本申請是申請日為2010年7月2日、申請?zhí)枮?01080029985.0、發(fā)明名稱為“用于治療呼吸病癥的醫(yī)藥碳水化合物”的申請的分案申請。

本發(fā)明涉及用于治療咳嗽及包括病毒性/細(xì)菌性感染后(postviral/bacterialinfections)、急性/慢性支氣管炎、copd和炎癥的相關(guān)呼吸病癥的新方法以及式(1)和/或(2)的一組碳水化合物及其組合物。

背景技術(shù)：

在人類中，具有足球場面積的呼吸道是身體與外界聯(lián)系的充分空氣交換所需的最大表面；同時(shí)，它受到空氣中的許多物理、化學(xué)和生物物質(zhì)的影響，從而引起肺和呼吸道紊亂，包括哮喘、慢性阻塞性肺病、炎癥。此外，某些遺傳性紊亂例如囊性纖維化也受到呼吸道與外界聯(lián)系的影響。病毒和細(xì)菌可能進(jìn)入身體并引起發(fā)生呼吸道感染。

咳嗽是需要治療的一種普通病癥。然而，現(xiàn)行治療僅限于緩解征狀以便讓身體自行恢復(fù)，并且在多數(shù)情況下恢復(fù)是緩慢的。

在澳大利亞，止咳糖漿的銷售一年超過$兩千萬。據(jù)估計(jì)，止咳糖漿的全球市場每年超過$10億。

時(shí)常伴隨正常期的持續(xù)性咳嗽持續(xù)幾個(gè)月乃至幾年，這歸因于支氣管哮喘、隱匿回流(occultreflex)或病毒性/細(xì)菌性感染后以及吸煙引起氣道變得過敏/反應(yīng)過度。因此，存在對于身體在受到空氣中能夠引起呼吸系統(tǒng)紊亂的許多物理、化學(xué)和生物物質(zhì)影響后能夠促進(jìn)其恢復(fù)的有效治療的需求。

本說明書中包括文獻(xiàn)、作用、材料、設(shè)備和制品等的討論，它們僅僅旨在提供本發(fā)明的背景。并非暗示或表示因?yàn)槠浯嬖谟诒旧暾埜鳈?quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前，任何或所有這些內(nèi)容便形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或者是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的常識。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)受試者的受損呼吸細(xì)胞表面上的唾液酸糖綴合物(sialylglycoconjugate)的修復(fù)以治療受試者中的呼吸病癥的方法，所述方法包括向受試者施用能夠加速唾液酸糖綴合物生物合成的至少一種藥物學(xué)可接受的化合物的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法提供細(xì)胞活力的恢復(fù)，以使細(xì)胞處于正常生物功能的更好狀態(tài)以應(yīng)答可能影響呼吸表面從而引起呼吸病癥的因子，所述呼吸病癥例如但不限于咳嗽、病毒性或細(xì)菌性感染后、急性/慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纖維化及其它呼吸道炎癥。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自由式(1)和式(2)的化合物和它們的藥物學(xué)可接受的鹽和衍生物及其組合組成的組的化合物的用途。所述用途是用于治療或預(yù)防如本文所述的呼吸病癥。

在本發(fā)明的其他方面，提供包含至少一種能夠加速唾液酸糖綴合物生物合成的藥物學(xué)可接受的化合物以用于治療和預(yù)防呼吸病癥的組合物和藥物組合物。

在本發(fā)明的另一方面，還提供用于篩選治療呼吸病癥的化合物的方法，所述方法包括：

用試驗(yàn)化合物處理在細(xì)胞表面上具有降低的唾液酸糖綴合物的細(xì)胞；和

在將所述試驗(yàn)化合物暴露于所述細(xì)胞之后測量所述細(xì)胞表面上唾液酸糖綴合物的恢復(fù)。

在所述細(xì)胞表面上所述唾液酸糖綴合物的恢復(fù)的測量可通過測量所述細(xì)胞的活力來測定。

在本發(fā)明的另一方面，還提供治療或預(yù)防受試者的呼吸病癥的方法，所述方法包括向受試者施用通過所述篩選方法鑒定的至少一種化合物的步驟。

附圖說明

圖1顯示活細(xì)胞內(nèi)唾液酸糖綴合物的生物合成途徑。

具體實(shí)施方式

從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的觀點(diǎn)來看，受損呼吸道的受損細(xì)胞表面可引起受損呼吸道過敏/反應(yīng)過度，然后將對刺激物的刺激敏感。例如，申請人已發(fā)現(xiàn)病毒或細(xì)菌感染后呼吸道細(xì)胞經(jīng)常在其表面唾液酸糖綴合物上丟失末端唾液酸。結(jié)果，降低“裸”細(xì)胞的活力。然后其引起導(dǎo)致支氣管炎和咳嗽的炎性反應(yīng)。不受理論的限制，假定在細(xì)胞表面上唾液酸的恢復(fù)可修復(fù)由感染或其它物理、化學(xué)、生物因子損傷的呼吸道，從而最終治愈支氣管炎，并終止咳嗽。

申請人現(xiàn)已在本申請中示出了在兩種人類呼吸道細(xì)胞系(小氣道上皮細(xì)胞(saec)和正常人支氣管/氣管上皮細(xì)胞(nhbe))中進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。首先用來自流感病毒或細(xì)菌的神經(jīng)氨酸苷酶(nas)處理細(xì)胞。nas從細(xì)胞表面唾液酸糖綴合物中切割唾液酸。結(jié)果，降低了“裸”細(xì)胞的活力。例如，當(dāng)用0.01u/ml終濃度下的產(chǎn)氣莢膜梭菌(c.perfringens)na，或用0.17μg/孔終濃度下的流感病毒nws/g70cna處理時(shí)，saec損失超過25％的活力。在nhbe細(xì)胞系中也得到了類似結(jié)果。在用na處理細(xì)胞后，洗滌細(xì)胞以除去na，然后用式(1)和/或(2)的化合物孵育24小時(shí)。最終測定細(xì)胞的活力。結(jié)果(實(shí)施例7-36)顯示式(1)和/或(2)的一組碳水化合物能夠通過在細(xì)胞表面上修復(fù)唾液酸糖綴合物來幫助受損呼吸道細(xì)胞活力的恢復(fù)。

因此，在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)受試者的受損呼吸細(xì)胞表面上的唾液酸糖綴合物的修復(fù)以治療受試者中的呼吸病癥的方法，所述方法包括向受試者施用能夠加速唾液酸糖綴合物生物合成的至少一種藥物學(xué)可接受的化合物的步驟。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)受試者的受損呼吸細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞活力以治療受試者中的呼吸病癥的方法，所述方法包括向受試者施用能夠加速唾液酸糖綴合物生物合成的至少一種藥物學(xué)可接受的化合物的步驟。

