本發(fā)明屬于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及百里香復(fù)方精油在防治雞壞死性腸炎中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雞壞死性腸炎是parish(1961)首次發(fā)現(xiàn)的，是產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種急性消化道疾病，它是雞普遍存在的一種疾病。給全世界的養(yǎng)禽業(yè)造成了每年超過20億美元的損失。近年來，歐盟禁止在飼料中添加抗生素生長促進(jìn)劑，導(dǎo)致了壞死性腸炎在歐洲國家的養(yǎng)雞業(yè)中大量暴發(fā)。

壞死性腸炎通常發(fā)生在4周齡以后，在全世界的家禽養(yǎng)殖區(qū)均有發(fā)生(longjr，1973)。臨床癥狀表現(xiàn)為急性臨床癥狀和亞臨床癥狀。

壞死性腸炎急性臨床癥狀：急性臨床癥狀經(jīng)典的特征就是雞群死亡率突然增加，沒有先兆，有時候會出現(xiàn)墊料潮濕的早期癥狀。發(fā)病非?？?，在1h～2h內(nèi)死亡，有時候死亡率會增加到50％(riddelletal1992)。

亞臨床癥狀：過去的幾年里，亞臨床癥狀更普遍，這種形式的壞死性腸炎，沒有明顯的臨床癥狀且死亡率也不會增加。但是，腸粘膜的慢性損傷，會導(dǎo)致消化吸收不良，增重率下降，飼料轉(zhuǎn)化率增加，造成巨大的生產(chǎn)損失(elwingeretal1992)。在亞臨床感染情況下，腸道的損傷導(dǎo)致細(xì)菌到達(dá)膽管及門靜脈，大量的產(chǎn)氣莢膜梭菌寄生于肝臟，導(dǎo)致了膽管炎和肝炎，肝臟上出現(xiàn)淡紅色或白色病灶(onderkaetal1990)。

其中，腸道病變包括：肉眼可見病變通常出現(xiàn)在小腸，但是其他的器官也會發(fā)生病變，如肝和腎。通過病理解剖可以發(fā)現(xiàn)，十二指腸、空腸和回腸腸壁變薄，且充滿氣體。壞死性腸炎的臨床癥狀是小腸黏膜出現(xiàn)大面積壞死，表面覆蓋著黃棕色偽膜。典型的亞臨床癥狀是，腸粘膜表面有凹凸?fàn)畹臐?，黏膜變黃，表面有纖維素樣物質(zhì)附著。壞死性腸炎早期表現(xiàn)出強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，固有層充血，大量的炎性細(xì)胞浸潤，主要是嗜中性粒細(xì)胞。壞死性腸炎后期，腸粘膜出現(xiàn)彌散性壞死，占到腸道黏膜的三分之一到一半。壞死部位和其他組織之間由于嗜中性粒細(xì)胞的積累而出現(xiàn)一條清晰地界線。

雞壞死性腸炎誘發(fā)因素包括以下幾點(diǎn)：

一、營養(yǎng)：壞死性腸炎發(fā)生的主要風(fēng)險因素就是在腸道內(nèi)形成了有利于產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的環(huán)境。日糧的性質(zhì)是影響壞死性腸炎發(fā)生的一個重要的非細(xì)菌性因子。日糧中含有高水平難消化的水溶性淀粉多糖更易患壞死性腸炎，因此大麥、黑麥、燕麥、小麥?zhǔn)菈乃佬阅c炎發(fā)生的風(fēng)險因素，因?yàn)樗苄缘矸鄱嗵菚黾邮趁诱扯?，延長其在腸道通過的時間，減少營養(yǎng)物質(zhì)消化率(cravenetal2000)。日糧中的高濃度蛋白質(zhì)，如魚粉，也會增加壞死性腸炎的發(fā)病率，因?yàn)楦叩鞍罪暳显谀c道內(nèi)不易消化，導(dǎo)致胃腸道內(nèi)蛋白質(zhì)濃度增加，為細(xì)菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)基質(zhì)(nauerbyetal2003)。飼料顆粒的大小也會影響壞死性腸炎的發(fā)病率，飼料顆粒大的要比小的更易患壞死性腸炎(engbergetal2002)。

二、球蟲：壞死性腸炎最主要的誘發(fā)因素之一就是球蟲，由于球蟲對腸粘膜造成了損壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)血漿滲出，在腸道內(nèi)為產(chǎn)氣莢膜梭菌提供了豐富的營養(yǎng)基質(zhì)，有利于其增殖和毒素產(chǎn)生(williamsetal2005)。球蟲病往往是先于或與壞死性腸炎同時爆發(fā)的。試驗(yàn)證明，艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌在壞死性腸炎病變過程中起協(xié)同作用。al-sheikhly等在試驗(yàn)中，用共同感染產(chǎn)氣莢膜梭菌和艾美耳的試驗(yàn)組與僅感染產(chǎn)氣莢膜梭菌或僅感染艾美耳球蟲組相比較發(fā)現(xiàn)，前者病變更嚴(yán)重且死亡率更高。

三、致病性的產(chǎn)氣莢膜梭菌：患有壞死性腸炎的雞的腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌含量達(dá)到了10⁶～10⁸cfu/g，而健康雞腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌含量為0～10⁵cfu/g(keyburnetal2008)。然而腸道中即使含有大量的產(chǎn)氣莢膜梭菌也不足以造成壞死性腸炎。因此產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量與壞死性腸炎并沒有直接關(guān)系，并不是所有的產(chǎn)氣莢膜梭菌都能夠誘導(dǎo)壞死性腸炎。壞死性腸炎的發(fā)生需要特定的致病條件，當(dāng)病變條件都存在的情況下，高數(shù)量的產(chǎn)氣莢膜梭菌可能會導(dǎo)致更嚴(yán)重的病變，但前提是致病性菌株的存在。

