本發(fā)明涉及心血管植入物、心血管輔助裝置的表面生物改性方法，具體涉及一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原位內(nèi)皮化可以通過兩種方式實現(xiàn)，當(dāng)植入物表面在未接種內(nèi)皮細胞(ecs)情況下，可以通過促進周圍血管組織的ecs遷移、粘附和增殖方式在植入物表面形成一層抗凝的內(nèi)皮層；另一種是通過動員和捕獲外周血中的內(nèi)皮祖細胞(epcs)到植入物表面；粘附、增殖并最后分化成ecs，從而促進內(nèi)皮層的形成；同時這些epcs也參與血管組織的損傷修復(fù)及血管重建；促進epcs動員、歸巢及分化的細胞因子和趨化因子有很多，例如csf3、辛伐他汀(simvastatin)、ccl2、epo、tymp、egf、cxcl12(c-x-c趨化因子配體12，即sdf-1α)；其中cxcl12是一種廣泛使用的促進epc動員、歸巢及分化成ec的趨化因子；可溶性semaphorin4d(sema4d)是一種促進ec遷移的細胞因子，能促進血管形成的發(fā)生。

肝素(heparin)是細胞外基質(zhì)(ecm)中廣泛存在的葡萄糖胺聚糖，通過戊多糖結(jié)構(gòu)與抗凝血酶結(jié)合，抑制凝血酶活性，進而抑制纖維蛋白及相關(guān)凝血因子形成，臨床上常被用作抗凝劑；主要用于治療血栓癥、血栓靜脈炎及血栓栓塞癥；肝素結(jié)構(gòu)中含有大量的硫酸根基團，是目前發(fā)現(xiàn)的負(fù)電性最強的生物分子，這種強負(fù)電性使得肝素還能結(jié)合多種蛋白、血小板、ecs以及其他循環(huán)細胞，發(fā)揮促血管形成或抗血管形成的作用；但是肝素的促血管形成或抗血管形成作用強烈依賴于結(jié)合的蛋白種類，當(dāng)與血管生成因子、纖維母細胞生長因子(fgfs)、胎盤生長因子(pigf)、組織因子(tf)以及血管內(nèi)皮生長因子a(vegfa)等蛋白結(jié)合時將發(fā)揮促血管形成作用；但當(dāng)與血管他丁、內(nèi)皮他丁、干擾素-γ-誘導(dǎo)蛋白-10(ip-10)、血小板反應(yīng)素ⅰ和ⅱ(tsp-ⅰ和tsp-ⅱ)結(jié)合時將產(chǎn)生抗血管形成的作用；當(dāng)血管受損時，激活的血小板能夠釋放1000多種活性分子，其中包含sema4d和cxcl12；作為細胞外基質(zhì)(ecm)的構(gòu)成組分，在正常生理狀態(tài)下肝素有機會同時和sema4d、cxcl12結(jié)合而產(chǎn)生相應(yīng)的生理學(xué)功能；肝素能夠促進成血管生長因子和相應(yīng)受體間的識別與結(jié)合，激活相應(yīng)的受體信號通路，從而促進體內(nèi)血管移植表面的內(nèi)皮化；目前還沒有發(fā)現(xiàn)將肝素同時與sema4d和cxcl12結(jié)合用于心血管材料的技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法，包括以下步驟：

(1)將基材拋光清洗后用2-3mol/l的naoh活化8-16h，單蒸水超聲清洗后浸入雙蒸水，80℃下反應(yīng)12h，單蒸水超聲清洗后，干燥；

(2)將步驟(1)中經(jīng)過處理的基材用2-5mg/ml的多賴氨酸，在4℃條件下浸沒處理12h，pbs清洗后待用；

(3)將濃度為100-400ng/ml的sema4d溶液與濃度為10mg/ml的heparin肝素溶液等體積混合，37℃條件下反應(yīng)1-3h得到sema4d/heparin復(fù)合物；

(4)將步驟(2)中處理的基材浸入步驟(3)得到的sema4d/heparin復(fù)合物中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h后將基材進行清洗；

(5)將步驟(4)中的基材浸入200-400ng/ml的cxcl12溶液中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h，pbs清洗后既得目標(biāo)產(chǎn)物。

進一步的，所述基材包括鈦及鈦合金。

進一步的，所述涂層的應(yīng)用，用于心血管植入器械表面。

進一步的，所述涂層的應(yīng)用，用于抗凝。

進一步的，所述涂層的應(yīng)用，用于促進血管的原位內(nèi)皮化。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明能夠較好的模擬機體時序應(yīng)答血管原位內(nèi)皮化進程，肝素作為抗凝劑能夠抑制體內(nèi)血栓形成，抑制血小板和纖維蛋白在材料表面的激活和粘附；sema4d、cxcl12分子均為血小板激活后所釋放的促進內(nèi)皮再生的生物因子，具有協(xié)同促進內(nèi)皮化的作用，能夠促進快速原位內(nèi)皮化；