促進(jìn)唾液酸糖綴合物在呼吸細(xì)胞表面上的修復(fù)也可表示細(xì)胞恢復(fù)到生存狀態(tài)或活力的恢復(fù)，從而使細(xì)胞處于正常生物功能的更好狀態(tài)以應(yīng)答可影響呼吸表面從而導(dǎo)致呼吸病癥的因子，所述呼吸病癥例如但不限于咳嗽、病毒性或細(xì)菌性感染后、急性/慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纖維化及其他呼吸道炎癥。

在另一實(shí)施方案中，至少一種藥物學(xué)可接受的化合物選自由能夠作為中間物參與唾液酸糖綴合物生物合成的碳水化合物、其前體及其前藥和其藥物學(xué)可接受的鹽和衍生物及其組合組成的組。

可口服、通過吸入或注射給藥使用上述化合物以治療呼吸病癥，所述呼吸病癥選自由咳嗽、病毒性或細(xì)菌性感染后、急性/慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纖維化及其它呼吸道炎癥組成的組。

貫穿本申請文件的說明書和權(quán)利要求書的詞語“包括(comprise)”及該詞語的變形，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”不意于排除其它添加劑、組分、統(tǒng)一體(integers)或步驟。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自由式(1)的化合物和式(2)的化合物組成的組的化合物的用途：

其中，

當(dāng)b＝h時(shí)，a可為nhcoch3、nh2、oh、nh2·hx或者當(dāng)a＝h時(shí)，b可為nhcoch3、nh2、nh2·hx，hx可為藥物學(xué)適宜的無機(jī)或有機(jī)酸，例如鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、檸檬酸等；

r¹、r²、r³、r⁴可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、ch2ph、cocr⁵r⁶r⁷、co-活性酯如新戊酯(pivaester)、茚基酯；

r⁵、r⁶、r⁷可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、c6h5、ch2ph、ch3ch2(och2ch2)mch3(m＝1～200)；和

r⁴可以是

r^5'、r^6'可以相同或不同。它們可以是h或藥物學(xué)適宜的無機(jī)或有機(jī)鹽，例如na、k、ca、mg、zn、nh3、三乙胺等，或者r^5'、r^6'可以是藥物學(xué)適宜的酯，例如(ch2)nch3(n＝1～20)或ch3ch2(och2ch2)mch3(m＝1～200)或活性酯如新戊酯、茚基酯；

其中，

r⁸可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、ch2ph、coch2ph、co-活性酯，例如新戊酯、茚基酯、cocr¹⁴r¹⁵r¹⁶；其中r¹⁴、r¹⁵、r¹⁶可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、c6h5、ch2ph、ch2ch2(och2ch2)mch3(m＝1～200)；

r⁸可以是胞嘧啶核苷、胞苷單磷酸、胞苷二磷酸、胞苷三磷酸、腺嘌呤核苷、腺苷單磷酸、腺苷二磷酸、腺苷三磷酸；

r⁹可以是h、ch3、藥物學(xué)可接受的無機(jī)或有機(jī)鹽，例如na、k、ca、mg、zn、nh3、三乙胺等，或者是藥物學(xué)適宜的活性酯，例如新戊酯、茚基酯等，或者是ch2cr¹⁷r¹⁸r¹⁹其中r¹⁷、r¹⁸、r¹⁹可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、ch2ch2(och2ch2)mch3(m＝1～200)、c6h5、ch2ph；

r¹⁰、r¹¹、r¹²、r¹³可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、ch2ph、活性酯，例如piva酯或cocr²⁰r²¹r²²。其中r²⁰、r²¹、r²²可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、c6h5、ch2ph、ch2ch2(och2ch2)mch3(m＝1～200)；

r¹³可以是

r²³、r²⁴可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、ch2ch2(och2ch2)mch3(m＝1～200)、ch2ph，或活性酯如新戊酯、茚基酯或ch2cr²⁵r²⁶r²⁷，或者藥物學(xué)可接受的無機(jī)或有機(jī)鹽，例如na、k、ca、mg、zn、nh3、三乙胺等，和r²⁵、r²⁶、r²⁷可以相同或不同。它們可以是h、ch3、(ch2)nch3(n＝1～20)、c6h5、ch2ph。

在一個(gè)實(shí)施方案的式(1)中，當(dāng)a＝nhcoch3，b＝h，r¹、r²、r³、r⁴＝h時(shí)，所述化合物為n-乙酰-d-甘露糖胺。貫穿本說明書將其稱為化合物(1)。

在另一實(shí)施方案的式(2)中，當(dāng)r⁸、r¹⁰、r¹¹、r¹²、r¹³＝h，r⁹＝na時(shí)，所述化合物為n-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽(唾液酸鈉鹽)。貫穿本說明書將其稱為化合物(2)。

當(dāng)r⁸為胞苷單磷酸，并且r⁹、r¹⁰、r¹¹、r¹²、r¹³＝h時(shí)，所述化合物為cmp-唾液酸。

作為細(xì)胞表面上糖綴合物的寡糖鏈上的末端糖，唾液酸非常適合作為特定生物過程例如細(xì)胞粘附^[1]、識別決定簇的形成或屏蔽^[2][3]以及糖蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化^[4]的分子決定簇(moleculardeterminant)?；罴?xì)胞中唾液酸糖綴合物的生物合成途徑示于圖1^[5]。

據(jù)報(bào)道，n-乙酰神經(jīng)氨酸而非乳糖，劑量依賴性地防御粘液纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)(mucocilliarytransport)的損傷^[6]。此外，在兔子中利用反復(fù)給藥(吸入)n-乙酰神經(jīng)氨酸的預(yù)治療顯著地預(yù)防了由長期暴露so2引起的炎癥改變^[7]。另外據(jù)報(bào)道，向哺乳動(dòng)物口服給藥n-乙酰-d-甘露糖胺，其被迅速地代謝為葡萄糖^[8]。還報(bào)道了施用n-乙酰甘露糖胺或其衍生物(以在缺乏糖分子的患者內(nèi)產(chǎn)生唾液酸)以治療肌肉萎縮的方法，所述肌肉萎縮包括遺傳性包涵體肌病(himb)和有鑲邊空泡遠(yuǎn)端肌病(nonaka肌病)。某些腎病癥例如起因于腎膜的唾液酸化不足(hyposialytion)也可通過該方法而治療^[8b][8c]。