四、細(xì)菌素：細(xì)菌素在壞死性腸炎發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。通過脈沖場凝膠電泳或擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析，健康雞群可以分離出不同基因型的a型產(chǎn)氣莢膜梭菌，甚至是在雞的同一腸道內(nèi)。相反的，在壞死性腸炎的病例中腸道中只能克隆出一個亞型。在自然恢復(fù)或治療后，雞體內(nèi)的細(xì)菌又出現(xiàn)多個基因型(parketal，2008)。這種單一菌株占主導(dǎo)地位的現(xiàn)象在多個研究中已被證明，它是壞死性腸炎發(fā)病的主要過程。壞死性腸炎中的分離株比正常的菌株能分泌更多的抑制其他產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長因子。這種由細(xì)菌產(chǎn)生的有毒的可以抑制其他相關(guān)菌株生長的蛋白質(zhì)稱為細(xì)菌素。細(xì)菌素的產(chǎn)生抑制了其他產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道內(nèi)的生長，使得強(qiáng)勢毒株代替了其他菌株。

五、netb毒素：netb毒素首次發(fā)現(xiàn)在患有壞死性腸炎的病雞中分離出的a型產(chǎn)氣莢膜梭菌中。與多種成孔毒素的氨基酸序列具有相似性，與產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素同源性有38％，與葡萄球菌產(chǎn)生的α毒素同源性有31％。netb毒素可以使雞的肝癌細(xì)胞變圓溶解，在細(xì)胞膜上形成1.6～1.8nm左右的孔隙。netb毒素基因位于質(zhì)粒上，受到virsr雙組分信號系統(tǒng)的調(diào)控。敲除netb毒素基因的產(chǎn)氣莢膜梭菌，在試驗(yàn)中不能感染雞或不能在腸道中產(chǎn)生壞死性腸炎病變。但是，插入netb毒素基因后的補(bǔ)充突變體和野毒株一樣具有致病性(keyburnetal2008)。因此，可以看出netb毒素是引起雞壞死性腸炎的關(guān)鍵因素。大多數(shù)從壞死性腸炎病例中分離出的菌株都攜帶netb毒素基因。在加拿大，從壞死性腸炎病雞的產(chǎn)氣莢膜梭菌中95％都含有netb毒素基因，從健康雞分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌中netb毒素基因陽性只占35％(chalmersetal2008)。美國分離株中，壞死性腸炎分離株netb毒素基因陽性為58％，正常菌群中菌株攜帶netb毒素基因只有8.75％(martinandsmyth2009)。通過使用netb毒素基因陰性和netb毒素基因陽性的a型產(chǎn)氣莢膜梭菌大量的肉雞感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有netb毒素基因陽性的產(chǎn)氣莢膜梭菌才能產(chǎn)生壞死性腸炎病變，且病變程度與netb毒素的產(chǎn)生能力有著直接關(guān)系(keyburnetal2009)。

隨著全球化的發(fā)展，我國對抗生素的控制也必將與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌。所以需要做好應(yīng)對雞壞死性腸炎的措施。由于壞死性腸炎是一種復(fù)雜的，受多因素影響的疾病，要重現(xiàn)該疾病要考慮到多個方面。

而雞壞死性腸炎動物模型的構(gòu)建存在以下難點(diǎn)：如netb陽性菌株的篩選，不同菌株致病性能力的鑒定；攻毒前細(xì)菌需要在兩種不同培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)30個小時的培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)動物飼料的摸索；攻毒菌液拌料的濃度的確定，等等。此外使用不同的得分標(biāo)準(zhǔn)，造成了不同的評分系統(tǒng)不能進(jìn)行相互的比較研究。因?yàn)殡u壞死性腸炎動物模型的建立相對復(fù)雜，所以目前大多數(shù)的研究只進(jìn)行了體外測試，而沒有進(jìn)行動物模型中的測試。僅進(jìn)行體外測試的結(jié)果往往不能真實(shí)的反應(yīng)供試藥物對于雞壞死性腸炎的防治效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供百里香復(fù)方植物精油在防治雞壞死性腸炎中的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

百里香復(fù)方精油在防治雞壞死性腸炎中的應(yīng)用，百里香復(fù)方精油包括百里香-肉豆蔻復(fù)方精油、百里香-羅勒復(fù)方精油。

優(yōu)選的，百里香-肉豆蔻復(fù)方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的體積比為(1-3):(3-1)。

優(yōu)選的，百里香-肉豆蔻復(fù)方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的體積比為1:1。

優(yōu)選的，百里香-羅勒復(fù)方精油中百里香精油和羅勒精油的體積比為(1-3):(3-1)。

優(yōu)選的，百里香-羅勒復(fù)方精油中百里香精油和羅勒精油的體積比為1:1。

本發(fā)明研究中對百里香-肉豆蔻復(fù)方精油以及百里香-羅勒復(fù)方精油在(1-3):(3-1)范圍內(nèi)的各種配比做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1:1效果佳，而且簡單方便，所有優(yōu)選體積比為1:1來進(jìn)行后續(xù)的動物實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)選的，百里香復(fù)方精油通過添加到雞的日糧中來防治雞壞死性腸炎。

優(yōu)選的，百里香復(fù)方精油添加到雞日糧中的比例為80-150mg/kg。

優(yōu)選的，百里香復(fù)方精油添加到雞日糧中的比例為100mg/kg。

一種預(yù)防雞壞死性腸炎的飼料添加劑，添加劑為百里香復(fù)方精油或百里香復(fù)方精油及其可接受的食品級輔料。

優(yōu)選的，百里香復(fù)方精油包括百里香-肉豆蔻復(fù)方精油、百里香-羅勒復(fù)方精油。

優(yōu)選的，百里香-肉豆蔻復(fù)方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的體積比為(1-3):(3-1)。

