氨酸改造的抗體(ab)、清蛋白-結(jié)合肽(abp)和藥物部分(d)，其中抗體通過(guò)接頭部分(l)與藥物部分結(jié)合并且抗體通過(guò)酰胺鍵或第二種接頭部分與清蛋白-結(jié)合肽結(jié)合；該組成具有式ia:abp-ab-(l-d)pia其中p為1、2、3或4。本發(fā)明的adc化合物包括那些用于抗癌活性的化合物。特別地，化合物包括與藥物部分，即毒素，通過(guò)接頭與之偶聯(lián)，即與之共價(jià)結(jié)合的半胱氨酸-改造的抗體。當(dāng)所述藥物不與抗體偶聯(lián)時(shí)，藥物具有細(xì)胞毒性或抑制細(xì)胞效應(yīng)。由此通過(guò)與抗體偶聯(lián)調(diào)節(jié)藥物部分的生物活性。本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)將有效劑量的細(xì)胞毒性劑選擇性地遞送至腫瘤組織，由此可以獲得更大的選擇性，即較低的效應(yīng)劑量(efficaciousdose)。藥物部分抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的藥物部分(d)包括具有細(xì)胞毒性或抑制細(xì)胞效應(yīng)的任意化合物、部分(moiety)或基團(tuán)。藥物部分包括：(i)可以起微管蛋白抑制劑、有絲分裂抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或dna嵌入劑作用的化療劑；(ii)可以通過(guò)酶促方式起作用的蛋白毒素；和(iii)放射性同位素。典型的藥物部分包括，但不限于美登木素生物堿、auristatin、多拉司他汀(dolastatin)、單端孢霉烯(trichothecene)、cc1065、加利車霉素(calicheamicin)和其它烯二炔類(enediyne)抗生素、紫杉烷(taxane)、蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)及其立體異構(gòu)體、同電子排列體(isostere)、類似物或衍生物。適合于用作美登木素生物堿藥物部分的美登素化合物為本領(lǐng)域眾所周知并且可以按照公知方法分離自天然來(lái)源，使用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)(參見(jiàn)yu等(2002)proc.nat.acad.sci.(usa)99:7968-7973)或按照已知方法通過(guò)合成制備的美登醇和美登醇類似物。典型的美登木素生物堿藥物部分包括那些具有修飾的芳族環(huán)的化合物，諸如：c-19-去氯(us4256746)(通過(guò)ansamytocinp2的氫化鋁鋰還原制備)；c-20-羥基(或c-20-去甲基)+/-c-19-去氯(us4361650和4307016)(通過(guò)使用鏈霉菌屬(streptomyces)或放線菌屬(actinomyces)脫甲基化或使用lah脫氯制備)；和c-20-去甲氧基、c-20-酰氧基(-ocor)、+/-去氯(us4,294,757)(通過(guò)使用酰基氯?；苽?和那些在其它位置上具有修飾的化合物。典型的美登木素生物堿藥物部分還包括那些具有諸如如下修飾的化合物：c-9-sh(us4424219)(通過(guò)使美登醇與h2s或p2s5反應(yīng)制備)；c-14-烷氧基甲基(去甲氧基/ch2or)(us4331598)；c-14-羥甲基或酰氧基甲基(ch2oh或ch2oac)(us4450254)(由nocardia制備)；c-15-羥基/酰氧基(us4364866)(通過(guò)由鏈霉菌屬轉(zhuǎn)化美登醇制備)；c-15-甲氧基(us4313946和4315929)(分離自trewianudlflora)；c-18-n-去甲基(us4362663和4322348)(通過(guò)用鏈霉菌屬使美登醇脫甲基化制備)；和4,5-脫氧(us4371533)(通過(guò)美登醇的三氯化酞/lah還原制備)。已知美登素化合物上的許多位置用作連接位置，這取決于連接的類型。例如，為了形成酯鍵，具有羥基的c-3位、用羥甲基修飾的c-14位、用羥基修飾的c-15位和具有羥基的c-20位均是合適的。式i的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的藥物部分(d)包括具有如下結(jié)構(gòu)的美登木素生物堿：其中波狀線表示d的硫原子與抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的接頭(l)共價(jià)結(jié)合。r可以獨(dú)立為h或c1-c6烷基，所述的c1-c6烷基選自甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。使酰胺基與硫原子結(jié)合的亞烷基鏈可以為methanyl、乙基(ethanyl)或丙基，即m為1、2或3。美登素化合物通過(guò)抑制有絲分裂過(guò)程中的微管蛋白形成抑制細(xì)胞增殖，所述的抑制有絲分裂過(guò)程中的微管蛋白形成通過(guò)抑制微管蛋白，即微管素的聚合來(lái)進(jìn)行(remillard等(1975)science189:1002-1005)。美登素和美登木素生物堿具有高度毒性，但其在癌癥療法中的臨床應(yīng)用因其主要由于對(duì)腫瘤的選擇性差導(dǎo)致的嚴(yán)重的全身副作用而非常有限。因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的嚴(yán)重不良作用而已中斷了使用美登素的臨床試驗(yàn)(issel等(1978)can.treatment.rev.5:199-207)。美登木素生物堿藥物部分為抗體-藥物偶聯(lián)物中有吸引力的藥物部分，因?yàn)樗鼈儯?i)相對(duì)易于接近以便通過(guò)發(fā)酵或化學(xué)修飾、衍生發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)制備；(ii)易于使用適合于通過(guò)非二硫化物接頭與抗體偶聯(lián)的官能基衍生；(iii)在血漿中穩(wěn)定；和(iv)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系有效(us2005/0169933；wo2005/037992；us5208020)。作為其它藥物部分，對(duì)本發(fā)明的化合物而言，關(guān)注美登木素生物堿藥物部分的所有立體異構(gòu)體，即在d的手性碳上的r和s構(gòu)型的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，美登木素生物堿藥物部分(d)具有下列立體化學(xué)：美登木素生物堿藥物部分的典型實(shí)施方案包括:dm1,(cr2)m＝ch2ch2；dm3,(cr2)m＝ch2ch2ch(ch3)；和dm4,(cr2)m＝ch2ch2c(ch3)2，它們具有如下結(jié)構(gòu)：根據(jù)連接類型的不同，接頭可以在不同位置上與美登木素生物堿分子結(jié)合。例如，可以通過(guò)使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)與羥基反應(yīng)形成酯鍵。該反應(yīng)可以在具有羥基的c-3位置上進(jìn)行。該反應(yīng)可以在具有羥基的c-3位置，使用羥甲基修飾的c-14位置，使用羥基修飾的c-15位置和具有羥基的c-20上進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鍵在美登醇或美登醇類似物的c-3位置上形成。式i的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的藥物部分(d)還包括多拉司他汀及其肽類似物和衍生物auristatins(美國(guó)專利us5635483；5780588)。已經(jīng)證實(shí)多拉司他汀和auristatins可干擾微管動(dòng)力學(xué)、gtp水解以及核和細(xì)胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin藥物部分的不同形式可以通過(guò)肽藥物部分的n(氨基)末端或c(羧基)末端與抗體共價(jià)結(jié)合(wo02/088172；doronina等(2003)naturebiotechnology21(7):778-784；francisco等(2003)blood102(4):1458-1465)。藥物部分包括多拉司他汀、auristatins(us5635483；us5780588；us5767237；us6124431)及其類似物和衍生物。已經(jīng)證實(shí)多拉司他汀和auristatins可干擾微管動(dòng)力學(xué)、gtp水解以及核和細(xì)胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等(1998)antimicrob.agentschemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin藥物部分的不同形式可以通過(guò)肽藥物部分的n(氨基)末端或c(羧基)末端與抗體結(jié)合(wo02/088172)。典型auristatin實(shí)施方案包括n-末端連接的monomethylauristatin藥物部分de和df，其披露在下列文獻(xiàn)中：us7498298和us7659241，特別將這些文獻(xiàn)各自全部披露的內(nèi)容引入本文作為參考。