然而，這些治療中沒有涉及這些中間物用于治療呼吸病癥的用途。

申請人已試驗(yàn)了式(1)和/或(2)的化合物的安全性。例如，在耐受性和亞慢性毒性研究中對balb-c小鼠(aec批準(zhǔn)碼：bam/b/2005/16)使用化合物(1)和(2)。耐受性研究的結(jié)果顯示兩種化合物對于口服劑量在5g/kg或?qū)τ诟骨粌?nèi)劑量在2g/kg是良好耐受的。在亞慢性毒性研究中，結(jié)果顯示兩種化合物對于口服劑量在1g/kg/天×30天或者對于腹腔內(nèi)劑量在0.5g/kg/天×30天是非毒性的。

申請人還建立了豚鼠(guineapig)咳嗽模型。在該模型中試驗(yàn)了化合物(1)和(2)。在500mg/kg/天×3天的口服劑量下，兩種化合物能夠使由豚鼠內(nèi)神經(jīng)氨酸苷酶引起的呼吸道損害修復(fù)。這些體內(nèi)結(jié)果與體外數(shù)據(jù)一致。因此，效力和安全性數(shù)據(jù)均支持式(1)和/或(2)的化合物，和特別是化合物(1)和(2)可用于醫(yī)藥應(yīng)用。

申請人已發(fā)現(xiàn)式(1)和/或(2)的化合物能夠通過在受損呼吸道細(xì)胞表面上修復(fù)唾液酸糖綴合物來加速恢復(fù)受損呼吸道細(xì)胞的活力。

式(1)和/或(2)的化合物在進(jìn)入細(xì)胞后增強(qiáng)了唾液酸糖綴合物的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的一方面涉及式(1)和/或(2)的化合物及其藥物學(xué)可接受的鹽和衍生物及其組合或它們的混合物作為用于治療咳嗽及相關(guān)的呼吸病癥的活性治療劑的用途，所述相關(guān)的呼吸病癥包括細(xì)菌性感染病毒性/細(xì)菌性感染后、急性/慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纖維化和炎癥。

式(1)和/或(2)的化合物的藥物學(xué)可接受組合物及其混合物還可通過將它們與一種或多種用于治療呼吸病癥的其它活性成分組合來形成。所述其它活性成分例如，膽茶堿(支氣管擴(kuò)張劑(bronchodialator))、茶堿(支氣管擴(kuò)張劑)、舒喘靈(salbutamol)和硫酸特布他林(緩解與哮喘及其它呼吸病癥相關(guān)的支氣管痙攣)、溴己新(bromhexine)(祛痰藥、粘液溶解藥)、可待因、福爾可定(pholcodeine)(止痛藥、止咳藥)、氯苯達(dá)諾(clofedanol)(止咳藥)、噴托維林(pentoxyverine)(止咳藥)、二甲氧酯、海罌栗堿(止咳藥)、普若姆待(promdate)、他洛昔明(taloximine)、乙酰胡椒乙胺(acetylpiperacetamide)、桉葉油(eucalypusoil)、氯化銨和草藥例如川貝母(fritillariaecirrhosae)(鎮(zhèn)咳草藥)。粘蛋白合成抑制劑例如他尼氟酯(talniflumate)、2-氨基-苯基-乙酸，或與某些糖皮質(zhì)激素例如氟尼縮松(平喘藥)組合；或與癥狀緩解藥物學(xué)相容性止咳糖漿組合；或與磷酸二酯酶-4抑制劑如用于治療慢性阻塞性肺病(copd)的西洛司特(ariflo)組合。

此外，式(1)和/或(2)的化合物的藥物學(xué)可接受組合物及其藥物學(xué)可接受的鹽和衍生物及其組合以及它們的混合物還可通過將其與一種或多種其它活性成分的組合來形成，所述其它活性成分例如，抗病毒劑如扎納米韋(zanamivir)和/或奧司他韋(oseltamivir)(抗流感病毒劑)、普可那利(pleconaril)和/或恩韋肟(enviroxime)(抗鼻病毒劑)；抗微生物劑，例如抗生素如紅霉素、四環(huán)素、利福霉素、青霉素、頭孢霉素；喹諾酮、氟喹諾酮類(fluoroquinolones)；磺酰胺類和三甲氧芐二氨嘧啶；抗真菌劑，例如兩性霉素、克霉唑(clotrimazole)、益康唑、氟康唑、氟胞嘧啶等。

本文涉及到的式(1)和/或(2)的化合物包括式(1)和/或(2)的化合物及其藥物學(xué)可接受的衍生物和鹽。

在另外或可選的實(shí)施方案中提供用于治療或預(yù)防呼吸病癥的方法，所述呼吸病癥包括在含人類在內(nèi)的動(dòng)物中的病毒性/細(xì)菌性感染后、急性/慢性支氣管炎、copd、囊性纖維化和炎癥，所述方法包括施用有效量的式(1)和/或(2)的化合物。

在另外或可選的方面還提供式(1)和/或(2)的化合物在制造用于治療呼吸病癥的藥物中的用途，所述呼吸病癥包括在含人類在內(nèi)的動(dòng)物中的病毒性/細(xì)菌性感染后、急性/慢性支氣管炎、copd、囊性纖維化和炎癥。

在治療中需要使用的式(1)和/或(2)的化合物的量將隨著給藥途徑、待治療的病癥的性質(zhì)以及動(dòng)物(包括人類患者)的年齡和情況而變化，并將最終由護(hù)理獸醫(yī)或醫(yī)師裁量。

通常適宜的劑量將在每天約0.1mg至500mg/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.1mg至50mg/kg/天的范圍內(nèi)。

通常，口服劑量可為1mg/kg/天至500mg/kg/天，注射劑量可為1mg/kg/天至100mg/kg/天。吸入劑量可為0.01mg/kg/天至5mg/kg/天。優(yōu)選地，對于口服或注射給藥劑量可為5mg至50mg/kg，每天兩到三次持續(xù)5至10天；對于吸入劑量可為0.1至0.5mg/kg，每天一至五次持續(xù)5至10天的時(shí)間。

優(yōu)選在咳嗽或相關(guān)的病癥出現(xiàn)的同時(shí)或之后開始治療，并繼續(xù)治療直至咳嗽或相關(guān)的病癥結(jié)束。適宜的治療是每天給予1至4次并繼續(xù)治療3至30天。

所需的劑量可以表現(xiàn)為單劑量或作為以適當(dāng)?shù)拈g隔(例如，每天兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或以上亞劑量(subdoses))給藥的分劑量(divideddoses)。

式(1)和/或(2)的化合物以單位劑型(例如每單位劑型包含0.1至500mg活性成分)方便地給藥。作為本文所使用的術(shù)語“單位劑量”不僅包括單獨(dú)包裝的單位劑量例如瓶，還包括從瓶中分配入注射器的可分量(aliquot)和包含于輸注容器中用于輸注的組合物。