優(yōu)選的，百里香-肉豆蔻復(fù)方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的體積比為1:1。

優(yōu)選的，百里香-羅勒復(fù)方精油中百里香精油和羅勒精油的體積比為(1-3):(3-1)。

優(yōu)選的，百里香-羅勒復(fù)方精油中百里香精油和羅勒精油的體積比為1:1。

一種防治雞壞死性腸炎的方法，是將百里香復(fù)方精油添加到雞的日糧中防治雞壞死性腸炎；百里香復(fù)方精油包括百里香精油和肉豆蔻精油按照體積比(1-3):(3-1)混合的復(fù)方精油、百里香精油和羅勒復(fù)方精油按照體積比(1-3):(3-1)混合的復(fù)方精油。

優(yōu)選的，百里香復(fù)方精油添加到雞日糧中的比例為80-150mg/kg。

優(yōu)選的，百里香復(fù)方精油添加到雞日糧中的比例為100mg/kg。

植物精油可以很好地和雞日糧混合均勻。

本發(fā)明的有益效果是：

申請人經(jīng)過1-2年的時間成功地構(gòu)建了雞壞死性腸炎動物模型，本模型使用小麥基礎(chǔ)飼料進(jìn)行飼喂，并在后期添加魚粉。小麥含有非淀粉性多糖，增加了食糜粘度，影響了小腸的消化吸收，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖提供了條件。后期加入的魚粉，使日糧中蛋白質(zhì)含量增加，可以提供給產(chǎn)氣莢膜梭菌大量的氨基酸，使雞更易患壞死性腸炎。采用產(chǎn)氣莢膜梭菌單獨(dú)攻毒，典型病變明顯；能排除以前球蟲并發(fā)模型與球蟲病混淆的現(xiàn)象。本模型試驗(yàn)周期短，重復(fù)性高。除了體外實(shí)驗(yàn)，申請人還利用該模型研究植物精油的體內(nèi)防治效果，真正明確了植物精油對于雞壞死性腸炎具有預(yù)防和治療的效果。

申請人經(jīng)過大量研究，優(yōu)選出百里香-肉豆蔻1:1混合復(fù)方精油、百里香-羅勒1:1混合復(fù)方精油，上述植物精油組合對雞壞死性腸炎都具有一定的防治效果。

高通量測序技術(shù)是目前比較先進(jìn)的研究微生物多樣性的手段，申請人運(yùn)用高通量測序技術(shù)研究植物精油對雞壞死性腸炎腸道微生物的影響。得到的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)量大，準(zhǔn)確性高。優(yōu)于傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法。本發(fā)明通過對8個實(shí)驗(yàn)組的小腸和盲腸段的腸道菌群進(jìn)行高通量測序。經(jīng)過質(zhì)控、拼接處理后，每個樣品中的優(yōu)化序列條帶均在3000條以上。通過稀釋曲線可知，測序量和測序深度足夠覆蓋樣品中大部分物種，滿足后續(xù)分析。通過4個alpha指數(shù)，即ace指數(shù)、chao指數(shù)、shannon指數(shù)和simpson指數(shù)可以看出，在小腸段，相對于壞死性腸炎疾病模型組，各植物精油治療組腸道內(nèi)容物中物種的豐度減小，但多樣性增加。腸道微生物菌群是維持腸道健康的重要因素，一個平衡的微生物菌群可以有效地防御腸道內(nèi)的病原體。采用植物精油治療組的腸道菌群相對于人工感染組都有不同程度的變化，這些變化可能對疾病的防御產(chǎn)生積極的影響。

附圖說明

圖1為雞壞死性腸炎小腸不同病變；其中注：1為空白對照，2、3、4、5、6、7對應(yīng)的分別是典型的1分、2分、3分、4分、5分、6分病變；

圖2為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因型鑒定；其中，m為dl2000marker，1～20為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株；

圖3為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌netb基因鑒定；其中，m為dl2000marker，1～20為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株；

圖4為有效序列長度分布統(tǒng)計；

圖5為稀釋性曲線；

圖6為門水平物種分布柱狀圖；

圖7為目水平物種分布柱狀圖；

圖8為科水平物種分布柱狀圖；

圖9為差異性矩陣熱圖；

圖10為多樣品相似度樹狀圖；

圖11為基于unweightedunifrac的pcoapcoa散點(diǎn)圖。

具體實(shí)施方式

雞壞死性腸炎是產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種急性消化道疾病，是雞最重要的腸道疾病之一。給全球的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。隨著國內(nèi)外對抗生素促生長劑使用的限制，該病的發(fā)病率有所增加。找到一種安全、有效地新型藥劑是當(dāng)今養(yǎng)殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。

發(fā)明人建立了雞壞死性腸炎人工發(fā)病模型，并為其體內(nèi)的篩選奠定了基礎(chǔ)。整個研究包括7部分1.雞糞便樣品和壞死性腸炎病例腸道組織中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定；2.multi-pcr方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌野外分離株進(jìn)行基因型鑒定；3.產(chǎn)氣莢膜梭菌野外分離株netb毒素基因(netb)檢測；4.產(chǎn)氣莢膜梭菌野外分離株的耐藥性檢測；5.eric-pcr對產(chǎn)氣莢膜梭菌野外分離株進(jìn)行亞型分析；6.雞壞死性腸炎模型建立；7.植物精油對壞死性腸炎的防治。

試驗(yàn)從廣東省清遠(yuǎn)、佛山、云浮、江門、廣州等地的5個規(guī)?；B(yǎng)雞場中采集了糞便樣品和壞死性腸炎病例腸道組織550份，采用選擇性培養(yǎng)基tsc平板和血瓊脂平板進(jìn)行初步分離，然后又對分離株進(jìn)行了生化鑒定和含鐵牛乳特征性鑒定。初步分離出47株產(chǎn)氣莢膜梭菌，分離率為8.5％，相對于國外報道分離率較低。