式i的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的藥物部分(d)包括通過(guò)n-末端與抗體連接的monomethylauristatin藥物部分mmae和mmaf，并且具有如下結(jié)構(gòu)：一般而言，可以通過(guò)在兩種或多種氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵制備基于肽的藥物部分。例如，可以按照肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法制備這類肽鍵(參見(jiàn)e.和k.lübke,“thepeptides”,volume1,pp76-136,1965,academicpress)。藥物部分包括加利車霉素及其類似物和衍生物。加利車霉素族抗生素能夠產(chǎn)生亞-皮摩爾濃度的雙鏈dna斷裂。為了制備加利車霉素族抗生素的偶聯(lián)物，參見(jiàn)us5712374；us5714586；us5739116；us5767285；us5770701,us5770710；us5773001；us5877296?？梢允褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于γ1i、α2i、α3i、n-乙酰基-γ1i、psag和θi1(hinman等cancerresearch53:3336-3342(1993),lode等cancerresearch58:2925-2928(1998)。蛋白毒素包括：白喉毒素a鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素a鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素a鏈(ricinachain)(vitetta等(1987)science,238:1098)、相思豆毒蛋白a鏈(abrinachain)、蒴蓮根毒素a鏈(modeccinachain)、α-八疊球菌(alpha-sarcin)、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹素蛋白(dianthinproteins)、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、sapaonariaofficinalis抑制劑、白樹(shù)毒素(gelonin)、米托潔林(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和tricothecenes(wo93/21232)。治療放射性同位素包括:32p、33p、90y、125i、131i、131in、153sm、186re、188re、211at、212bi、212pb和lu的放射性同位素?？梢园凑展绞綄⒎派湫酝凰鼗蚱渌鼧?biāo)記摻入偶聯(lián)物(fraker等(1978)biochem.biophys.res.commun.80:49-57；"monoclonalantibodyinimmunoscintigraphy"chatal,crcpress1989)。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)為用于放射性核素與抗體偶聯(lián)的典型螯合劑(wo94/11026)。接頭“接頭”(l)為具有用于連接一種或多種藥物部分(d)和抗體單元(ab)而形成式i的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的雙官能或多官能部分?？梢允褂镁哂薪Y(jié)合藥物和抗體的反應(yīng)性官能基的接頭便利地制備抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)。半胱氨酸改造的抗體(ab)的半胱氨酸硫醇可以與接頭試劑、藥物部分或藥物-接頭中間體的官能基形成鍵。一個(gè)方面，接頭具有反應(yīng)位置，該位置上帶有與存在于抗體上的親核半胱氨酸反應(yīng)的親電子基團(tuán)?？贵w的半胱氨酸硫醇與接頭上的親電子基團(tuán)反應(yīng)并且與接頭形成共價(jià)鍵。有用的親電子基團(tuán)包括，但不限于馬來(lái)酰亞胺和鹵代乙酰胺基團(tuán)。半胱氨酸改造的抗體與接頭試劑或藥物-接頭中間體，與親電子官能基，諸如馬來(lái)酰亞胺或α-鹵代羰基按照klussman等(2004)在bioconjugatechemistry15(4):765-773,766頁(yè)上的方法和實(shí)施例4的方案反應(yīng)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，接頭試劑或藥物-接頭中間體的反應(yīng)基含有可以與抗體的游離半胱氨酸硫醇形成鍵的硫醇-反應(yīng)性官能基。硫醇-反應(yīng)官能基的實(shí)例包括，但不限于：馬來(lái)酰亞胺；α-鹵代乙?；?；活化的酯類，諸如琥珀酰亞胺酯類、4-硝基苯基酯類、五氟苯基酯類、四氟苯基酯類；酸酐類；?；阮悾换酋Ｂ阮?；異氰酸酯類和異硫氰酸酯類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭l可以為樹(shù)枝狀類型接頭，其用于通過(guò)支化多官能接頭部分與抗體共價(jià)結(jié)合一個(gè)以上藥物部分(sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768；)。樹(shù)枝狀接頭可以增加藥物與抗體的摩爾比，即負(fù)荷，它與adc的效能相關(guān)。因此，如果半胱氨酸改造的抗體僅帶有一個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇，那么可以通過(guò)樹(shù)枝狀接頭結(jié)合眾多藥物部分。接頭可以包含氨基酸殘基，其使抗體(ab)與本發(fā)明的半胱氨酸改造的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的藥物部分(d)連接。氨基酸殘基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。氨基酸殘基包括那些天然存在的以及最小的氨基酸和非-天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸?？梢栽O(shè)計(jì)和優(yōu)化有用的氨基酸殘基單元在通過(guò)特定的酶，例如腫瘤相關(guān)蛋白酶進(jìn)行酶促裂解中的選擇性，以便釋放活性藥物部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸殘基單元諸如纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)是其裂解由組織蛋白酶b、c和d或纖維蛋白溶酶蛋白酶催化的單元。接頭單元可以是自我犧牲(self-immolative)類型的，諸如對(duì)-氨基芐基氨基甲酰基(pab)單元，其中adc具有如下典型結(jié)構(gòu)：其中q為-c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為0-4的整數(shù)；并且p為1－4。自我犧牲的間隔基的其它實(shí)例包括，但不限于在帶電方式上與pab基團(tuán)類似的芳族化合物，諸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(us7375078；hay等(1999)bioorg.med.chem.lett.9:2237)和鄰位或?qū)ξ?氨基芐基乙縮醛類。可以使用在酰胺鍵水解時(shí)進(jìn)行環(huán)化的間隔基，諸如取代和未被取代的4-氨基丁酸酰胺類(rodrigues等(1995)chemistrybiology2:223)、適當(dāng)取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系(storm等(1972)j.amer.chem.soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺類(amsberry,等(1990)j.org.chem.55:5867)。消去在甘氨酸上被取代的含胺的藥物(kingsbury等(1984)j.med.chem.27:1447)也是用于adcs的自我犧牲的(self-immolative)間隔基的實(shí)例。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭l可以為用于通過(guò)支化多官能接頭部分使一種以上藥物部分共價(jià)結(jié)合抗體的樹(shù)枝狀類型的接頭(dendritictypelinker)(sun等(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768)。樹(shù)枝狀接頭可以增加藥物與抗體的摩爾比，即負(fù)荷，它與adc的效能相關(guān)。因此，如果半胱氨酸改造的抗體僅帶有一個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇，那么可以通過(guò)樹(shù)枝狀接頭結(jié)合眾多藥物部分(wo2004/01993；szalai等(2003)j.amer.chem.soc.125:15688-15689；shamis等(2004)j.amer.chem.soc.126:1726-1731；amir等(2003)angew.chem.int.ed.42:4494-4499)。式ia抗體-藥物偶聯(lián)物化合物的實(shí)施方案包括(val-cit)、(mc-val-cit)、和(mc-val-cit-pab):式ia抗體-藥物偶聯(lián)物化合物的其它典型實(shí)施方案包括以下結(jié)構(gòu):其中x為：y為：且r獨(dú)立為h或c1-c6烷基；并且n為1－12。