雖然可能將式(1)和/或(2)的化合物作為原料化學(xué)品給藥用于治療，但優(yōu)選作為藥物學(xué)配方的活性成分呈現(xiàn)。

因此本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物學(xué)配方，其包含與一種或多種其藥物學(xué)可接受載體一起的式(1)和/或(2)的化合物或其藥物學(xué)可接受的衍生物以及任選的其它治療和/或預(yù)防成分。所述載體必須在與配方其它成分兼容并且不損害其受體的意義上而言是“可接受的”。

藥物學(xué)配方包括適于口腔、直腸、鼻或胃腸外(包括肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))給藥的那些，或以適于給藥到胃腸道的形式，或以適于給藥到呼吸道(包括鼻道)如通過吸入或吹入(insufflation)或用于皮內(nèi)或皮下移植或用于透皮貼劑(transdermalpatch)的形式的那些。配方在適當(dāng)?shù)那闆r下可方便地以離散的劑量單位呈現(xiàn)，并可通過在藥劑領(lǐng)域眾所周知的任何方法來制備。所有的方法包括引入活性化合物與液體載體或細(xì)分散的固體載體或兩者聯(lián)合，然后如有必要將產(chǎn)品成形為所需的配方的步驟。

適于口服的藥物學(xué)配方可呈現(xiàn)為各自包含預(yù)定量活性成分的離散單位例如膠囊劑、扁囊劑(cachet)或片劑；呈現(xiàn)為粉劑或顆粒劑；呈現(xiàn)為溶液、懸浮液或呈現(xiàn)為乳濁液。活性成分還可呈現(xiàn)為丸劑、膏劑或糊劑?？诜闷瑒┖湍z囊劑可包含常規(guī)的賦形劑例如粘合劑、填料、滑潤劑、崩解劑或潤濕劑。片劑可以是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)眾所周知的方法涂布的?？诜后w制劑可以是例如油水懸浮液(aqueousofoilysuspension)、溶液、乳濁液、糖漿或酏劑的形式，或者可以呈現(xiàn)為在使用前用水或其它適當(dāng)載體構(gòu)造(constitution)的干燥產(chǎn)品。這樣的液體制劑可包含常規(guī)添加劑例如懸浮液、乳化劑、非水載體(其可包含食用油)或防腐劑。

式(1)和/或(2)的化合物還可配制為腸胃外給藥(例如，通過注射，如團(tuán)注(bolusinjection)或連續(xù)輸注)并可以呈現(xiàn)為安瓿(ampoule)、預(yù)填充注射器(pre-filledsyringes)、小體積輸注(smallvolumeinfusion)的單位劑量形式或者呈現(xiàn)為具有增加的防腐劑的多劑量容器。組合物可采用像懸浮液、溶液或在油或水載體中的乳濁液這樣的形式，并可包含配方試劑例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x地，活性成分可以是通過滅菌固體的無菌分離物或者通過溶液的冷凍干燥獲得的，在使用前用適當(dāng)載體(如滅菌的、無致熱原的水)構(gòu)造的粉末形式。

對于直腸給藥，優(yōu)選其中載體為固體的單位劑量栓塞劑。適當(dāng)?shù)妮d體包括可可油及本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的其它材料，并且栓塞劑可以由活性化合物與軟化的或熔融的載體混合隨后通過冷卻和在模型內(nèi)成形而方便地形成。

對于向呼吸道的給藥(包括鼻內(nèi)給藥)，式(1)和/或(2)的化合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)為給藥至呼吸道所采用的任何方法和配方來給藥。

因此通常式(1)和/或(2)的化合物可以以溶液或懸浮液或作為干粉的形式給藥。

溶液和懸浮液將優(yōu)選為水性的，例如單獨(dú)由水(例如無菌或無致熱原的水)或水與生理學(xué)可接受的助溶劑(例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇如peg400)制備。

這樣的溶液或懸浮液可額外地包含其它賦形劑例如防腐劑(例如苯扎氯銨)、增溶劑/表面活性劑例如聚山梨酸酯(例如，吐溫80、司盤80、苯扎氯銨)、緩沖液、等滲性調(diào)節(jié)劑(例如氯化鈉)、吸收促進(jìn)劑和增稠劑(viscosityenhancer)。懸浮液可額外地包含懸浮劑(例如微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉)。

溶液或懸浮液通過常規(guī)方法，例如用滴管、移液管或噴霧器直接應(yīng)用到鼻腔。可以以單劑量或多劑量形式提供配方。在后一種情況中，希望提供劑量測量方法。在滴管或移液管的情況中，這可通過患者施用適當(dāng)?shù)?、預(yù)定體積的溶液或懸浮液來實(shí)現(xiàn)。在噴霧器的情況中，這可借助例如測量霧化噴霧泵來實(shí)現(xiàn)。

氣霧劑配方也可用于呼吸道給藥，其中式(1)和/或(2)的化合物可以在具有適當(dāng)推進(jìn)劑(propellant)的加壓包裝內(nèi)提供，所述推進(jìn)劑例如含氯氟烴(cfc)如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當(dāng)氣體。氣霧劑還可方便地包含表面活性劑例如卵磷脂。藥物的劑量可以通過規(guī)定量閥來控制。

任選地，式(1)和/或(2)的化合物可以以干粉的形式提供，例如在適當(dāng)粉末基質(zhì)例如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羥基丙甲基纖維素和聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)中的化合物的粉末混合物的形式。方便地，粉末載體將在鼻腔內(nèi)形成凝膠。粉末組合物可以以例如膠囊劑或例如明膠或泡罩包裝的藥筒(cartridge)(由其粉末可借助吸入器(inhaler)給藥)的單位劑量的形式呈現(xiàn)。

在用來向呼吸道給藥的配方、包括鼻內(nèi)配方中，化合物將通常具有例如約5微米以下的小粒徑。這樣的粒徑可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法如通過微粉化(micronisation)而獲得。

當(dāng)需要時(shí)，可以采用適于給出活性成分持續(xù)釋放的配方。

式(1)和/或(2)的化合物還可以與其它治療劑，例如抗感染劑如抗生素、抗病毒劑以及用于治療呼吸病癥的藥劑組合使用。因此在另外的方面本發(fā)明提供與另外的治療活性劑一起的包含式(1)和/或(2)的化合物或其藥物學(xué)可接受的衍生物的組合。

可方便地呈現(xiàn)上述組合以便以藥物學(xué)配方的形式使用，并因此使該包含與藥物學(xué)可接受載體一起的如上述所定義的組合的配方由此構(gòu)成本發(fā)明的另外方面。

此類組合的單個(gè)組分可以以分離或組合的藥物學(xué)配方或者依次或者同時(shí)給藥。

當(dāng)與治療中有活性的第二種治療劑一起使用式(1)和/或(2)的化合物時(shí)，各化合物的劑量可以與當(dāng)單獨(dú)使用各化合物時(shí)所采用的劑量相同或不同。適當(dāng)?shù)膭┝繉⒁子诒槐绢I(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所理解。