針對α、β、ε和ι四種毒素基因進(jìn)行引物設(shè)計，建立multi-pcr方法。使用引物如下所示：

表1：muliti-pcr引物序列

pcr反應(yīng)體系為25μl反應(yīng)體系：dna模板2μl，上下游引物各0.125μl，maxmaster12.5μl，無核酸酶水9.5μl。反應(yīng)程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃，10min；10℃保存。

pcr反應(yīng)結(jié)束后，取8μl的pcr產(chǎn)物，在1％瓊脂糖凝膠電泳，80v，40min檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)記錄成像，圖片保存。

使用該方法對47株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行基因型鑒定，47株分離株均擴(kuò)增出400bp左右的特異性片段，可以鑒定為a型。另外通過該方法對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、丁酸梭菌進(jìn)行擴(kuò)增，沒有出現(xiàn)特異性產(chǎn)物，說明了該方法具有特異性。

設(shè)計出netb毒素基因的引物，如下所示：

上游引物：5’-gctggtgctggaataaatgc-3’(seqidno：9)；

下游引物：5’-tcgccattgagtagtttccc-3’(seqidno：10)。

pcr反應(yīng)體系為25μl反應(yīng)體系：模板dna2μl，引物各0.5μl，maxmaster12.5μl，無核酸酶水9.5μl。反應(yīng)程序：94℃2min；94℃45s，50℃30s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃10min；10℃保存。

pcr反應(yīng)結(jié)束后，取8μl的pcr產(chǎn)物，在1％瓊脂糖凝膠電泳，80v，40min檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)記錄成像，圖片保存。

通過pcr方法檢測47株產(chǎn)氣莢膜梭菌，結(jié)果只有3株產(chǎn)氣莢膜梭菌是netb基因陽性，記名為cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf。

對47個分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)使用了12種抗生素和化學(xué)合成藥，其中對甲硝唑和林可霉素的耐藥比率較高，分別為95.7％和91.5％。對頭孢氨芐、土霉素、多西環(huán)素、克林霉素、紅霉素的耐藥比率也在70％～80％之間。氨芐青霉素耐藥比率最低，只有12.8％。

對47株通過multi-pcr鑒定為a型的產(chǎn)氣莢膜梭菌采用eric-pcr技術(shù)進(jìn)行亞型分析。以相似性≥0.60為分界點(diǎn)，47株分離株可以分為5個主型，以相似性≥0.70為分界點(diǎn)，47株分離株可以分為8個亞型。

模型試驗(yàn)中，采用1日齡的健康羅斯308雞苗，隨機(jī)分為6組，每組10只。自由飲水，采食小麥為基礎(chǔ)的日糧。其中1組是空白對照，其他組為試驗(yàn)組。除了空白對照組，其他組都采用菌液拌料的方式進(jìn)行攻毒。5組試驗(yàn)組中3個實(shí)驗(yàn)組分別采用3株netb基因陽性菌株攻毒，另外2組分別用2個netb基因陰性的菌株攻毒。整個飼養(yǎng)過程日糧分為兩個階段：1～13日齡飼喂小麥基礎(chǔ)的日糧，14～23日齡在基礎(chǔ)飼料中添加50％的魚粉。21～23日齡對5個試驗(yàn)組進(jìn)行菌液拌料攻毒，每天兩次。攻毒試驗(yàn)所用的菌液配制方法：試驗(yàn)菌株先在庖肉培養(yǎng)基里40℃厭氧培養(yǎng)15h，然后轉(zhuǎn)移至ft液體培養(yǎng)基中繼續(xù)40℃厭氧培養(yǎng)15h。24日齡剖檢，觀察小腸病變并進(jìn)行記分，記分使用的是6分系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組和另外2個netb基因陰性的菌株攻毒組都沒有明顯的病變。3個netb基因陽性的菌株攻毒組都出現(xiàn)了典型的壞死性腸炎病變。均在發(fā)病雞的病灶中分離出netb基因陽性的a型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

采用紙片擴(kuò)散法和二倍稀釋法研究植物精油或復(fù)方植物精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活性。

下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。如無特殊說明，本發(fā)明中所述的混合復(fù)方精油配方中肉豆蔻精油、百里香精油、羅勒精油均是按照體積比進(jìn)行混合。所述精油產(chǎn)品參考國家標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)1雞的壞死性腸炎模型建立

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)攻毒所用菌株為壞死性腸炎病例分離出的a型產(chǎn)氣莢膜梭菌，其中ne01和ne02為netb基因陰性菌株，cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf為分離自廣東省博羅、東莞、佛山地區(qū)netb陽性菌株。

1.2試驗(yàn)動物及設(shè)計

試驗(yàn)選用1日齡的羅斯308商用雞苗，購自廣東東莞正大康地有限公司。隨機(jī)分為6組，每組10只。試驗(yàn)分為6組，1組為空白對照不進(jìn)行細(xì)菌攻毒，其他5組在21日齡進(jìn)行菌液拌料攻毒，5組攻毒細(xì)菌分別是ne01、ne02、cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf。

1.3試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧和江昌蒸汽魚粉購自廣州市江豐實(shí)業(yè)有限公司，基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表2。

表2基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

。

1.4飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前1周，清理雞舍，先用火焰消毒籠舍、地面，再用甲醛熏蒸消毒，飼養(yǎng)全程定期消毒。采用籠養(yǎng)。相對濕度保持在64％～76％。，整個過程保持良好通風(fēng)，自由采食及自由飲水。1～13日齡飼喂基礎(chǔ)日糧，14～23日齡在基礎(chǔ)日糧中加入魚粉，使魚粉含量達(dá)到50％。