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭帶有反應(yīng)性官能基，該反應(yīng)性官能基具有與存在于抗體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)的親核基團(tuán)?？贵w上有用的親電子基團(tuán)包括，但不限于醛和酮羰基。接頭的親核基團(tuán)的雜原子可以與抗體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)并且與抗體單元形成共價(jià)鍵。接頭上有用的親核基團(tuán)包括，但不限于酰肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼?？贵w上的親電子基團(tuán)提供了用于結(jié)合(附著)接頭的便利位置。一般而言，可以通過(guò)在兩種或多種氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵制備肽-類接頭。例如，可以按照肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法(e.和k.lübke(1965)“thepeptides”,volume1,pp76-136,academicpress)制備這類肽鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭可以被調(diào)節(jié)溶解性或反應(yīng)性的基團(tuán)取代。例如，帶電荷的取代基，諸如磺酸基(-so3-)或銨可以增加試劑的水溶性并且有利于接頭試劑與抗體或藥物部分的偶聯(lián)反應(yīng)，或有利于ab-l(抗體-接頭中間體)與d或d-l(藥物-接頭中間體)與ab的偶聯(lián)反應(yīng)，這取決于用于制備adc的合成途徑。特別關(guān)注本發(fā)明的化合物，但不限于：用如下接頭試劑制備的adc：bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)；并且包括雙-馬來(lái)酰亞胺試劑:dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、bm(peo)3和bm(peo)4，它們商購(gòu)自piercebiotechnology,inc.,customerservicedepartment,p.o.box117,rockford,il.61105u.s.a,1-800-874-3723,international+815-968-0747。參見(jiàn)467-498頁(yè),2003-2004applicationshandbookandcatalog、雙-馬來(lái)酰亞胺試劑能夠使半胱氨酸改造的抗體的硫醇與含硫醇的藥物部分、標(biāo)記或接頭中間體按照依次或同時(shí)的方式結(jié)合。除馬來(lái)酰亞胺外的其它與半胱氨酸改造的抗體、藥物部分、標(biāo)記或接頭中間體的硫醇反應(yīng)的官能基包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯(鹽)和異硫氰酸酯(鹽)。還可以通過(guò)其它商業(yè)渠道，諸如molecularbiosciencesinc.(boulder,co)獲得或按照下列文獻(xiàn)中所述的操作步驟合成有用的接頭試劑：toki等(2002)j.org.chem.67:1866-1872；walker,m.a.(1995)j.org.chem.60:5352-5355；frisch等(1996)bioconjugatechem.7:180-186；us6214345；wo02/088172；us2003130189；us2003096743；wo03/026577；wo03/043583；和wo04/032828。具有馬來(lái)酰亞胺stretcher和對(duì)-氨基芐基氨基甲?；?pab)自我犧牲的間隔基的典型纈氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接頭試劑具有如下結(jié)構(gòu)：其中q為-c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；且m為0-4的整數(shù)?？梢园凑誨ubowchik等(1997)tetrahedronletters,38:5257-60所述制備具有馬來(lái)酰亞胺stretcher單元和對(duì)-氨基芐基自我犧牲的間隔基的典型phe-lys(mtr)二肽接頭試劑并且其具有如下結(jié)構(gòu)：其中mtr為一-4-甲氧基三苯甲基，q為-c1-c8烷基、-o-(c1-c8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；且m為0-4的整數(shù)。本發(fā)明典型的抗體-藥物偶聯(lián)物化合物包括:其中val為纈氨酸；cit為瓜氨酸；p為1、2、3或4；且ab為半胱氨酸改造的抗體。其它典型的抗體藥物偶聯(lián)物具有如下結(jié)構(gòu)，其中美登木素生物堿藥物部分dm1通過(guò)bmpeo接頭與曲妥單抗的硫醇連接：其中ab為半胱氨酸改造的抗體；n為0、1或2；和p為1、2、3或4。抗體-藥物偶聯(lián)物的制備可以通過(guò)幾種途徑，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑制備式i的adc，包括：(1)半胱氨酸改造的抗體的半胱氨酸基團(tuán)與接頭試劑反應(yīng)，從而通過(guò)共價(jià)鍵形成抗體-接頭中間體ab-l，隨后與活化的藥物部分d反應(yīng)；和(2)使藥物部分的親核基團(tuán)與接頭試劑反應(yīng)，從而通過(guò)共價(jià)鍵形成藥物-接頭中間體d-l，隨后與半胱氨酸改造的抗體的半胱氨酸基團(tuán)反應(yīng)。偶聯(lián)方法(1)和(2)可以用于各種半胱氨酸改造的抗體、藥物部分和接頭以便制備式i的抗體-藥物偶聯(lián)物?？贵w半胱氨酸硫醇為親核性的并且能夠與接頭試劑和藥物-接頭中間體上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，所述的藥物-接頭中間體包括：(i)活性酯類，諸如nhs酯類、hobt酯類、鹵代甲酸酯類和酰基鹵類；(ii)烷基和芐基鹵化物，諸如鹵代乙酰胺類；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來(lái)酰亞胺基；和(iv)通過(guò)硫化物交換的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。藥物部分上的親核基團(tuán)包括，但不限于：胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基團(tuán)，它們能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵。例如，可以將美登素轉(zhuǎn)化成may-ssch3，可以將其還原成游離硫醇may-sh并且使之與修飾的抗體反應(yīng)(chari等(1992)cancerresearch52:127-131)而生成帶有二硫化物接頭的美登木素生物堿-抗體免疫偶聯(lián)物。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了帶有二硫化物接頭的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物(wo04/016801；us6884874；us2004/039176a1；wo03/068144；us2004/001838a1；美國(guó)專利us6441163,5208020,5416064；wo01/024763)。使用接頭試劑n-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯構(gòu)建二硫化物接頭spp。在某些條件下，可以通過(guò)用還原劑，諸如dtt(cleland試劑,二硫蘇糖醇)或tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽處理使半胱氨酸改造的抗體反應(yīng)以便偶聯(lián)接頭試劑；getz等(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,ma)。在37℃用約50倍過(guò)量的tcep將在cho細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)半胱氨酸改造的單克隆抗體(thiomab)還原3小時(shí)以便還原可以在新引入的半胱氨酸殘基與存在于培養(yǎng)基中的半胱氨酸之間形成的二硫鍵。用10mm乙酸鈉,ph5稀釋還原的thiomab并且上樣至10mm乙酸鈉,ph5中的hitraps柱上并且用含有0.3m氯化鈉的pbs洗脫。在室溫在存在稀(200nm)硫酸銅水溶液(cuso4)的條件下過(guò)夜，使親代mab中的半胱氨酸殘基之間重新建二硫鍵。可以使用本領(lǐng)域公知的其它氧化劑，即氧化劑和氧化條件。環(huán)境空氣氧化也是有效的。這種適度的部分再氧化步驟有效地形成具有高保真度的鏈間二硫鍵。加入約10倍過(guò)量的藥物-接頭中間體，例如bm(peo)4-dm1，混合并且在室溫下保持約1小時(shí)，以便進(jìn)行偶聯(lián)并且形成thiomab抗體-藥物偶聯(lián)物。將偶聯(lián)混合物進(jìn)行凝膠過(guò)濾并且上hitraps柱且洗脫該柱以便除去過(guò)量的藥物-接頭中間體和其它雜質(zhì)。