式(1)和/或(2)的化合物及其藥物學(xué)可接受的衍生物可通過本領(lǐng)域內(nèi)用于制備相似結(jié)構(gòu)的化合物的任何已知方法來制備。

在本發(fā)明的另外方面，提供篩選用于治療呼吸病癥的化合物的方法，所述方法包括：

用試驗(yàn)化合物處理在細(xì)胞表面上具有降低的唾液酸糖綴合物的細(xì)胞；和

在所述試驗(yàn)化合物暴露于所述細(xì)胞后測量所述細(xì)胞活力的恢復(fù)。

基于本發(fā)明，可將其它化合物用于促進(jìn)呼吸細(xì)胞表面上唾液酸糖綴合物的修復(fù)；或用于通過其加速唾液酸糖綴合物生物合成的能力來促進(jìn)細(xì)胞活力的恢復(fù)。因此，以細(xì)胞表面上唾液酸糖綴合物的修復(fù)為條件，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞修復(fù)至用于正常生物學(xué)功能的更好狀態(tài)以應(yīng)答可影響呼吸表面從而導(dǎo)致呼吸病癥的因子。

該方法包括獲得細(xì)胞，優(yōu)選呼吸細(xì)胞，所述細(xì)胞在表面上具有降低的唾液酸糖綴合物。該細(xì)胞稱為“裸細(xì)胞”，該細(xì)胞對可影響其正常行使功能的能力的因子敏感。

所述細(xì)胞可通過用神經(jīng)氨酸苷酶處理正常細(xì)胞如呼吸細(xì)胞以從細(xì)胞表面上的唾液酸糖綴合物除去唾液酸來得到。然后通過試驗(yàn)化合物修復(fù)表面上的唾液酸糖綴合物的能力來測量該細(xì)胞。試驗(yàn)化合物可通過加速唾液酸糖綴合物的生物合成或通過導(dǎo)致細(xì)胞表面上唾液酸糖綴合物修復(fù)的其它方式來修復(fù)唾液酸糖綴合物。

細(xì)胞表面上唾液酸糖綴合物的修復(fù)能力可通過細(xì)胞活力的修復(fù)來測量。細(xì)胞的活力可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員(skilledaddressee)可用的任何方法測量。然而，其可通過細(xì)胞增殖的細(xì)胞能力來測定。這可通過利用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞增殖試劑盒例如但不限于細(xì)胞增殖elisa試劑盒來測量摻入復(fù)制細(xì)胞的新合成dna的brdu或通過利用[³h]-胸腺嘧啶核苷類細(xì)胞增殖分析來測量。

該能力也可通過測定由于細(xì)胞暴露于試驗(yàn)化合物而在細(xì)胞上修復(fù)的唾液酸糖綴合物的數(shù)量來測量。這可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的方法，例如但不限于使用抗唾液酸糖綴合物的抗體來測量。

在另一實(shí)施方案中，還提供治療或預(yù)防受試者中的呼吸病癥的方法，所述方法包括向受試者施用通過所述篩選方法鑒定的至少一種化合物的步驟。

最后，除了具體描述的那些之外，如上所述的本發(fā)明可容許改變、修改和/或添加，并且應(yīng)理解本發(fā)明包括可能進(jìn)行的所有此類改變、修改和/或添加，應(yīng)理解各種其它修改和/或添加將落入如上所述的說明書的范圍內(nèi)。以下實(shí)施例僅用于示例性目的，并且不應(yīng)解釋為本發(fā)明的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例中使用的一般方法

·在brukeravance300上、dpx300a上的xwin-nmr3.5版記錄nmr。

·在massspectrometermicromasszmd上使用esi(電噴射離子化探針)記錄ms。使用watermasslynxnt軟件運(yùn)行系統(tǒng)。

·在硅膠60f245(e.merck)上進(jìn)行快速柱層析(flashcolumnchromatography)。

·在硅膠預(yù)涂布板(e.merck)上進(jìn)行薄層色譜(tlc)。

·在watersalliance2690分離模塊上運(yùn)行hplc，通過waters雙波長2487uv檢測器檢測，軟件為watersmillenium32。

·細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力分析

·方法1

所用細(xì)胞：小氣道上皮細(xì)胞(saec)

培養(yǎng)基：sagmbullet試劑盒(sabm+生長添加劑)

和/或

所用細(xì)胞：正常人支氣管上皮細(xì)胞(nhbe)

培養(yǎng)基：begmbullet試劑盒(bebm+生長添加劑)

實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)：

融化冷藏的細(xì)胞(1ml中1×l0⁶個(gè)細(xì)胞)并在175cm²皮氏培養(yǎng)皿(petri-dish)中的完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)。次日除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。培養(yǎng)細(xì)胞約5-6天以得到70-80％融合。在生長期，每隔一天更換培養(yǎng)基。

當(dāng)?shù)玫竭m當(dāng)?shù)娜诤蠒r(shí)，除去培養(yǎng)基。用1×pbs清洗單層細(xì)胞。除去pbs之后，添加2ml胰蛋白酶+edta。在室溫下輕輕地?fù)u動(dòng)細(xì)胞2分鐘。用1×pbs收集細(xì)胞，在200g下離心10分鐘。重懸沉淀至5×10⁴/ml。在96孔板中，以l00μl/孔(約5000個(gè)細(xì)胞/孔)等分細(xì)胞。將細(xì)胞于37℃下孵育24小時(shí)。

將10μl細(xì)菌神經(jīng)氨酸苷酶(來自產(chǎn)氣莢膜梭菌)添加到各孔至對于saec為終濃度為0.0lu/ml和對于nhbe為0.008u/ml。然后將細(xì)胞于37℃下孵育6小時(shí)。

在1000rpm下進(jìn)行板的離心10分鐘，吸出培養(yǎng)基并添加200μl新鮮培養(yǎng)基。再次離心板，用100μl新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

試驗(yàn)用化合物配制成6×所需濃度；將20μl化合物分三次添加到各孔中。然后將細(xì)胞于37℃下孵育24小時(shí)。

37℃下用10μlbrdu標(biāo)簽(細(xì)胞增殖elisa試劑盒-roche)標(biāo)記細(xì)胞過夜(約16小時(shí))。

除去標(biāo)記培養(yǎng)基并固定細(xì)胞，并用制造商提供的固定液(fixingsolution)在室溫下變性30分鐘。

除去固定液后，將100μl抗brdu-pod(根據(jù)制造商的建議在適當(dāng)濃度下)添加到各孔。在室溫下孵育板90分鐘。

除去抗體偶聯(lián)物，并用200μl洗滌液(提供的)洗滌孔三次。除去洗滌液后，添加100μl底物溶液(提供的)；并在室溫下孵育30分鐘。添加50μl1mh2so4來終止反應(yīng)。在450nm下(690nm的參考波長)測量樣品的吸光度。