1.5攻毒菌懸液準(zhǔn)備

將試驗(yàn)組的產(chǎn)氣莢膜梭菌(包括netb基因陰性菌株ne01和ne02，netb陽性菌株cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf)復(fù)蘇，劃線接種到tsc平板上，40℃厭氧培養(yǎng)24h。取平板上黑色典型菌落接種到庖肉培養(yǎng)基中，40℃厭氧培養(yǎng)15h。然后將庖肉培養(yǎng)物接種到400ml的ft液體培養(yǎng)基中，40℃厭氧培養(yǎng)15h。

1.6疾病模型建立

將ft培養(yǎng)物加入飼料中，拌勻，菌液與飼料比例為(體積/重量；ml/g)1：1.5。每天兩次，上午8:00，下午4:00，連續(xù)飼喂3d。

1.7病變記分

24日脫頸處死，剖檢觀察十二指腸、空腸回腸病變，分別對各組的病變進(jìn)行記分。記分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3壞死性腸炎病變評分

。

1.8病灶分離產(chǎn)氣莢膜梭菌基因型和netb基因檢測

用一次性拭子從病變部位采集樣品。經(jīng)過分離鑒定后，進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌分離基因型鑒定和進(jìn)行netb基因檢測。

1.9數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用spss17.0進(jìn)行顯著性分析。

2.雞壞死性腸炎模型建立結(jié)果

2.1臨床癥狀和腸道病變

沒有攻毒前雞狀態(tài)良好，開始攻毒1d后，除空白組外，其余各組均出現(xiàn)輕微的腹瀉。連續(xù)攻毒后，3組netb基因陽性菌株攻毒組腹瀉癥狀加重，食欲減退，排紅色或黑褐色煤焦油樣糞便，有的糞便中混有血液、腸粘膜組織。

剖檢后，空白組，腸粘膜光滑，無損傷。

兩株netb基因陰性的菌株攻毒組，出現(xiàn)僅出現(xiàn)腸粘膜增厚現(xiàn)象，并沒有其他明顯可見病變。

3株netb陽性菌株攻毒組，出現(xiàn)的不同程度的典型壞死性腸炎病變，小腸黏膜表面有凹凸?fàn)顫儯砻嬗欣w維樣物質(zhì)附著，嚴(yán)重的腸粘膜出現(xiàn)彌散性壞死。結(jié)果見圖1。圖1為雞壞死性腸炎小腸不同病變；其中：1為空白對照，2、3、4、5、6、7對應(yīng)的分別是典型的1分、2分、3分、4分、5分、6分病變。

2.2小腸病變記分

小腸病變記分結(jié)果見表4。

表4小腸病變記分結(jié)果

注：表內(nèi)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p＜0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(p＜0.01)，字母相同表示差異不顯著。

表4結(jié)果顯示：空白組沒有任何病變出現(xiàn)。netb基因陰性的兩株菌只是引起了腸壁黏膜的變厚，沒有其他可見病變。netb基因陽性的三組都出現(xiàn)了明顯的壞死性腸炎病變。其中netb陽性三組得分極顯著高于空白組和netb陰性組。兩組netb陰性組得分差異不顯著。

2.3病灶分離產(chǎn)氣莢膜梭菌基因型和netb基因檢測結(jié)果

經(jīng)過muliti-pcr方法進(jìn)行基因型檢測，發(fā)現(xiàn)所有病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌(圖2和圖3)均擴(kuò)增出400bp左右的片段，判定為a型菌，netb基因檢測也都為陽性。

圖2為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因型鑒定；其中，m為dl2000marker，1～20為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株。

圖3為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌netb基因鑒定；其中，m為dl2000marker，1～20為病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株。

近年來對雞壞死性腸炎的研究集中在找控制該病的方法，及弄清楚發(fā)病機(jī)制方面。通過人工誘導(dǎo)建立雞壞死性腸炎模型是研究的基礎(chǔ)。在以前研究中，常采用球蟲并發(fā)的模式誘導(dǎo)試驗(yàn)，但問題是小腸球蟲病和雞壞死性腸炎容易混淆。發(fā)明人在本發(fā)明中只采用了產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液單獨(dú)攻毒方案，效果明顯。netb基因陽性的3個菌株試驗(yàn)組都出現(xiàn)了典型的壞死性腸炎病變。且從病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株都是a型netb基因陽性的菌株，說明了攻毒的3組netb陽性菌可以引起雞的壞死性腸炎。3組出現(xiàn)壞死性腸炎病變的試驗(yàn)組，病變得分各不相同，病變程度有差異，這說明即使都是netb基因陽性的產(chǎn)氣莢膜梭菌，但是各個菌株的致病性還是存在差別的。2組netb陰性的分離株和空白組都沒有出現(xiàn)壞死性腸炎病變。這從反面說明netb基因是雞壞死性腸炎發(fā)病的重要原因。

試驗(yàn)中基礎(chǔ)飼料中使用了小麥，小麥含有非淀粉性多糖，增加了食糜粘度，影響了小腸的消化吸收，為產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖提供了條件。后期加入的魚粉，使日糧中蛋白質(zhì)含量增加，可以提供給產(chǎn)氣莢膜梭菌大量的氨基酸，使雞更易患壞死性腸炎。

本次試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某醪匠晒?，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)，如抗菌藥物、疫苗、毒力因子評價等。不過由于不同的研究者對疾病的再現(xiàn)有著不同的目的，所要求的疾病嚴(yán)重性也不同，所以應(yīng)用時還需要對模型進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

實(shí)驗(yàn)2植物精油的體外抑菌試驗(yàn)

日糧中添加抗生素一直以來都是控制壞死性腸炎的主要方法，但是隨著抗生素促生長劑逐漸在世界各地被禁用，對新型替代治療藥物的研究成為當(dāng)務(wù)之急，申請人優(yōu)選出幾種精油配方作為一種安全有效的抗生素替代品，具有重要的開發(fā)價值。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