附圖11表示制備由細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的用于偶聯(lián)的半胱氨酸改造的抗體的一般方法。推定帶有各種鏈間二硫鍵的半胱氨酸加合物被還原裂解成抗體的還原形式。在部分氧化條件下，諸如接觸環(huán)境氧重新形成配對(duì)半胱氨酸殘基之間的鏈間二硫鍵。新引入的，改造的和未配對(duì)的半胱氨酸殘基仍然可以用于與接頭試劑或藥物-接頭中間體反應(yīng)而形成本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)的thiomab通過(guò)–s-s-鍵形成產(chǎn)生與改造的cys產(chǎn)生外部偶聯(lián)的cys加合物，因此，純化的thiomab必須如實(shí)施例11中所述通過(guò)還原和氧化操作步驟處理以便產(chǎn)生反應(yīng)性thiomab。這些thiomab用于偶聯(lián)含有馬來(lái)酰亞胺的細(xì)胞毒性藥物、熒光團(tuán)和其它標(biāo)記。制備各種thiofab和thiomab抗體-藥物偶聯(lián)物(實(shí)施例4-8)。使半胱氨酸突變體hu4d5fabv8(v110c)通過(guò)雙-馬來(lái)酰亞氨基接頭試劑bmpeo與美登木素生物堿藥物部分dm1偶聯(lián)而形成hu4d5fabv8(v110c)-bmpeo-dm1(實(shí)施例8)。體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)一般而言，通過(guò)下列步驟測(cè)定抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的細(xì)胞毒性或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性：使具有受體蛋白，例如her2的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中接觸adc的抗體；將細(xì)胞培養(yǎng)約6小時(shí)－約5天的時(shí)間；和測(cè)定細(xì)胞存活率。基于細(xì)胞的體外試驗(yàn)用于測(cè)定存活率(增殖)、細(xì)胞毒性和本發(fā)明adc的程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)(胱天蛋白酶活化)。通過(guò)細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定抗體-藥物偶聯(lián)物的體外功效(附圖10和11,實(shí)施例9)。celltiter-luminescentcellviabilityassay為商購(gòu)的(promegacorp.,madison,wi)基于鞘翅目(coleoptera)熒光素酶的重組表達(dá)的同質(zhì)性試驗(yàn)方法(homogeneousassaymethod)(美國(guó)專利us5583024；5674713和5700670)。該細(xì)胞增殖試驗(yàn)基于對(duì)存在的atp進(jìn)行定量測(cè)定了培養(yǎng)物中存活細(xì)胞的數(shù)量，其中存在的atp為代謝活性細(xì)胞的指示劑(crouch等(1993)j.immunol.meth.160:81-88；us6602677)。在96孔板中進(jìn)行celltiter-assay，使得它易于進(jìn)行自動(dòng)化高流通量篩選(hts)(cree等(1995)anticancerdrugs6:398-404)。同質(zhì)性試驗(yàn)操作步驟包括將單一試劑(celltiter-reagent)直接加入到在血清補(bǔ)充的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中。無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞洗滌、除去培養(yǎng)基和多次吸移的步驟。該系統(tǒng)可以在添加試劑并且混合后10分鐘內(nèi)檢測(cè)384-孔格中低至15個(gè)細(xì)胞/孔?？梢杂胊dc連續(xù)處理細(xì)胞，或可以處理它們并且從adc中分離。一般而言，暫短，即3小時(shí)處理的細(xì)胞表現(xiàn)出與連續(xù)處理的細(xì)胞相同的功效作用。同質(zhì)性“添加-混合-測(cè)定”方式導(dǎo)致細(xì)胞裂解并且產(chǎn)生與存在的atp量成比例的發(fā)光信號(hào)。atp的量與培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞數(shù)量成正比。celltiter-assay產(chǎn)生由熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的“輝光-型(glow-type)”發(fā)光信號(hào)，它具有一般大于5小時(shí)的半衰期，這取決于所用的細(xì)胞類型和培養(yǎng)基。以相對(duì)發(fā)光單位(rlu)反映出存活細(xì)胞。底物甲蟲熒光素被重組熒火蟲熒光素酶氧化脫羧化，而同時(shí)atp轉(zhuǎn)化成amp并且產(chǎn)生光子。體內(nèi)功效通過(guò)高度表達(dá)her2的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠模型測(cè)定本發(fā)明兩種清蛋白結(jié)合肽-dm1(美登木素生物堿)-抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)的體內(nèi)功效(附圖12,實(shí)施例10)。使同種異體移植物從不對(duì)療法起反應(yīng)或?qū)λ姆磻?yīng)差的fo5mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠增殖。用abp-rhufab4d5-cys(輕鏈)-dm1；abp-rhufab4d5-cys(重鏈)-dm1；和安慰劑pbs緩沖液對(duì)照品(媒介物)治療受試者并且在3周內(nèi)檢測(cè)以便測(cè)定腫瘤體積倍增的時(shí)間、log細(xì)胞殺傷和腫瘤縮小?？贵w-藥物偶聯(lián)物的給藥可以通過(guò)適合于所治療疾病的任意途徑給予本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)。一般通過(guò)腸胃外途徑給予adc，即輸注、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外。藥用配制劑本發(fā)明的治療性抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)通常與藥學(xué)上可接受的腸胃外媒介物一起配制成單位劑量可注射形式的藥用配制劑供腸胃外施用，即快速灌注(bolus)、靜脈內(nèi)注射、腫瘤內(nèi)注射。任選將具有所需純度的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(remington'spharmaceuticalsciences(1980)16thedition,osol,a.ed.)成凍干劑型或水溶液形式?？贵w-藥物偶聯(lián)物治療關(guān)注本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)可以用于治療各種疾病或病癥，例如其特征在于腫瘤抗原的過(guò)表達(dá)的疾病或病癥。典型的疾病或過(guò)度增殖性病癥包括良性或惡性腫瘤；白血病和淋巴樣惡性腫瘤。其它疾病包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦、腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間質(zhì)、囊胚腔、炎性、血管發(fā)生和免疫性疾病，包括自身免疫性疾病。一般而言，所治療的疾病或病癥為過(guò)度增殖性疾病，諸如癌癥。癌癥的實(shí)例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。更具體地說(shuō)，這類癌癥包括：鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)；肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌；腹膜癌；肝細(xì)胞癌；胃癌，包括胃腸癌；胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；宮頸癌；卵巢癌；肝癌(livercancer)；膀胱癌；肝細(xì)胞癌(hepatoma)；乳腺癌；結(jié)腸癌；直腸癌；結(jié)直腸癌；子宮內(nèi)膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎癌；前列腺癌、外陰癌；甲狀腺癌；肝癌(hepaticcarcinoma)；肛門癌；陰莖癌和頭頸部癌。adc化合物可以用于治療的自身免疫性疾病包括風(fēng)濕病(諸如，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；斯耶格侖氏綜合征；硬皮??