用0.01u/ml來自產(chǎn)氣莢膜梭菌的神經(jīng)氨酸苷酶(na)處理的小氣道上皮細(xì)胞(saec)。

用0.008u/ml來自產(chǎn)氣莢膜梭菌的神經(jīng)氨酸苷酶(na)處理的正常人支氣管上皮細(xì)胞(nhbe)。

細(xì)胞活力分析通常給出±10％的運(yùn)算偏差。因此，僅將細(xì)胞活力相對于對照(用神經(jīng)氨酸苷酶處理)的細(xì)胞活力顯示≥120％的結(jié)果認(rèn)定為顯著。其表明具有陽性結(jié)果的化合物可以在48小時(shí)內(nèi)修復(fù)細(xì)胞活力。在式(1)和/或(2)的化合物中，具有低細(xì)胞毒性的最具活性的化合物為n-乙酰甘露糖胺(化合物1)和n-乙酰神經(jīng)氨酸(化合物2)。

·方法2

所用細(xì)胞：小氣道上皮細(xì)胞(saec)

培養(yǎng)基：sagmbullet試劑盒(sabm+生長添加劑)

和/或

所用細(xì)胞：正常人支氣管上皮細(xì)胞(nhbe)

培養(yǎng)基：begmbullet試劑盒(bebm+生長添加劑)

實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)：

融化冷藏的細(xì)胞(1ml中1×l0⁶個(gè)細(xì)胞)并在175cm²皮氏培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)。次日除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基替換。培養(yǎng)細(xì)胞約5-6天以得到70-80％融合。在生長期，每隔一天更換培養(yǎng)基。

當(dāng)?shù)玫竭m當(dāng)?shù)娜诤蠒r(shí)，除去培養(yǎng)基。用1×pbs清洗單層細(xì)胞。除去pbs之后，添加2ml胰蛋白酶+edta。在室溫下輕輕地?fù)u動(dòng)細(xì)胞2分鐘。用1×pbs收集細(xì)胞，在200g下離心10分鐘。重懸沉淀至5×10⁴/ml。在96孔板中，以l00μl/孔(約5000個(gè)細(xì)胞/孔)等分細(xì)胞。將細(xì)胞于37℃下孵育24小時(shí)。

將10μl病毒神經(jīng)氨酸苷酶(來自流感病毒nws/g70c)添加到各孔至終濃度0.017μg/ml。然后將細(xì)胞于37℃下孵育6小時(shí)。

在1000rpm下進(jìn)行板的離心10分鐘，吸出培養(yǎng)基并添加200μl新鮮培養(yǎng)基。再次離心板，用100μl新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

試驗(yàn)用化合物配制成6×所需濃度；將20μl化合物分三次添加到各孔中。然后將細(xì)胞于37℃下孵育24小時(shí)。

37℃下用10μlbrdu標(biāo)簽(細(xì)胞增殖elisa試劑盒-roche)標(biāo)記細(xì)胞過夜(約16小時(shí))。

除去標(biāo)記培養(yǎng)基并固定細(xì)胞，并用制造商提供的固定液在室溫下變性30分鐘。

除去固定液后，將100μl抗brdu-pod(根據(jù)制造商的建議在適當(dāng)濃度下)添加到各孔。在室溫下孵育板90分鐘。

除去抗體偶聯(lián)物，并用200μl洗滌液(提供的)洗滌孔三次。除去洗滌液后，添加100μl底物溶液(提供的)并在室溫下孵育30分鐘。添加50μl1mh2so4終止反應(yīng)。在450nm下(690nm的參考波長)測量樣品的吸光度。

實(shí)施例1.n-乙酰-d-甘露糖胺(1)的制備。

[化合物(1)，式(1)，b＝h，a＝nhcoch3,r¹＝r²＝r³＝r⁴＝h]

將1g通過水解殼多糖獲得的n-乙酰-d-葡糖胺溶解于3ml水中，然后通過使用30％的naoh溶液調(diào)節(jié)至ph>11。使混合物于20℃～40℃下靜置48小時(shí)。用5nh2so4將所得溶液中和至ph6.5～7.0，然后在減壓下蒸發(fā)至干燥。在乙醇中回流固體10分鐘，冷卻至室溫，并過濾。真空蒸發(fā)濾液至干燥以提供白色固體，通過¹h-nmr測定，該白色固體包含85％的n-乙酰-d-甘露糖胺和15％的n-乙酰-d-葡糖胺。由乙醇/異丙醇/ea分步重結(jié)晶(fractionallyrecrystallized)該固體以提供作為白色固體的標(biāo)題化合物(125mg，62.5％，基于n-乙酰-d-甘露糖胺的20％轉(zhuǎn)化率)。未反應(yīng)的n-乙酰-d-葡糖胺(0.8g)可再次用于下一批反應(yīng)。

¹h-nmr(d2o)δ(ppm)

5.15(d,0.7h),3.85～3.32(m,6.3h),1.99(s,3h)

ms222(m+1)

實(shí)施例2.n-乙酰-神經(jīng)氨酸鈉鹽(2)的制備。

[化合物(2)，式(2)，r⁸＝r¹⁰＝r¹¹＝r¹²＝r¹³＝h,r⁹＝na]

向n-乙酰甘露糖胺(2.7g，12.2毫摩爾)和丙酮酸鈉(2.7g，24.5毫摩爾)在水(15ml)中的ph7.0～7.5的溶液中添加透析袋(截留mw20,000)，所述透析袋包含在反應(yīng)混合物中的n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶[ec4.1.3.3](25單位)，所述反應(yīng)混合物為ph7.0-7.5下的在水(3ml)中的n-乙酰甘露糖胺(0.54g)和丙酮酸鈉(0.54g)的反應(yīng)混合物。在60r.p.m.30℃下震蕩反應(yīng)混合物5天。除去酶袋(enzymebag)并再次用于新一批反應(yīng)。用水(15ml)稀釋反應(yīng)混合物，然后通過amberliteira-400(hcoo^-形式)的柱(150ml)。然后用水(300ml)洗滌、用0.5mhcooh溶液洗脫樹脂。收集洗脫液并真空蒸發(fā)至干燥。將殘余物溶解于水中(2ml)，然后用冰醋酸(10ml)在4℃稀釋過液，過濾晶體，用etoh洗滌，干燥以提供作為白色晶體粉末的n-乙酰神經(jīng)氨酸(1.5g，39.8％)。