病料中分離出的3株netb陽性菌株，即cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf。

1.2植物精油

肉豆蔻單方精油、百里香單方精油、羅勒單方精油、肉豆蔻和百里香精油1:1混合復(fù)方、肉豆蔻和羅勒1:1混合復(fù)方、百里香和羅勒1:1混合復(fù)方。所用植物精油均購自廣州市某日用品有限公司。

1.3濾紙片的制備

選吸水性強(qiáng)而質(zhì)地均勻的濾紙，用打孔機(jī)打成直徑為6mm的圓片，分裝于潔凈的干燥試管中，121℃高壓滅菌15min后備用。

1.4菌株活化

將凍存的3株菌株解凍，劃線接種于tsc平板上，40℃厭氧培養(yǎng)24h。挑取典型的黑色菌落，接種到10mlft液體培養(yǎng)基中，40℃厭氧培養(yǎng)8h。按照0.5麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕合♂屩?0⁸cfu/ml。

1.5紙片擴(kuò)散法

用移液槍吸取100μl10⁸cfu/ml試驗(yàn)菌液至ft營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布器均勻涂布3次然后繞平板邊緣涂抹一周，蓋好平皿，置室溫干燥3～5min。每個平板貼放用滅菌的鑷子小心夾取濾紙片，貼于培養(yǎng)基表面，并輕壓紙片，使其緊貼培養(yǎng)基表面，各紙片中心相距大于24mm，紙片距平皿外緣大于15mm。分別吸取5μl植物精油原液滴加到濾紙片上。將平皿倒置，40℃厭氧培養(yǎng)24h，觀察并測量抑菌圈的直徑，每組做3次重復(fù)，取平均值。

抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌作用效果以抑菌圈直徑小于10mm為不敏感，在11～15mm之間為敏感，在16～20之間為中度敏感，大于20mm為高度敏感。

2紙片擴(kuò)散法結(jié)果

利用紙片擴(kuò)散法檢測單方精油和復(fù)方精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌致病菌的敏感性和抑菌作用。結(jié)果見表5和表6。

表5：3種單方植物精油對三株致病菌的抑菌圈直徑(mm)

注：抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌作用效果以抑菌圈直徑小于10mm為不敏感，在11～15mm之間為敏感，在16～20之間為中度敏感，大于20mm為高度敏感。

從表5中可以看出3種單方植物精油對3株產(chǎn)氣莢膜梭菌致病菌都有較強(qiáng)的抑菌作用。對于netbc和netbd株效果更為明顯，達(dá)到了高度敏感。對于netbf株抑制效果為中度敏感。

表6：復(fù)方植物精油對三株致病菌的抑制作用(mm)

注：抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌作用效果以抑菌圈直徑小于10mm為不敏感，在11～15mm之間為敏感，在16～20之間為中度敏感，大于20mm為高度敏感。

從表6中可以發(fā)現(xiàn)3種復(fù)方植物精油的抑菌效果也比較強(qiáng)。對于netbc株復(fù)方植物精油的增效作用明顯。

實(shí)驗(yàn)3植物精油的最小抑菌濃度(mic)試驗(yàn)

1.材料與方法

1.1植物精油供試品的配制

吸取0.4ml植物精油至ep管內(nèi)，添加吐溫-800.1ml，混合均勻，加入0.5ml無菌水，稀釋成濃度為400μl/ml，再次混合均勻。乳白色液體，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2二倍稀釋法

無菌條件下，取10支試管，編號，其中9號管為陽性管，10號管為為陰性管，其余為不同濃度管。用移液槍給1號管和10號管加9mlft培養(yǎng)基，其余各管加5mlft培養(yǎng)基。再給1號管加入植物精油供式品，吹打均勻，吸取5ml放入2號管，依次類推至8號管。10號管加入植物精油供式品，吹打均勻，吸取5ml，棄去。給1號管至9號管添加100μl菌懸液。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)6～8h。分別吸取各管內(nèi)液體100μl至ft營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。凡是無菌生長平板對應(yīng)的藥物最高稀釋濃度為這種植物精油對產(chǎn)氣莢膜梭菌的最小抑菌濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表7。

表7植物精油對對三株致病菌的mci結(jié)果(μl/ml)

如表7所示，單方及復(fù)方精油對3株netb陽性菌株均具有一定的抑制作用。對于netbc株六種精油或精油組合的mic均為0.31μl/ml。對于netbd株六種精油的mic均為0.63μl/ml。對于netbf株百里香、羅勒和百里香+羅勒效果最好，mic為1.25μl/ml。

實(shí)驗(yàn)4植物精油用于防治雞壞死性腸炎的動物試驗(yàn)

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

netbf菌株：為a型產(chǎn)氣莢膜梭菌，netb基因陽性。

1.2試驗(yàn)動物及設(shè)計

試驗(yàn)選用1日齡的羅斯308商用雞苗80只，隨機(jī)分為8個組，每組15只。1組為空白組，1組是攻菌對照組，其余6組組為植物精油防治組，分別在17日齡后飼料中添加100mg/kg1:1的肉豆蔻單方精油、百里香單方精油、羅勒單方精油以及復(fù)方植物精油。

1.3試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧，魚粉采用如實(shí)驗(yàn)1。

1.4壞死性腸炎模型建立

根據(jù)實(shí)驗(yàn)1所用的方法對除了空白對照組的其余7個試驗(yàn)組進(jìn)行攻毒。

1.5小腸病變記分。

24日齡，隨機(jī)選取10只雞，脫頸處死，剖檢觀察十二指腸、空腸、回腸病變，分別對各組的病變進(jìn)行記分。記分標(biāo)準(zhǔn)如表3。數(shù)據(jù)處理如實(shí)驗(yàn)1。