(2)本發(fā)明將肝素和多種因子結(jié)合并固定在材料表面，肝素能延緩生物因子的半衰期，生理環(huán)境下能夠?qū)ι镆蜃悠鸬奖Ｗo，避免生物因子被蛋白酶降解，同時促進生物因子與受體間的識別與結(jié)合，保證生物因子功能的發(fā)揮；

(3)本發(fā)明制備工藝簡單、易于操作、無需昂貴復(fù)雜的設(shè)備，適用于各種復(fù)雜的心血管植入器械如血管支架、血栓濾器等具有抗凝/促進內(nèi)皮遷移要求的表面。

附圖說明

圖1為本發(fā)明涂層制備流程示意圖。

圖2為本發(fā)明中實施例1制備的涂層與對比例1的xps圖譜。

圖3為本發(fā)明中實施例1制備的涂層與對比例1的xps中c1s的高分辨圖譜。

圖4為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2血小板粘附情況的熒光顯微鏡圖。

圖5為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2血小板粘附情況的sem圖。

圖6為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2表面內(nèi)皮細胞遷移的熒光圖。

圖7為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2對內(nèi)皮祖細胞捕獲的熒光顯微圖。

圖8為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2對內(nèi)皮祖細胞捕獲的sem圖。

圖9為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2植入體內(nèi)的蘇木精-伊紅(he)染色圖。

圖10為本發(fā)明實施例1制備的涂層與對比例1和對比例2植入體內(nèi)后的免疫熒光圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

如圖1所示，一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法，包括以下步驟：

(1)將基材拋光清洗后用2-3mol/l的naoh活化8-16h，單蒸水超聲清洗后浸入雙蒸水，80℃下反應(yīng)12h，單蒸水超聲清洗后，干燥；

(2)將步驟(1)中經(jīng)過處理的基材用2-5mg/ml的多賴氨酸(pll，mw150-300kda)，在4℃條件下浸沒處理12h，pbs清洗后待用；

(3)將濃度為100-400ng/ml的sema4d溶液與濃度為10mg/ml的heparin肝素溶液等體積混合，37℃條件下反應(yīng)1-3h得到sema4d/heparin復(fù)合物；

(4)將步驟(2)中處理的基材浸入步驟(3)得到的sema4d/heparin復(fù)合物中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h后將基材進行清洗；

(5)將步驟(4)中的基材浸入200-400ng/ml的cxcl12溶液(溶劑為ph＝7.4的pbs)中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h，pbs清洗后既得目標(biāo)產(chǎn)物。

進一步的，所述基材包括鈦及鈦合金。

進一步的，用于心血管植入器械表面。

進一步的，用于抗凝。

進一步的，用于促進血管的內(nèi)皮化進程。

實施例1

一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法，包括以下步驟：

(1)將純鈦基材拋光清洗后用2-3mol/l的naoh活化8-16h，單蒸水超聲清洗后浸入雙蒸水，80℃下反應(yīng)12h，單蒸水超聲清洗后，干燥；

(2)將步驟(1)中經(jīng)過處理的基材用2mg/ml的多賴氨酸(pll，mw150-300kda)，在4℃條件下浸沒處理12h，pbs清洗后待用；

(3)將濃度為200ng/ml的sema4d溶液與濃度為10mg/ml的heparin肝素溶液等體積混合，37℃條件下反應(yīng)1-3h得到sema4d/heparin復(fù)合物；

(4)將步驟(2)中處理的基材浸入步驟(3)得到的sema4d/heparin復(fù)合物中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h后將基材進行清洗；

(5)將步驟(4)中的基材浸入200ng/ml的cxcl12溶液(溶劑為ph＝7.4的pbs)中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h，pbs清洗后既得目標(biāo)產(chǎn)物。

本實施例制備的樣品用c200表示。

實施例2

一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法，包括以下步驟

(1)將純鈦基材拋光清洗后用2-3mol/l的naoh活化8-16h，單蒸水超聲清洗后浸入雙蒸水，80℃下反應(yīng)12h，單蒸水超聲清洗后，干燥；

(2)將步驟(1)中經(jīng)過處理的基材用5mg/ml的多賴氨酸，在4℃條件下浸沒處理12h，pbs清洗后待用；

(3)將濃度為400ng/ml的sema4d溶液與濃度為10mg/ml的heparin肝素溶液等體積混合，37℃條件下反應(yīng)1-3h得到sema4d/heparin復(fù)合物；

