本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域一個新型的腎細胞癌治療靶點，具體涉及阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路在腎細胞癌治療靶點中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腎細胞癌（renalcellcarcinoma，rcc）是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80％-90％，占成人惡性腫瘤的2％至3％。目前，外科手術(shù)（根治性腎切除手術(shù)和保留腎單位手術(shù)）是局限性腎癌的首選治療方法，可以達到完全治愈。對于局部進展性腎癌則以手術(shù)治療為主，術(shù)后輔助細胞因子或分子靶向治療的綜合治療。而轉(zhuǎn)移性腎癌尚無統(tǒng)一標準治療方案，研究表明分子靶向藥物可以顯著延長患者的生存期。2006年起，nccn和eau將分子靶向藥物（索拉菲尼、舒尼替尼、替西羅莫斯等）作為轉(zhuǎn)移性腎癌治療的一、二線臨床治療用藥。它們中的大多數(shù)屬于激酶抑制劑，通過抑制腫瘤血管的生長，達到抗腫瘤的作用，延長患者的生存期。但分子靶向藥物的毒副作用（手足皮膚反應(yīng)、乏力、白細胞減少、高血壓、貧血、口舌炎等）限制其在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，部分患者因此需要調(diào)整藥物劑量，甚至終止治療。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的腎細胞癌治療靶點并據(jù)此研發(fā)新型的分子靶向藥物，對于腎細胞癌的治療具有重要的臨床應(yīng)用價值。

類泛素化修飾neddylation是一種新型的蛋白翻譯后修飾方式，通過類泛素樣蛋白nedd8（neuralprecursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated8）特異性地與底物蛋白共價結(jié)合，調(diào)控多種蛋白復合體的結(jié)構(gòu)和功能，在細胞正常生理活動的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)中具有重要的調(diào)控作用。然而，neddylation修飾的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。所以靶向針對neddylation修飾信號通路有望成為新型的抗腫瘤靶點。neddylation修飾信號通路的關(guān)鍵酶主要包括nedd8活化酶e1、nedd8結(jié)合酶e2和nedd8連接酶e3。nedd8結(jié)合酶e2為高度保守的蛋白質(zhì)，目前研究僅發(fā)現(xiàn)有2種，分別是ube2m(ubiquitin-bindingenzymee2m,ubc12)和ube2f(ubiquitin-bindingenzymee2f)。然而，neddylation修飾以及nedd8結(jié)合酶e2是否能夠作為腎細胞癌治療靶點及作用機制仍未知。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種阻斷ube2m介導neddylation修飾在腎細胞癌治療中的應(yīng)用，為研發(fā)新型的分子靶向治療藥物，提供一種阻斷ube2m介導的neddylation修飾作為治療腎細胞癌的新靶點。本發(fā)明設(shè)計了sh-control、sh-ube2f和sh-ube2m等rna干擾相關(guān)質(zhì)粒，構(gòu)建穩(wěn)定敲低ube2m或者ube2f蛋白表達水平的腎癌細胞系，通過實驗發(fā)現(xiàn)敲低ube2m顯著抑制腎癌細胞的增殖。進一步通過neddylation修飾特異性小分子抑制劑mln4924對腎癌細胞的顯著殺傷作用,證明了阻斷ube2m介導的neddylation修飾在抑制腎癌細胞增殖活力上起著關(guān)鍵作用。因此，阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路是一種潛在的治療腎細胞癌的新型靶點，具有很強的臨床應(yīng)用價值。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路作為藥物靶點在制備抗腎細胞癌藥物中的應(yīng)用。

阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路作為藥物靶點在制備抑制腎細胞癌增殖試劑中的應(yīng)用。

通過靶向抑制ube2m的表達或功能，實現(xiàn)靶向抑制腎細胞癌的生長。

靶向抑制ube2m表達的方法為：通過慢病毒介導shrna轉(zhuǎn)入腎癌細胞中，敲低腎癌細胞內(nèi)ube2m的表達。

抑制劑選自靶向于ube2m蛋白編碼序列，且能夠抑制ube2m基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達的shrna。

所述的shrna序列為gcggatccagaaggacataaa。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過實驗證實了通過阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路可抑制腎癌細胞的增殖。進一步通過neddylation修飾特異性小分子抑制劑mln4924對腎癌細胞的顯著殺傷作用，證明了阻斷ube2m介導的neddylation修飾在抑制腎癌細胞增殖活力上起著關(guān)鍵作用。因此，阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路是一種潛在的治療腎細胞癌的新型靶點，具有很強的臨床應(yīng)用價值。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本發(fā)明的示意性實例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。