1.6分離株基因型netb基因鑒定

用一次性拭子從病變部位采集樣品。經(jīng)過分離鑒定后，按照實(shí)驗(yàn)1的方法進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌分離基因型鑒定和進(jìn)行netb基因檢測。

1.7高通量測序技術(shù)分析雞腸道菌群的多樣性

1.7.1腸道內(nèi)容物樣本采集

在24日齡時，每個實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取5只雞，剖解后，在十二指腸和盲腸端兩端扎結(jié)取出，冰盒保存。在超凈工作臺內(nèi)，將腸道分為兩部分，小腸段(十二指腸、空腸和回腸)和盲腸段。無菌環(huán)境下將腸道內(nèi)容物取出，并將每組5只雞的腸道內(nèi)容物充分混合。－80℃保存。

1.7.2細(xì)菌總dna提取

雞腸道內(nèi)容物中細(xì)菌總dna提取采用qiaampdnastoolminikit試劑盒進(jìn)行抽提，具體流程參照試劑盒說明書。

1.7.3illuminamiseq測序分析

將提取的腸道細(xì)菌dna送至微基生物科技(上海)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.7.4生物信息學(xué)分析

包括測序數(shù)據(jù)處理、out分析、物種信息分析、alpha多樣性分析和beta多樣性分析。

2動物試驗(yàn)結(jié)果

2.1小腸病變記分結(jié)果，見表8。

表8：小腸病變記分

注：表內(nèi)肩注小寫字母不同表示差異顯著(p＜0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(p＜0.01)，字母相同表示差異不顯著。

由表8看出：與攻毒組比較，百里香單方精油治療組沒有顯著性差異，其他機(jī)組均有顯著性差異。結(jié)果表明肉豆蔻單方精油、羅勒單方精油、肉豆蔻和百里香精油1:1混合復(fù)方、肉豆蔻和羅勒1:1混合復(fù)方、百里香和羅勒1:1混合復(fù)方治療組可以顯著減輕產(chǎn)氣莢膜梭菌對腸道的損傷。百里香單方治療組沒有效果。從病變嚴(yán)重程度來看，百里香單方植物精油效果最好，相對于其他組，病變處在4～6分的雞只有1只。肉豆蔻+羅勒復(fù)方植物精油相對于其單方時，病變處在4～6分的雞也有所下降。

綜上所述，動物試驗(yàn)中肉豆蔻單方精油、羅勒單方精油、肉豆蔻和百里香精油1:1混合復(fù)方、肉豆蔻和羅勒1:1混合復(fù)方、百里香和羅勒1:1混合復(fù)方對壞死性腸炎都具有一定的防治效果。但是根據(jù)記分結(jié)果來看，治療組中還是有較多的病變出現(xiàn)，這可能是由于雖然植物精油具有抑菌效果，但是并不能使毒素失活。在這次試驗(yàn)動物模型中，采用的是連續(xù)培養(yǎng)后的菌液拌料攻毒，培養(yǎng)液中含有大量的毒素，造成了腸黏膜的損傷。另外，植物精油的用量，添加時間的長短等可能都會影響其防治效果。實(shí)際應(yīng)用中可以增加植物精油飼喂時間，這樣可以在前期控制產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，使得細(xì)菌數(shù)量和毒素含量都大大降低，從而減小疾病的發(fā)生。

2.2病灶分離產(chǎn)氣莢膜梭菌基因型和netb基因檢測結(jié)果

經(jīng)過基因型檢測所有病灶分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌均擴(kuò)增出400bp左右的片段，判定為a型菌，netb基因檢測也都為陽性。

2.3不同植物精油對雞腸道菌群的影響

2.3.1序列數(shù)目結(jié)果

結(jié)果見表9和表10，以及圖4。

表9有效序列統(tǒng)計

注：表中g(shù)1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8分別代表空白組、攻毒對照組、肉豆蔻組、百里香組、羅勒組、肉豆蔻+百里香1:1混合復(fù)方組、肉豆蔻+羅勒1:1混合復(fù)方組、百里香+羅勒1:1混合復(fù)方組。a代表小腸段，b代表盲腸段。在本發(fā)明中如無特殊說明，均代表此含義。

表10優(yōu)化序列統(tǒng)計

表9和表10以及圖4結(jié)果顯示，高通量測序的有效序列均在50000條左右，有效序列長度大多在450bp左右，經(jīng)過質(zhì)控和拼接處理后，每個樣品所得到的條帶序列均在30000條以上。

雞的腸道內(nèi)存在著復(fù)雜的微生物菌群，這些菌群的組成對宿主的健康、生產(chǎn)性能、發(fā)育及營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等方面都有重要作用。研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和變化有著重要意義。高通量測序技術(shù)是目前比較先進(jìn)的研究微生物多樣性的手段，本次試驗(yàn)運(yùn)用高通量測序技術(shù)研究植物精油對雞壞死性腸炎腸道微生物的影響。得到的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)量大，準(zhǔn)確性高。優(yōu)于傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法。

本次試驗(yàn)通過對8個實(shí)驗(yàn)組的小腸和盲腸段的腸道菌群進(jìn)行高通量測序。經(jīng)過質(zhì)控、拼接處理后，每個樣品中的優(yōu)化序列條帶均在3000條以上。通過稀釋曲線可知，測序量和測序深度足夠覆蓋樣品中大部分物種，滿足后續(xù)分析。

2.3.2腸道菌群的豐度及多樣性分析

樣品中菌群的稀釋性曲線如圖5，由圖5可知，隨著測序序列數(shù)的增加，其斜率逐漸減小，趨于平臺期。說明測序深度足夠覆蓋樣品中的大部分物種，滿足后續(xù)分析。