¹h-nmr(d2o)δ(ppm)

4.00(m,1h)、3.97(m,1h)、3.87(d,1h)、3.77(dd,1h)、3.67(m,1h)、3.55(dd,1h)、3.48(d,1h)、2.24(dd,1h,j＝13.2hz,5.1hz)、1.98(s,3h)、1.83(dd,1h,j＝13.2hz,11.5hz)。

ms310(m+1)

n-乙酰神經(jīng)氨酸(1g,3.23mmol)溶解于水(20ml)中，然后與nahco3(0.26g、3.09mmol，至ph6～6.5)攪拌，凍干后以提供作為白色粉末的標(biāo)題產(chǎn)物(1.05g、98％)。

實(shí)施例3.n-乙酰-神經(jīng)氨酸乙酯(ethyln-acetyl-neuraminate)(3)的制備。

向n-乙酰-神經(jīng)氨酸(1g，3.23毫摩爾)的無水乙醇(75ml)懸浮液中添加1.5ml乙酰氯。密封混合物并在室溫下攪拌16小時(shí)以形成清液。將所得溶解真空蒸發(fā)至干燥。用乙酸乙酯洗滌白色固體并真空干燥以提供作為白色固體的標(biāo)題化合物(1g，91.7％)。

¹h-nmr(d2o)(ppm)

4.27(q,2h)、4.04(m,2h)、3.91(d,1h)、3.78(dd,1h)、3.68(dd,1h)、3.57(dd,1h)、3.52(d,1h)、2.28(dd,1h)、2.01(s,3h)、1.88(dd,1h)、1.28(t,3h)。

ms338(m+1)、360(m+23)

實(shí)施例4.5-乙酰胺基-4,7,8,9,-四鄰乙?；?3,5-雙脫氧-β-d-丙三氧基-d-半乳-2-壬酮吡喃糖酸乙酯(ethyl5-acetamido-4,7,8,9,-tetra-o-acetyl-3,5-dideoxy-β-d-glycero-d-galacto-2-nonulopyranosonate)(5-乙酰胺基-4,7,8,9-四鄰乙?；?神經(jīng)氨酸乙酯)(4)的制備。

在40℃向醋酸酐(aceticanhydrade)和60％高氯酸的水溶液(aqueous60％perchloricacid)(5μl)的搖動(dòng)溶液中，在30分鐘以上分步(inportion)添加5-乙酰胺基-神經(jīng)氨酸乙酯(230mg，0.68mmol)。40℃下攪拌所得混合物2小時(shí)。然后將其冷卻至室溫，用冷水(10ml)稀釋，用硫酸銨飽和，用乙酸乙酯(40ml×3)萃取。合并有機(jī)萃取物并相繼用飽和的nahco3溶液和水洗滌。經(jīng)mgso4干燥有機(jī)層，并真空蒸發(fā)至干燥。在乙酸乙酯中溶解殘余物，用己烷稀釋以給出作為白色晶體的標(biāo)題化合物(223mg，65％)。

¹h-nmr(cdcl3)δ(ppm)

5.71(m,1h)、5.36(dd,1h,j＝1.5hz,5.6hz)、5.25(ddd,1h,j＝2.4hz,7.5hz)、5.22(ddd,1h,j＝11.4hz,5.4hz,9.5hz)、4.51(dd,1h,j＝12.4hz)、4.47(d,1h,j＝0.8hz)、4.21～4.13(m,4h)、4.03(dd,1h)、2.26(ddd,1h,12.8hz)、2.19(dd,1h)、2.15、2.11、2.03、2.02和1.91(5s,15h)、1.29(t,3h,j＝7.2hz)。

ms506(m+1)

實(shí)施例5.胞嘧啶核苷-5’-單磷酸-5-乙酰胺基-3,5,-雙脫氧-β-d-丙三氧基-d-半乳-2-壬酮吡喃糖酸(cmp-唾液酸)(5)的制備。

將n-乙酰神經(jīng)氨酸(100mg，0.32毫摩爾)和胞嘧啶核苷-5’三磷酸鈉鹽(156.3mg，0.32毫摩爾)溶解于包含mgcl2(20mm)的32mltris-hcl緩沖液(100mm，ph8.8)中。向該溶液中添加cmp-neu5ac合成酶(5mg，來自腦膜炎奈瑟菌(n.meningitidis))。在37℃下孵育反應(yīng)混合物2～3小時(shí)。同時(shí)通過tlc(硅膠，etoh:1mnh4hco3＝7:3)監(jiān)測。用甲醇(50ml)稀釋反應(yīng)混合物并過濾掉。在減壓下蒸發(fā)濾液至干燥。在biogelp-2樹脂(50ml)上層析殘余物以提供凍干后作為白色晶體粉末的標(biāo)題化合物(147mg，75％)。

hplc分析：

·c-18柱

·移動(dòng)相：緩沖液a(0.1m磷酸鉀緩沖液。補(bǔ)充有8mm四丁基硫酸氫銨，ph5.3)和緩沖液b(70％緩沖液a加30％甲醇，ph5.9)

·梯度條件：

100％緩沖液a2.5分鐘，0～40％緩沖液b7.5分鐘，40～100％緩沖液b1分鐘，100％緩沖液b4分鐘，100～0％緩沖液b1分鐘，隨后100％緩沖液a的平衡相4分鐘。

·流速：1ml/分鐘。

·270nm下u.v檢測

¹h-nmr(d2o)δ(ppm)

7.87(d,1h,j＝7.6hz)、6.25(d,1h,j＝7.6hz)、5.91(d,1h,j＝4.4hz)、4.26～4.20(m,2h)、4.17～4.10(m,3h)、4.09～3.98(m,2h)、3.90～3.80(m,3h)、3.59～3.40(m,2h)、2.42(dd,1h,j＝4.8,13.2hz)、1.98(s,3h)、1.60(dt,1h,j＝5.6,12.6hz)。

ms635(m^2-+na⁺)

實(shí)施例6.5-乙酰胺基-8,9-鄰異亞丙基-神經(jīng)氨酸乙酯(6)的制備。

向5-乙酰胺基-神經(jīng)氨酸乙酯(150mg，0.445毫摩爾)的無水dmf(2ml)溶液中添加2,2-二甲氧基丙烷(1ml，8毫摩爾)和amberlyst15(50mg)。在60℃下攪拌混合物7小時(shí)，然后冷卻至室溫并過濾。在減壓下蒸發(fā)濾液至干燥。tlc(硅膠，ea/meoh＝10:4)指示反應(yīng)完成。殘余物復(fù)溶于ea/meoh＝10/1(1ml)中，然后快速柱層析。合并所需組分并真空蒸發(fā)至干燥以提供作為白色形式的標(biāo)題化合物(135mg，75％)。

