本發(fā)明專利涉及一種利用巨噬細胞培養(yǎng)液促進毛囊再生的方法，屬于皮膚毛發(fā)再生醫(yī)學技術(shù)領域。

背景技術(shù)：

毛囊在胚胎發(fā)育過程中形成，出生后經(jīng)歷增長（anagen），退行（catagen）和休止（telogen）的反復循環(huán)周期。在生長期，毛母細胞（matrix）迅速增殖，分化成毛干及毛囊內(nèi)根鞘,退行期毛囊的隆凸（bulge）部位以下結(jié)構(gòu)凋亡消失，毛乳頭（dermalpapilla,dp）向上移位，當毛發(fā)進入休止期后毛乳頭到達隆凸部位，直到下一個生長期后毛乳頭隨著新生成的毛囊胚芽（germ）向下移動。毛囊發(fā)育和周期性再生是錯綜復雜的分子調(diào)控過程，通過控制復雜的分子網(wǎng)絡，以及不同的信號通路，以達到促進毛囊生長因子和抑制毛囊生長因子的嚴格平衡，并傳遞信息到毛囊和周圍組織中，從而決定毛囊發(fā)育啟動或休止及毛囊細胞有絲分裂速率的調(diào)整。作為功能性微型器官，毛囊中存在多種多能干細胞，由于其易于觀察、分析和分離的優(yōu)點，毛囊干細胞已被當作理想的研究干細胞機制調(diào)控模型而被深入的研究。在過去的幾十年中，基因工程小鼠模型已被廣泛的用于研究毛囊形態(tài)發(fā)生并取得了顯著的進步，鑒定了很多調(diào)整毛囊發(fā)育的關鍵因子和信號通路；

正常脫落的頭發(fā)都是處于退行期及休止期的毛發(fā)，由于進入退行期與新進入生長期的毛發(fā)不斷處于動態(tài)平衡，故能維持正常數(shù)量的頭發(fā)。病理性脫發(fā)是指頭發(fā)異常或過度的脫落，其原因很多；巨噬細胞在機體創(chuàng)傷修復過程中有巨大作用，它能大量分泌多種生物活性物質(zhì)以及多種酶類物質(zhì)，其中生物活性物質(zhì)又稱巨噬細胞源性生物因子，包括多肽轉(zhuǎn)換生長因子、白細胞介素、腫瘤壞死因子、血小板衍生生長因子以及一氧化氮等；酶類物質(zhì)主要包括膠原酶、彈性蛋白酶、纖溶酶原激活劑等；這些生物活性物質(zhì)直接引導著機體修復的整體進程；

病理性異常頭發(fā)脫落，如男性的禿頂或女生的發(fā)際線后移，是在某些因素的作用下毛囊長期處于休止期而無法進入生長周期，目前，臨床上針對這種病理性脫發(fā)的藥物甚少，而且這些藥物也是只針對很少比例的患者有作用，不能滿足這些病理性異常頭發(fā)脫落患者的要求，給這些患者帶來精神痛苦和經(jīng)濟損失。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用巨噬細胞培養(yǎng)液促進毛囊再生的方法，用以

解決目前臨床針對病理性脫發(fā)中存在上述問題，特別是解決脫發(fā)或發(fā)際線后移的技術(shù)難題問題，減輕脫發(fā)或發(fā)際線后移患者的精神痛苦和經(jīng)濟負擔。

為解決其技術(shù)問題，本發(fā)明人在自己的工作中，利用自己掌握的理論知識，通過長期的研究、分析和多次實驗，最后找到一種利用巨噬細胞培養(yǎng)液促進毛囊再生的方法，從而完成本發(fā)明。所述方法的技術(shù)原理是：巨噬細胞培養(yǎng)液可以促進休止期的毛囊進入再生周期，原因在于巨噬細胞具有分泌多種生物活性物質(zhì)以及多種酶類物質(zhì)的特性，所述生物活性物質(zhì)以及多種酶類物質(zhì)中具有某些特定的活化因子可以促使休止期的毛囊進入正常的生長周期，從而達到促進毛發(fā)生長的最終目的；

本發(fā)明所述一種可以促進休止期的毛囊進入再生周期的方法，是通過皮下注射或皮膚表皮涂抹巨噬細胞培養(yǎng)液，通透皮吸收促進休止期的毛囊進入再生周期，具體方法包括如下步驟：

、備料：根據(jù)患者的需要，備齊所需巨噬細胞培養(yǎng)液及其緩釋劑或透皮吸收劑，其中：巨噬細胞培養(yǎng)液濃度為10ng/ml-200ug/ml；其中緩釋劑為膠原蛋白粉（可即邦醫(yī)用膠原蛋白，國械注準20143642302），透皮吸收劑為水溶性乳劑；

、制備注射制劑：將巨噬細胞培養(yǎng)液制備成為1:10-1:100的濃縮液；

、進行注射：每日注射２次，每次注射制劑的體積為10ul-1000ul，巨噬細胞培養(yǎng)液濃度為10ng/ml-200ug/ml,單個頭皮注射的次數(shù)為1-100次；

、巨噬細胞培養(yǎng)液還可以制備成為和其他緩釋劑或透皮吸收劑混合的制劑，形成液體，乳劑或噴霧劑的不同劑形，從而提高其吸收效率，其具體配比為：1:1-1:10（v:v）；