；狼瘡，諸如sle和狼瘡性腎炎；多肌炎/皮肌炎；冷球蛋白血癥；抗-磷脂抗體綜合征；和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性胃腸和肝病(諸如，例如炎癥性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩(crohn's)病)、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎和乳糜瀉(celiacdisease))、血管炎(諸如，例如anca-相關(guān)血管炎，包括丘-施(churg-strauss)血管炎、韋格納(wegener's)肉芽腫和多動(dòng)脈炎)、自身免疫性神經(jīng)疾病(諸如，例如多發(fā)性硬化、斜視眼肌陣攣綜合征(opsoclonusmyoclonussyndrome)、重癥肌無(wú)力、眼腦脊髓病、帕金森(parkinson’s)病、阿爾茨海默(alzheimer’s)病和自身免疫性多神經(jīng)病)、腎臟疾病(諸如，例如腎小球腎炎、古德帕斯徹(goodpasture’s)綜合征和貝格爾(berger’s)病)、自身免疫性皮膚病(諸如，例如銀屑病、蕁麻疹(urticaria)、蕁麻疹(hives)、尋常天皰瘡、大皰性類天皰瘡和皮膚紅斑狼瘡)、血液病(諸如，例如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜和自身免疫性溶血性貧血)、動(dòng)脈粥樣硬化、眼色素層炎、自身免疫性聽(tīng)覺(jué)疾病(諸如，例如內(nèi)耳疾病和,聽(tīng)力喪失)、貝切特(behcet's)病、雷諾(raynaud's)綜合征、器官移植和自身免疫性內(nèi)分泌病癥(諸如，例如糖尿病相關(guān)性自身免疫性疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病(iddm)，阿狄森(addison’s)病和自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯(graves’)病和甲狀腺炎))。更優(yōu)選的這類疾病包括：例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、anca-相關(guān)血管炎、狼瘡、多發(fā)性硬化、斯耶格侖綜合征、格雷夫斯病、iddm、惡性貧血、甲狀腺炎和腎小球腎炎。為了預(yù)防或治療疾病，adc的適當(dāng)劑量取決于如上述定義的所治療的疾病類型、疾病的嚴(yán)重程度和時(shí)程、給予所述分子是為了預(yù)防還是為了治療目的、先前的治療、患者的臨床病史和對(duì)抗體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判定。將所述的分子適當(dāng)對(duì)患者給予一次或在一系列治療過(guò)程中給予。根據(jù)疾病類型和嚴(yán)重程度的不同，對(duì)患者給藥的分子的初始候選劑量約為1μg/kg－15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)，例如，無(wú)論是通過(guò)一次或多次分開(kāi)的給藥，還是通過(guò)連續(xù)輸注。典型的每日劑量可以在約1μg/kg－100mg/kg或更大的范圍，這取決于上述因素。對(duì)患者給予的典型的adc的劑量在約0.1－約10mg/kg患者體重的范圍。為了在幾天或幾天以上時(shí)程中反復(fù)給藥，根據(jù)病情的不同，將治療持續(xù)至對(duì)所需疾病癥狀的抑制發(fā)生為止。典型的給藥方案包含給予約4mg/kg的起始負(fù)荷劑量，隨后給予約2mg/kg抗-erbb2抗體的每周維持劑量。其它劑量方案也是有用的。該療法的進(jìn)展易于通過(guò)常規(guī)技術(shù)和試驗(yàn)監(jiān)測(cè)。標(biāo)記的抗體成像方法在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用放射性核素、熒光染料、激發(fā)生物發(fā)光的底物部分、激發(fā)化學(xué)發(fā)光的部分、酶和其它檢測(cè)標(biāo)記通過(guò)半胱氨酸硫醇來(lái)標(biāo)記半胱氨酸改造的抗體以便用于具有診斷、藥效學(xué)和治療應(yīng)用的成像實(shí)驗(yàn)。一般而言，通過(guò)注射、灌注或口服攝入對(duì)活生物體，例如人、嚙齒動(dòng)物或其它小動(dòng)物、灌注器官或組織樣品給予標(biāo)記的半胱氨酸改造的抗體，即“生物標(biāo)記物”或“探針”。在一定時(shí)間過(guò)程中檢測(cè)探針的分布并且由影像顯示。制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有用于治療上述病癥的物質(zhì)的制品或“試劑盒”。所述的制品包含容器和在容器上或與其相連的標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書。合適的容器包括：例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包等，容器可以由各種材料，諸如玻璃或塑料形成。容器可以容納有效治療疾病的抗體-藥物偶聯(lián)物(adc)組合物并且可以具有無(wú)菌存取口(例如容器可以為靜脈用溶液袋或具有可刺入皮下注射針頭的塞的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為adc。標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書表示組合物用于治療選擇的疾病，諸如癌癥?；蛘呋蛄硗?，所述制品可以進(jìn)一步含有第二種(或第三種)容器，該容器包含藥學(xué)上可接受的緩沖劑，諸如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸緩沖鹽水、林格液和葡萄糖溶液。它可以進(jìn)一步包括從商業(yè)和使用者角度而言需要的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭和注射器。實(shí)施例實(shí)施例1-生物素化的thiofab噬菌體的制備使thiofab-噬菌體(5x1012噬菌體顆粒)與150倍過(guò)量的生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺((+)-生物素基-3-馬來(lái)酰亞氨基丙酰胺基-3,6-二氧雜辛二胺(biotin-peo-maleimide((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3,6-dioxaoctainediamine),oda等(2001)naturebiotechnology19:379-382,piercebiotechnology,inc.)在室溫反應(yīng)3小時(shí)。通過(guò)重復(fù)peg沉淀(3-4次)從生物素-偶聯(lián)的噬菌體中除去過(guò)量的生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺?？梢允褂闷渌藤?gòu)的帶有親電子基團(tuán)的與半胱氨酸硫醇反應(yīng)的生物素化試劑，包括生物素-bmcc、peo-碘乙?；锼亍⒌庖阴；?lc-生物素和生物素-hpdp(piercebiotechnology,inc.)和nα-(3-馬來(lái)酰亞胺基丙?；?生物胞素(nα-(3-maleimidylpropionyl)biocytin)(mpb,molecularprobes,eugene,or)。其它生物素化的雙官能和多官能接頭試劑的商品來(lái)源包括molecularprobes,eugene,or和sigma,st.louis,mo。生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺實(shí)施例2–pheselector測(cè)定法將牛血清清蛋白(bsa)、erbb2胞外結(jié)構(gòu)域(her2)和鏈霉抗生物素(100μl的2μg/ml)分別包被在maxisorp96孔平板上。在用0.5％tween-20(在pbs中)封閉后，在室溫孵育生物素化和未-生物素化的hu4d5fabv8-thiofab-噬菌體(2x1010個(gè)噬菌體顆粒)1小時(shí)，隨后與辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的二抗(抗-m13噬菌體包膜蛋白,pviii蛋白抗體)一起孵育。附圖8通過(guò)描繪fab或thiofab與her2(上)和生物素化的thiofab與鏈霉抗生物素(下)結(jié)合的圖示例示了pheselector測(cè)定法。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)hrp反應(yīng)并且在450nm處測(cè)定吸光度。通過(guò)計(jì)算鏈霉抗生物素的od450/her2的od450之比測(cè)定硫醇反應(yīng)性。硫醇反應(yīng)值為1表示半胱氨酸硫醇完全生物素化。就fab蛋白結(jié)合測(cè)定而言，使用hu4d5fabv8(2-20ng)，隨后與hrp標(biāo)記的山羊多克隆抗-fab抗體一起溫育。實(shí)施例3a–thiofab的表達(dá)和純化在非阻抑性大腸桿菌菌株34b8中誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)thiofab(baca等(1997)journalbiologicalchemistry272(16):10678-84)。將收集的細(xì)胞沉淀重新懸浮于pbs(磷酸緩沖鹽水)中，使所述細(xì)胞沉淀經(jīng)過(guò)微流化儀(microfluidier)進(jìn)行完全細(xì)胞裂解并且通過(guò)使用蛋白質(zhì)gsepharosetm(amersham)的親和層析法純化thiofab。