¹h-nmr(d2o)δ(ppm)

4.28～4.23(m,2h)、4.23～4.11(m,2h)、4.08～3.92(m,2h)、3.96～3.52(m,3h)、2.31(dd,1/3h)、2.23(dd,2/3h)、1.99(s,3h)、1.82(dd,2/3h)、1.70(dd,1/3h)、1.36(s,3h)、1.32(s,3h)、1.25(t,3h)。

ms428(m+na)

實(shí)施例7：化合物(1)對小氣道上皮細(xì)胞(saec)活力恢復(fù)的活性

化合物(1)[式(1)，b＝h，a＝nhcoch3，r¹＝r²＝r³＝r⁴＝h]

實(shí)施例8:化合物(1)對正常人支氣管/氣管上皮細(xì)胞(nhbe)活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例9.化合物(2)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(2)[式(2)，r⁸＝r¹⁰＝r¹¹＝r¹²＝r¹³＝h，r⁹＝na]

實(shí)施例10:化合物(2)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例11.化合物(3)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(3)[式(2)，r⁸＝r¹⁰＝r¹¹＝r¹²＝r¹³＝h，r⁹＝c2h5]

實(shí)施例12:化合物(3)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例13:化合物(4)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(4)[式(2)，r⁸＝h，r⁹＝c2h5，r¹⁰＝r¹¹＝r¹²＝r¹³＝ch3co]

實(shí)施例14:化合物(4)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例15:化合物(5)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(5)[式(2)，r⁸＝胞嘧啶核苷單磷酸，r⁹＝r¹⁰＝r¹¹＝r¹²＝r¹³＝h]

實(shí)施例16:化合物(5)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例17:化合物(6)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(6)[式(2)，r⁸＝h，r⁹＝c2h5，r¹⁰＝r¹¹＝h，r¹²和r¹³＝>c(ch3)2]

實(shí)施例18.化合物(6)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例19:化合物(7)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(7)[式(1)，b＝h，a＝nhcoch3，r¹＝r²＝r³＝r⁴＝coch3]

實(shí)施例20:化合物(7)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例21.化合物(8)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(8)[式(1)，b＝h，a＝nhcoch3，r¹＝h，r²＝r³＝r⁴＝coch3]

實(shí)施例22:化合物(8)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例23:化合物(9)對saec活力恢復(fù)的活性

化合物(9)[式(1)，a＝h，b＝nhcoch3，r¹＝r²＝r³＝r⁴＝h]

實(shí)施例24.化合物(9)對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例25.d-葡萄糖對saec活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例26:d-葡萄糖對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例27.化合物(1)在高濃度下對saec活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例28:化合物(1)在高濃度下對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例29:化合物(2)在高濃度下對saec活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例30:化合物(2)在高濃度下對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例31:化合物(9)在高濃度下對saec活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例32:化合物(9)在高濃度下對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例33:化合物(1)(85％)和化合物(9)(15％)的混合物在高濃度下對saec活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例34:化合物(1)(85％)和化合物(9)(15％)的混合物在高濃度下對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例35:化合物(1)(85％)和化合物(9)(15％)的混合物對saec活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例36.化合物(1)(85％)和化合物(9)(15％)的混合物對nhbe活力恢復(fù)的活性

實(shí)施例37.豚鼠的咳嗽實(shí)驗(yàn)^[9][10]

雄性豚鼠圈養(yǎng)于圍欄內(nèi)并可以利用水和食物自由采食(adlibitum)。該研究經(jīng)bio21研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)(bio21instituteanimalethicscommittee)批準(zhǔn)。

將24只神志清醒的雄性hartley豚鼠(500～550g)分成a、b、c三組(對于每組8只動(dòng)物)，并在第一天經(jīng)氣霧劑用5單位/ml的神經(jīng)氨酸苷酶(sigman2133，凍干粉，x型，150～400單位/mg蛋白質(zhì))的水溶液(b組和c組)或僅用鹽水(a組)預(yù)處理5分鐘。然后，在第一、第二和第三天，豚鼠或者口服500mg/kg化合物(1)(c組)或者僅口服水(a組和b組)。在第四天，用0.5m檸檬酸溶液(霧化，暴露10分鐘)處理(challenge)所有動(dòng)物。然后在15分鐘的時(shí)間內(nèi)記錄咳嗽頻率、到第一、第二和第三次咳嗽的時(shí)間，以及到第一次擦鼻子(noserubs)的時(shí)間。結(jié)果表明化合物(1)有助于修復(fù)由神經(jīng)氨酸苷酶引起的損傷的傾向。

通過相同的實(shí)驗(yàn)方案利用化合物(2)代替化合物(1)，得到相似的結(jié)果。

在本申請的基礎(chǔ)上或要求其優(yōu)先權(quán)可以提出進(jìn)一步的專利申請。應(yīng)理解，僅經(jīng)由實(shí)施例提供以下權(quán)利要求，并不意于限制在任何此類進(jìn)一步的申請中可能要求保護(hù)的范圍。日后可以向權(quán)利要求添加或從其中刪除特征以便進(jìn)一步限定或重新限定一個(gè)或多個(gè)發(fā)明。

最后，應(yīng)理解，在不違背本文概述的本發(fā)明精髓的情況下，可以進(jìn)行各種其它修改和/或改變。

參考文獻(xiàn)

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[3]schauer,r.等人，biochemistryandroleofsialicacids.in:biologyofthesialicacids.a.rosenberg,ed.newyork,usa.pp7～67(1995).

[4]rens-domiano,s.和reisine,t.structuralanalysisandfunctionalroleofthecarbohydratecomponentofsomatostatinreceptors.j.biol.chem.266,20094～20102(1991).

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[6]miyata,t.等人，archivesinternationalesdepharmacodynamieetdetherapie,296,202～9(1988).

[7]miyata,t.等人，archivesinternationalesdepharmacodynamieetdetherapie,304,277～89(1990).

[8]amir,s.m.等人，nature,211(5052),976～7(1966).

[8b]b.galeano等人，mutationinthekeyenzymeofsialicacidbiosynthesiscausessevereglomerularproteinuriaandisrescuedbyn-acetylmannosamine.j.clin.invest.2007117(6)1585～1594.

[8c]2007年5月31日提交的美國臨時(shí)專利申請60/932,451

[9]laude,e.a.等人，“acomparativestudyoftheeffectsofcitricacid,capsaicinandresiniferatoxinonthecoughchallengeinguinea-pigandman”.pulmonarypharmacology6,171～175(1993).

[10]tanaka,m.等人，“mechanismsofcapsaicin-andcitric-acid-inducedcoughreflexesinguineapig”.j.pharmacol.sci.,99,77～82(2005).