圖1為本發(fā)明的阻斷ube2m介導的neddylation修飾可顯著抑制腎癌細胞786-0的增殖。(a)構(gòu)建穩(wěn)定敲低ube2m或者ube2f蛋白表達水平的腎癌細胞786-0后，通過細胞計數(shù)的方法檢測腎癌細胞增殖(p<0.001)。(b)通過westernblot分析檢測敲低ube2m或ube2f情況。

圖2為本發(fā)明的mln4924顯著抑制腎癌細胞786-0的增殖(p<0.001)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明的詳細內(nèi)容及其具體實施方式，通過具體實驗來進一步驗證本發(fā)明。

參見圖1及圖2所示，本發(fā)明的目的是為研發(fā)新型的分子靶向治療藥物，提供一種阻斷ube2m介導的neddylation修飾作為治療腎細胞癌的新靶點。

第一方面，本發(fā)明提供了阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路作為藥物靶點在制備抗腎細胞癌藥物中的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明提供了阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路作為藥物靶點在制備抑制腎細胞癌的增殖試劑中的應(yīng)用。

所述的抑制劑選自靶向于ube2m蛋白編碼序列，且能夠抑制ube2m基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達的shrna。通過慢病毒介導shrna轉(zhuǎn)入腎癌細胞中，敲低腎癌細胞內(nèi)ube2m的表達，實現(xiàn)靶向抑制腎細胞癌的生長。所述的shrna序列為gcggatccagaaggacataaa。

實施例1：

阻斷ube2m介導的neddylation修飾可顯著抑制腎癌細胞786-0的增殖

分別將質(zhì)粒(sh-control、sh-ube2f和sh-ube2m)加入dh5α感受態(tài)中，冰上放置20分鐘后置于42℃加熱模塊中，熱激90秒。將熱激后的感受態(tài)置于冰上5分鐘。向感受態(tài)中加入500μl液體lb培養(yǎng)基，37℃下200rpm搖40分鐘。收集菌液300rcf離心5分鐘，棄去400μl上清。用剩余的菌液將沉淀重懸，均勻涂布在固體lb培養(yǎng)基中（含氨芐抗生素100μg/ml），倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中。24小時后挑取清晰的單菌落，加入至液體lb培養(yǎng)基中（含氨芐抗生素100μg/ml），37℃下200rpm搖24小時。24小時后收集菌液，提取質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒與prsv-rev、pmdlg/prre和pcmv-vsv-g以3:3:3:1的比例轉(zhuǎn)染至293t細胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），6小時后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后收獲含假病毒顆粒的上清液，1000rpm離心5分鐘，將收獲的上清液用0.45μm濾膜過濾。4℃條件下，在20%蔗糖中30000rpm超速離心2小時。將超離后的病毒沉淀用無菌pbs重懸。將4×10⁵個786-0細胞接種至6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃）。24小時后將細胞上清液棄去，加入混有相應(yīng)病毒的無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），6小時后補加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。感染48小時后，換為含有嘌呤霉素(4ug/ml)的培養(yǎng)基。觀察細胞死亡情況，將存活的細胞進行傳代。

分別將相應(yīng)穩(wěn)定腎癌細胞786-0(sh-control、sh-ube2f、sh-ube2m和sh-ube2f+sh-ube2m)以每孔2×10⁴個細胞接種至24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），在不同時間段應(yīng)用胰蛋白酶進行消化，收集細胞懸液并應(yīng)用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)。

通過westernblot分析進行分析。使用針對目標蛋白的一級抗體，包括actin（ab8227，abcam），ube2m（ab109507,abcam）和ube2f（ab185234，abcam）。二級抗體包括抗兔igg和抗小鼠igg（jacksonimmunoresearchlaboratories）。

實施例2：

mln4924顯著抑制腎癌細胞786-0的增殖

將腎癌細胞786-0以每孔2×10⁴個細胞接種于24孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：5％co2；溫度為37℃），待細胞貼壁后，應(yīng)用dmso或mln4924（0.5μm和1μm）進行處理，在不同時間段應(yīng)用胰蛋白酶進行消化，收集細胞懸液并應(yīng)用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)。

綜上所述可知，阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路后可抑制腎癌細胞的增殖。并通過mln4924對腎癌細胞的顯著殺傷作用，從側(cè)面證明了ube2m介導的neddylation修飾在腎癌細胞增殖活力中的關(guān)鍵作用。因此，阻斷ube2m介導的neddylation修飾信號通路是一種潛在的治療腎細胞癌的新型靶點，具有很強的臨床應(yīng)用價值。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡對本發(fā)明所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。