表達(dá)thiofabl-v15c、l-v110c、h-a88c和h-a121c并且通過(guò)蛋白質(zhì)-gsepharosetm柱層析法純化。寡聚-fab存在于級(jí)分26－30中，并且大部分單體形式存在于級(jí)分31-34中。收集由單體形式組成的級(jí)分并且通過(guò)sds-page分析它們以及野生型hu4d5fabv8，并且用sds-page凝膠在還原(使用dtt或bme)和非-還原(不使用dtt或bme)條件下分析。使用非-還原sds-page分析a121c-thiofab的凝膠過(guò)濾級(jí)分。如上所述使thiofab與生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)并且通過(guò)superdex-200tm(amersham)凝膠過(guò)濾層析法進(jìn)一步純化生物素化-thiofab，該過(guò)程消除了游離的生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺和thiofab的寡聚級(jí)分。將野生型hu4d5fabv8和hu4d5fabv8a121c-thiofab(用量0.5mg)各自和單獨(dú)與100倍摩爾過(guò)量的生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺在室溫溫育3小時(shí)并且上樣至superdex-200凝膠過(guò)濾柱，以便從單體形式中分離游離的生物素和寡聚fab。實(shí)施例3b–thiofab的分析通過(guò)液相層析電噴射離子化質(zhì)譜(ls-esi-ms)分析生物素化的hu4d5fabv8(a121c)thiofab和野生型hu4d5fabv8的酶促消化片段。生物素化的hu4d5fabv8(a121c)的原始質(zhì)量48294.5與野生型hu4d5fabv8的原始質(zhì)量47737.0之差為557.5質(zhì)量單位。該片段表明存在單一生物素-peo-馬來(lái)酰亞胺部分(c23h36n5o7s2)。表8顯示了片段化值，其證實(shí)了該序列。表8胰蛋白酶消化后生物素化的hu4d5fabv8thiofaba121c的lc-esi-質(zhì)譜分析在superdex-200凝膠過(guò)濾前后，對(duì)生物素化的abp-hu4d5fabv8-a121c、生物素化的abp-hu4d5fabv8-v110c、生物素化的雙cysabp-hu4d5fabv8-(v110c-a88c)和生物素化的雙cysabp-hu4d5fabv8-(v110c-a121c)進(jìn)行使用和不使用dtt或bme還原的sds-page凝膠分析。hu4d5fabv8-(v110c)-bmpeo-dm1的質(zhì)譜分析(ms/ms)(superdex-200凝膠過(guò)濾純化后)：fab+151607.5；fab50515.5。該數(shù)據(jù)表示91.2％偶聯(lián)。hu4d5fabv8-(v110c)-bmpeo-dm1(還原的)的ms/ms分析：lc23447.2；lc+124537.3；hc(fab)27072.5。該數(shù)據(jù)表示所有dm1偶聯(lián)均在fab的輕鏈上。實(shí)施例4–通過(guò)偶聯(lián)abp-hu4d5fabv8-(v110c)和mc-mmae制備abp-hu4d5fabv8-(v110c)-mc-mmae依照us7521541、us7659241、和us7498298，用已知濃度的乙腈和水稀釋溶于dmso的藥物接頭試劑馬來(lái)酰亞氨基辛?；?一甲基auristatine(maleimidocaproyl-monomethylauristatine)(mmae)，即mc-mmae并且加入到冷卻的在磷酸緩沖鹽水(pbs)中的abp-hu4d5fabv8-(v110c)thiofab中。在約1小時(shí)后，加入過(guò)量的馬來(lái)酰亞胺以使反應(yīng)猝滅并且將任何未反應(yīng)的抗體硫醇封端。通過(guò)離心超濾濃縮該反應(yīng)混合物并且純化abp-hu4d5fabv8-(v110c)-mc-mmae且通過(guò)經(jīng)在pbs中的g25樹(shù)脂洗脫而脫鹽，通過(guò)0.2μm濾膜在無(wú)菌條件下過(guò)濾并且冷凍以便貯存。實(shí)施例5–通過(guò)偶聯(lián)abp-hu4d5fabv8-(lcv110c)和mc-mmaf制備abp-hu4d5fabv8-(lcv110c)-mc-mmaf按照實(shí)施例4的操作步驟，通過(guò)偶聯(lián)abp-hu4d5fabv8-(lcv110c)thiofab和mc-mmaf制備abp-hu4d5fabv8-(lcv110c)-mc-mmaf。實(shí)施例6–通過(guò)偶聯(lián)abp-hca121c-thiofab和mc-val-cit-pab-mmae制備abp-hca121c-thiofab-mc-val-cit-pab-mmae按照實(shí)施例4的操作步驟，通過(guò)偶聯(lián)abp-hu4d5fabv8-(hca121c)和mc-val-cit-pab-mmae制備abp-hu4d5fabv8-(hca121c)-mc-val-cit-pab-mmae。實(shí)施例7–通過(guò)偶聯(lián)abp-hca121c-thiofab和mc-val-cit-pab-mmaf制備abp-hca121c-thiofab-mc-val-cit-pab-mmaf按照實(shí)施例4的操作步驟，通過(guò)偶聯(lián)abp-hu4d5fabv8-(hca121c)和mc-val-cit-pab-mmaf制備abp-hu4d5fabv8-(hca121c)-mc-val-cit-pab-mmaf。mc-val-cit-pab-mmaf實(shí)施例8-hu4d5fabv8-(lcv110c)thiofab-bmpeo-dm1的制備用雙-馬來(lái)酰亞胺試劑bm(peo)4(piercechemical)修飾hu4d5fabv8-(v110c)thiofab上的游離半胱氨酸，在抗體的表面上留下未反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺基。該過(guò)程通過(guò)下列步驟完成：將bm(peo)4溶于50％乙醇/水混合物至10mm濃度并且向在磷酸緩沖鹽水中含有hu4d5fabv8-(v110c)thiofab的溶液中加入10倍摩爾過(guò)量的約1.6mg/ml(10微摩爾)的bm(peo)3，且使其反應(yīng)1小時(shí)。通過(guò)在含有150mmnacl緩沖液的30mm檸檬酸鹽,ph6中的凝膠過(guò)濾除去過(guò)量的bm(peo)3(hitrapcolumn,pharmacia)。向hu4d5fabv8-(lcv110c)thiofab-bmpeo中間體中加入約10倍摩爾過(guò)量的溶于二甲基乙酰胺(dma)的dm1。還可以將二甲基甲酰胺(dmf)用于溶解藥物部分試劑。使該反應(yīng)混合物反應(yīng)過(guò)夜，此后進(jìn)行凝膠過(guò)濾或透析入pbs以便除去未反應(yīng)的藥物。將在pbs中的s200柱上的凝膠過(guò)濾用于除去高分子量聚集物并且得到純化的hu4d5fabv8-(lcv110c)thiofab-bmpeo-dm1。通過(guò)相同的方案制備hu4d5fabv8(hca121c)thiofab-bmpeo-dm1。實(shí)施例9–體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)通過(guò)使用下列方案的細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定adc功效(celltitergloluminiscentcellviabilityassay,promegacorp.technicalbulletintb288；mendoza等(2002)cancerres.62:5485-5488):1.使在培養(yǎng)基中含有約104個(gè)細(xì)胞(skbr-3、bt474、mcf7或mda-mb-468)的100μl細(xì)胞培養(yǎng)物等份沉積在96-孔不透明壁的平板的各孔中。2.制備含有培養(yǎng)基，但不含細(xì)胞的對(duì)照孔。3.將adc加入到實(shí)驗(yàn)孔中并且溫育3-5天。4.使平板平衡至室溫約30分鐘。5.加入等于存在于各孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基的體積的celltiter-gloreagent。6.將內(nèi)含物在定軌振蕩器上混合2分鐘以便誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。7.將平板在室溫溫育10分鐘以便穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)。8.記錄發(fā)光并且作為rlu＝相對(duì)發(fā)光單位在圖中報(bào)導(dǎo)。將某些細(xì)胞以1000-2000/孔(pc3系)或2000-3000/孔(ovcar-3)接種在96-孔平板上，50ul/孔。在1(pc3)或2(ovcar-3)天后，加入在50μl體積中的adc至終濃度為9000，3000，1000，333，111，37，12.4，4.1或1.4ng/ml，其中"無(wú)adc"對(duì)照孔僅接受培養(yǎng)基。條件為一式兩份或一式三份。3(pc3)或4-5(ovcar-3)天后，加入100μl/孔celltitergloii(基于熒光素酶的試驗(yàn)；根據(jù)atp水平測(cè)定的增殖)并且使用發(fā)光計(jì)測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。