各樣品的otu數(shù)目、ace指數(shù)、chao指數(shù)、shannon指數(shù)和simpson指數(shù)如表11所示。

表11樣品多樣性結(jié)果

由表11可知，所有樣品中均可檢測出較多的otu，otu的數(shù)量分布在192～274之間。這表明本次取樣的腸道內(nèi)容物中，各組物種豐度很高，但是不同組之間物種構(gòu)成的差異較大。通過4個alpha指數(shù)可以看出，在小腸中，相對于壞死性腸炎疾病模型組，各治療組腸道內(nèi)容物中物種的豐富度減小，但多樣性增加。其中肉豆蔻+百里香組多樣性最高。在盲腸中，相對于壞死性腸炎疾病模型組，肉豆蔻+羅勒組菌群豐富度最高、多樣性最好。

2.3.3腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

對各樣品從門、目、科3個水平進(jìn)行整理分析，繪制不同水平上的物種相對豐度柱狀圖，如圖6、圖7和圖8。并繪制群落熱圖。

從圖6可以看出，在門水平上，在不同樣品的不同腸段中，厚壁菌門(frimicutes)(firmicutes)均是最主要菌門。在小腸中，壞死性腸炎模型組變性菌門(proteobacteria)占18.9％。但是在植物精油治療組中，羅勒、肉豆蔻+百里香、肉豆蔻+羅勒和百里香+羅勒組中，方線菌門(actinobacteria)比例增加，分別為32.5％、14.6％、45.3％、23.3％。其中百里香+羅勒組中擬桿菌門(bacterodetes)(bacterodetes)比例為23.3％，與其他各組差異較大。在盲腸中，擬桿菌門(bacterodetes)(bacterodetes)是各組含量第二多的門，但是相對于攻毒組，各植物精油防治組中擬桿菌門(bacterodetes)(bacterodetes)比例增加。

從圖7可知，在目水平上看梭菌目(clostridiules)和乳桿菌目(lactobacillales)為各樣品腸道中的主要目。在小腸中，植物精油防治組中，羅勒和肉豆蔻+羅勒組中，相對攻毒組，梭菌目(clostridiules)所占比例減少，攻毒組中梭菌目(clostridiules)比例為55.3％，57比例分別為20.1％和16.0％，且在肉豆蔻+羅勒組中芽孢桿菌目(bacillales)含量增加，為15.0％。百里香+羅勒組中擬桿菌目(bcateroidales)含量比其他組高，占23.3％。在盲腸中，擬桿菌目(bcateroidales)成為第三種主要目，各組菌群結(jié)構(gòu)改變不大。

從圖8可知，在科水平上，小腸中，攻毒組菌群結(jié)構(gòu)中，主要的科為乳桿菌科(lactobacillaceae)、腸桿菌科(enterobacteriaceae)、瘤胃球菌科(ruminococcaceae)和毛螺旋菌科(lachnospiraceae)所占比例為19.5％、18.3％、5.1％和3.6％。相對于攻毒組，各植物精油治療組中，羅勒、肉豆蔻+百里香、肉豆蔻+羅勒和百里香+羅勒組中菌群結(jié)構(gòu)改變較大，羅勒組中，棒狀桿菌科(corynebacteriacea)占31.4％；肉豆蔻+羅勒組中，瘤胃球菌科(ruminococcaceae)占19.8％，棒狀桿菌科(corynebacteriacea)占13.3％，毛螺旋菌科(lachnospiraceae)占11.8％；肉豆蔻+羅勒組中比例最高的科是棒狀桿菌科(corynebacteriacea)占27.3％，和其他組明顯不同的是，葡萄球菌科(staphylococcaceae)和短桿菌科(brevibacteriacea)含量增加，比例分別為13.0％和10.2％；百里香+羅勒組中，理研菌科(rikenellaceae)含量增加，占23.3％。盲腸中，各種主要菌群為乳桿菌科(lactobacillaceae)、毛螺旋菌科(lachnospiraceae)和瘤胃球菌科(ruminococcaceae)，各組差別不大。熱圖代表樣品中各物種的相對豐度水平，可以通過顏色的梯度及相似度來反映樣品在各類水平上群落組成的相似性和差異性。

腸道中菌群的改變對雞的飼料轉(zhuǎn)化率也有著不同的影響，從側(cè)面表現(xiàn)出植物精油對宿主生產(chǎn)性能的作用。腸道微生物菌群是維持腸道健康的重要因素，一個平衡的微生物菌群可以有效地防御腸道內(nèi)的病原體。本發(fā)明試驗(yàn)中各治療組的腸道菌群相對于攻毒組都有不同程度的變化，這些變化可能對疾病的防御產(chǎn)生積極的影響。

2.3.4beta多樣性分析

分別利用差異性矩陣熱圖(圖9)、多樣品相似度樹狀圖(圖10)和pcoa散點(diǎn)圖(圖11)表示各樣本之間的相似度，在矩陣熱圖中，顏色代表樣本距離值，顏色越紅代表樣本相似度越高，顏色越藍(lán)則表示相似性越低；pcoa散點(diǎn)圖中，樣品組成越相似，其在圖中的距離約近。由圖9、圖10、和圖11中可以看出，各組的小腸細(xì)菌結(jié)構(gòu)，羅勒組和肉豆蔻+羅勒組與空白組群落結(jié)構(gòu)相似，和攻毒對照組差別較大。其他幾各治療組和攻毒對照組相似性接種近。盲腸中，各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)很相似。

各組盲腸腸道菌群結(jié)構(gòu)很相似。這說明由于壞死性腸炎病變主要發(fā)生在小腸段，產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻毒沒有對盲腸段產(chǎn)生明顯的影響。另外由于代謝吸收等作用，至盲腸植物精油的含量減小，作用也相應(yīng)減少了。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所

<120>百里香復(fù)方植物精油在防治雞壞死性腸炎中的應(yīng)用

<130>

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<213>人工序列

<400>3

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<210>4

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<400>4

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<400>5

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<210>9

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<400>10

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