、本方法適用的毛發(fā)異常患者包括：雄激素性脫發(fā)、神經(jīng)性脫發(fā)、內(nèi)分泌脫發(fā)、營養(yǎng)性脫發(fā)、物理性脫發(fā)、化學性脫發(fā)、感染性脫發(fā)、癥狀性脫發(fā)、先天性脫發(fā)和季節(jié)性脫發(fā)的任意一種。

本發(fā)明專利有以下優(yōu)點：

1.該發(fā)明的所有成分全是人細胞來源，對人體無毒副作用；

2.通過皮下注射或透皮吸收給藥，可以保留皮膚正常結(jié)構(gòu)和功能，不會對其他組織器官產(chǎn)生傷害；

3.巨噬細胞可以大量在體外培養(yǎng)，可以獲得大量細胞培養(yǎng)液，所以該專利的實際使用成本較低。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本申請的實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例一：人外周血巨噬細胞的培養(yǎng)：

、主要試劑imdm、胎牛血清、人ab血清和tryple購自lifetechnology公司;人m-csf購自ebiosciences公司;primocin購自invivogen公司;人cd14正選試劑盒和人cd14抗體(clonemop9，apc標記)以及easysep專用磁極購自stemcelltechnol-ogies公司；

、采集健康成人新鮮外周抗凝血，用ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(pbmc)，用洗液(含2%fbs的pbs)洗滌，懸浮細胞并計數(shù)，pbmc可放在液氮長期保存，解凍后的pbmc可用dnaseⅰ室溫孵育15min后用30um的尼龍網(wǎng)過濾后重新計數(shù)，2.0×10⁸個pbmc用來cd14正選，加入200uleasysep抗體正選試劑盒，用移液器輕輕上下吹打均勻，室溫孵育15min，再加100uleasysep納米磁珠，充分混勻后室溫孵育10min，輕輕混勻后將試管放入專用磁極中靜止5min，將磁極連試管一起拿起，倒出上清部分。用洗液重新混勻后重復2次過程；

、流式細胞術(shù)分析單核細胞分離純度分別取分選前的pbmc、分選所得的cd11b+單核細胞以及分流柱流出的細胞各5×10⁵個細胞，加入2.5ul人cd11b-apc抗體(clonemop9)，用抗鼠igg單克隆抗體做同型對照，4℃避光孵育30min，洗滌后用洗液懸浮細胞，流式細胞儀檢測分選前后細胞cd14的表達情況，以同型對照的細胞作為對照，計算細胞的cd14陽性率；

、巨噬細胞的培養(yǎng)與形態(tài)學觀察配置含10%人ab血清和10ng/ml人m-csf的imdm培養(yǎng)液，加入8ml新鮮培養(yǎng)液于10cm的細胞培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中cd11b+單核細胞數(shù)為5×10⁶個細胞，于37℃，%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，培養(yǎng)期間不換液。在第１、３、６天時倒置顯微鏡觀察細胞的活力及形態(tài)，包括貼壁狀態(tài)，體積、形態(tài)、偽足的變化為培養(yǎng)液中人源巨噬細胞的分子特征為高表達cd1１６或f4/８０。

實施例二：巨噬細胞培養(yǎng)液促進鼠生休止期毛囊進入生長期的具體過程如下：

．將７－９周的小鼠用戊巴比妥鈉麻醉；

．用脫毛膏將小鼠背部的毛發(fā)去除干凈；

．將1/10濃縮的巨噬細胞培養(yǎng)液與matrixgel（基質(zhì)膠）1:1混合。然后將此混合液皮下注射到小鼠的背部；

.１５天后觀察兩組小鼠的毛發(fā)生長情況：小鼠皮下注射巨噬細胞后１５天，對照組區(qū)域沒有毛發(fā)進入生長期，而巨噬細胞培養(yǎng)液處理的部位已經(jīng)有毛發(fā)長出，即毛發(fā)進入生長期，本發(fā)明專利發(fā)明人發(fā)現(xiàn)巨噬細胞培養(yǎng)液劑處理的部位毛發(fā)生長很快，而對照組相應的區(qū)域沒有。

實施例三：分析巨噬細胞培養(yǎng)液處理的小鼠毛囊生長周期變化情況：

、分別取巨噬細胞培養(yǎng)液處理組和對照組的皮膚組織；

、經(jīng)過4%pfa固定和蔗糖脫水后進行組織切片；

、he染色染色顯示巨噬細胞培養(yǎng)液處理的部位，７天后毛囊進入生長期，而其他部位毛囊人處于休止期。

實施例四：透皮吸收乳劑的制作方法如下：

（1）儀器：馬頭牌jyt-1架盤藥物天平；fa2104a電子天平；hh-w600數(shù)顯三用恒溫水箱；

（2）試藥：水楊酸；白凡士林；羥苯乙脂（成都市科龍化工試劑廠分析純）；羧甲基纖維素鈉；丙三醇；十八醇；十二烷基硫酸鈉；単硬脂酸甘油酯；司盤40；液體石蠟；

（3）制作方法處方：巨噬細胞培養(yǎng)液濃縮液（1:10濃縮）：3ml，水楊酸0.5g，羥甲基纖維素鈉0.6g，甘油1.0g，羥苯乙酯0.05g，純化水5.4ml。制法：稱取羧甲基纖維素鈉0.506g置于研缽中，加入甘油研勻，然后邊研邊加入羥苯乙酯的乙醇溶液，待溶脹后研勻，即得水溶性基質(zhì)。取水楊酸置于軟膏板上或研缽中，分次加入制得的水溶性基質(zhì)研勻，制成10g水溶性乳劑。