將數(shù)據(jù)繪制成各組重復(fù)測(cè)定的發(fā)光平均值，其中使用標(biāo)準(zhǔn)偏差條柱形圖。該方案為celltitergloluminiscentcellviabilityassay(promega)的修改方案：1.用1000細(xì)胞/孔的pc3/muc16，pc3/neo(在50μl/孔中)的培養(yǎng)基鋪板。應(yīng)將ovcar3細(xì)胞以2000細(xì)胞/孔(在50μl中)的其培養(yǎng)基鋪板(培養(yǎng)基的配方如下)。允許細(xì)胞附著過(guò)夜。2.以18μg/ml的工作濃度開(kāi)始按照順序在培養(yǎng)基中以1:3連續(xù)稀釋adc(這導(dǎo)致終濃度為9μg/ml)。將50μl稀釋的adc加入到已經(jīng)在孔中的50μl細(xì)胞和培養(yǎng)基中。3.孵育72-96小時(shí)(標(biāo)準(zhǔn)品為72小時(shí)，但在細(xì)胞達(dá)到85-95％融合率時(shí)，觀察到0ug/ml濃度，終止試驗(yàn))。4.加入100μl/孔的promegacelltiterglo試劑，振搖3分鐘并且在發(fā)光計(jì)上讀數(shù)。培養(yǎng)基:pc3/neo和pc3/muc16生長(zhǎng)在50/50/10％fbs/谷氨酰胺/250μg/mlg-418ovcar-3生長(zhǎng)在rpmi/20％fbs/谷氨酰胺中。實(shí)施例10–高度表達(dá)her2的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠的腫瘤生長(zhǎng)抑制體內(nèi)功效適合于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的動(dòng)物可以獲自標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)來(lái)源，諸如taconic(germantown,n.y.)。許多品系都是合適的，但優(yōu)選fvb雌性小鼠，因?yàn)樗鼈儗?duì)腫瘤形成高度易感。將fvb雄小鼠用于交配并且將切除輸精管的cd.1種畜用于刺激假性妊娠。切除輸精管的小鼠可以獲自任何商品供應(yīng)商。使用fvb小鼠或129/bl6xfvbp53雜合型小鼠繁殖建立者(founder)。將在p53等位基因上具有雜合性的小鼠用于潛在地增加腫瘤形成。然而，已經(jīng)證實(shí)這是不必要的。因此，某些f1腫瘤具有混合的品系。建立者的腫瘤僅為fvb。獲得了有某種程度的腫瘤發(fā)生但未產(chǎn)仔的6個(gè)建立者。通過(guò)iv注射adc用單劑量或多劑治療具有腫瘤(由fo5mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖的同種異體移植物)的動(dòng)物。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)腫瘤體積。腫瘤易于在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，這些小鼠表達(dá)neu的突變活化形式，即大鼠her2的同源物，而在人乳腺癌中過(guò)表達(dá)的her2未突變并且腫瘤形成遠(yuǎn)低于過(guò)表達(dá)未突變her2的轉(zhuǎn)基因小鼠(webster等(1994)semin.cancerbiol.5:69-76)。為了改善具有未突變的her2的腫瘤形成，使用her2cdna質(zhì)粒生成轉(zhuǎn)基因小鼠，其中atg的上游缺失，以便防止在這類上游atg密碼子上起始翻譯，否則就可能減少?gòu)膆er2的下游真正起始密碼子起始翻譯的頻率(例如，參見(jiàn)child等(1999)j.biol.chem.274:24335-24341)。另外，將嵌合內(nèi)含子添加到5’末端上，這也應(yīng)如以前報(bào)導(dǎo)的提高表達(dá)水平(neuberger和williams(1988)nucleicacidsres.16:6713；buchman和berg(1988)mol.cell.biol.8:4395；brinster等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:836)。嵌合內(nèi)含子來(lái)源于promega載體，即pci-neo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(bp890-1022)。cdna3’-末端位于人生長(zhǎng)激素外顯子4和5和聚腺苷酸化序列的側(cè)翼。此外，使用fvb小鼠，因?yàn)樵撈废蹈赘心[瘤發(fā)生。來(lái)自mmtv-ltr的啟動(dòng)子用于確保在乳腺中的組織特異性her2表達(dá)。給動(dòng)物飼喂ain76a膳食以便增加對(duì)腫瘤形成的易感性(rao等(1997)breastcancerres.andtreatment45:149-158)。實(shí)施例11–用于偶聯(lián)的thiomab的還原/氧化用約50倍過(guò)量的tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride)；getz等(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,ma)在37℃將在cho細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)半胱氨酸改造的單克隆抗體(thiomab)還原3小時(shí)。稀釋還原的thiomab(附圖11)并且上樣到10mm乙酸鈉,ph5中的hitraps柱上并且用含有0.3m氯化鈉的pbs洗脫。在室溫用200nm硫酸銅水溶液(cuso4)將洗脫的還原的thiomab處理過(guò)夜。去氫抗壞血酸(dhaa)和環(huán)境空氣氧化也是有效的氧化劑。實(shí)施例12–thiomab的偶聯(lián)將來(lái)自實(shí)施例11的再氧化的thiomab，包括硫代-曲妥單抗(hca121c)、thio-2h9(a121c)和thio-3a5(a121c)與10倍過(guò)量的藥物-接頭中間體bm(peo)3-dm1合并，混合并且在室溫保持約1小時(shí)，以便進(jìn)行偶聯(lián)并且形成thiomab抗體-藥物偶聯(lián)物，包括硫代-曲妥單抗(hca121c)-bmpeo-dm1、thio-2h9(hca121c)-bmpeo-dm1和thio-3a5(hca121c)-bmpeo-dm1。將該偶聯(lián)混合物進(jìn)行凝膠過(guò)濾或上柱并且通過(guò)hitraps柱洗脫以便除去過(guò)量的藥物-接頭中間體和其它雜質(zhì)。本發(fā)明并不限于由實(shí)施例中披露的具體實(shí)施方案的范圍，這些實(shí)施例用來(lái)例示本發(fā)明的幾個(gè)方面并且在功能上等效的任意實(shí)施方案均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，除本文所示和所述的外，本發(fā)明的各種變型也對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見(jiàn)的并且屬于本文所附權(quán)利要求的范圍。通過(guò)述及明確收錄貫穿本說(shuō)明書引用的所有專利、專利申請(qǐng)、和參考文獻(xiàn)全文用于所有目的。序列表<110>s·巴克塔（bhakta,sunil）j·r·朱納圖拉（junutula,jagathreddy）<120>半胱氨酸改造的抗體和偶聯(lián)物<130>p4444r1<141>2011-06-07<150>us61/352,728<151>2010-06-08<160>147<210>1<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>1cysasplysthrhisthrglyglyglyserglnargleumetglu151015aspilecysleuproargtrpglycysleutrpgluaspaspphe202530<210>2<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>2glnargleumetgluaspilecysleuproargtrpglycysleu151015trpgluaspaspphe20<210>3<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>3glnargleuilegluaspilecysleuproargtrpglycysleu151015trpgluaspaspphe20<210>4<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>4argleuilegluaspilecysleuproargtrpglycysleutrp151015gluaspasp<210>5<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>5aspilecysleuproargtrpglycysleutrp1510<210>6<211>450<212>prt<213>人工序列<220><223>人工蛋白(artificialprotein)<400>6gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnprogly151015glyserleuargleusercysalaalaserglypheasnilelys202530aspthrtyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleu354045glutrpvalalaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyr505560alaaspservallysglyargphethrileseralaaspthrser657075lysasnthralatyrleuglnmetasnserleuargcysgluasp808590thralavaltyrtyrcysserargtrpglyglyaspglyphetyr95100105alametasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser110115120alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserser125130135lysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallys140145150asptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyala155160165leuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser170175180glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser185190195leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser200205210asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplys215220225thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly230235240proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet245250255ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser260265270hisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval275280285gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasn290295300serthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp305310315trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala320325330leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglygln335340345proarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu350355360metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe365370375tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnpro380385390gluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly395400405serphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp410415420glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu425430435hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys440445450<210>7<211>450<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>7gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnprogly151015glyserleuargleusercysalaalaserglypheasnilelys202530aspthrtyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleu354045glutrpvalalaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyr505560alaaspservallysglyargphethrileseralaaspthrser657075lysasnthralatyrleuglnmetasnserleuargalagluasp808590thralavaltyrtyrcysserargtrpglyglyaspglyphetyr95100105alametasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser110115120cysserthrlysglyproservalpheproleualaproserser125130135lysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallys140145150asptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyala155160165leuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser170175180glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser185190195leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser200205210asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplys215220225thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly230235240proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet245250255ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser260265270hisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyval275280285gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasn290295300serthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp305310315trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala320325330leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglygln335340345proarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu350355360metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe365370375tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnpro380385390gluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly395400405serphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrp410415420glnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu425430435hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys440445450<210>8<211>214<212>prt<213>人工序列<220><223>化學(xué)合成<400>8aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaserval151015glyaspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalasn202530thralavalalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolys354045leuleuiletyrseralaserpheleutyrserglyvalproser505560argpheserglyserargserglythraspphethrleuthrile657075serserleuglnprogluaspp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