(4)將步驟(2)中處理的基材浸入步驟(3)得到的sema4d/heparin復(fù)合物中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h后將基材進行清洗；

(5)將步驟(4)中的基材浸入400ng/ml的cxcl12溶液中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h，pbs清洗后既得目標(biāo)產(chǎn)物。

實施例3

一種sema4d和cxcl12雙分子協(xié)同促原位內(nèi)皮化涂層的制備方法，包括以下步驟：

(1)將純鈦基材拋光清洗后用2-3mol/l的naoh活化8-16h，單蒸水超聲清洗后浸入雙蒸水，80℃下反應(yīng)12h，單蒸水超聲清洗后，干燥；

(2)將步驟(1)中經(jīng)過處理的基材用2.5mg/ml的多賴氨酸(pll，mw150-300kda)，在4℃條件下浸沒處理12h，pbs清洗后待用；

(3)將濃度為200ng/ml的sema4d溶液與濃度為10mg/ml的heparin肝素溶液等體積混合，37℃條件下反應(yīng)1-3h得到sema4d/heparin復(fù)合物；

(4)將步驟(2)中處理的基材浸入步驟(3)得到的sema4d/heparin復(fù)合物中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h后將基材進行清洗；

(5)將步驟(4)中的基材浸入200ng/ml的cxcl12溶液(溶劑為ph＝7.4的pbs)中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h，pbs清洗后既得目標(biāo)產(chǎn)物。

對比例1

(1)將純鈦基材拋光清洗后用2-3mol/l的naoh活化8-16h，單蒸水超聲清洗后浸入雙蒸水，80℃下反應(yīng)12h，單蒸水超聲清洗后，干燥；

(2)將步驟(1)中經(jīng)過處理的基材用2mg/ml的多賴氨酸(pll，mw150-300kda)，在4℃條件下浸沒處理12h，pbs清洗后待用；

(3)將濃度為200ng/ml的sema4d溶液與濃度為10mg/ml的heparin肝素溶液等體積混合，37℃條件下反應(yīng)1-3h得到sema4d/heparin復(fù)合物；

(4)將步驟(2)中處理的基材浸入步驟(3)得到的sema4d/heparin復(fù)合物中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h后將基材進行清洗；

(5)將步驟(4)中的基材浸入0ng/ml的cxcl12溶液(溶劑為ph＝7.4的pbs)中，在4℃條件下反應(yīng)12-24h，pbs清洗后既得目標(biāo)產(chǎn)物。

本實施例制備的樣品用c0表示。

對比例2

對比例2為純鈦基材未經(jīng)任何處理，用ti表示。

將實施例1、對比例1中制得的樣品進行xps測試，結(jié)果如圖2和圖3所示，從圖中可以看出cxcl12的修飾能減少表面肝素的量，增加表面蛋白質(zhì)含量，表明sema4d-cxcl12涂層修飾成功。

將新鮮人源血液在1500r/m離心15min得到血小板富集的血漿，將血漿與實施例1、對比例1和對比例2中制得的樣品進行共同孵育；37℃下1小時，清洗后觀察血小板在不同樣品材料表面的粘附激活情況；圖4為其熒光顯微圖，圖5為其掃描電子顯微鏡圖sem；從圖中可以看出，因為cxcl12的修飾會消耗表面的肝素，故引入cxcl12后c200樣品會引起血小板粘附的增加；總體講c0和c200改性樣品的血小板粘附數(shù)量小于純鈦表面，表明改性樣品的血液相容性得到改善和提高。

將實施例1、對比例1和對比例2制備的樣品制備成90°的樣品，一邊為純鈦另一邊為表面制備了涂層的樣品；首先讓內(nèi)皮細胞在純鈦一側(cè)生長至80％-90％滿；然后將樣品90°翻轉(zhuǎn)讓表面制備了涂層的樣品平鋪；細胞會向改性一側(cè)繼續(xù)遷移生長，孵育12h；圖6為其熒光顯微圖；從圖6可以看出，相比于純鈦材料，c0上細胞的遷移距離有一定的提高，但是引入cxcl12的c200樣品能夠進一步提高內(nèi)皮祖細胞在材料表面的遷移，說明sema4d和cxcl12具有很好的協(xié)同促進作用，能夠提高原位內(nèi)皮化進程。

將實施例1、對比例1和對比例2制備的樣品分別置于導(dǎo)管中并緊貼導(dǎo)管壁，兔子麻醉并分離頸動脈，將頸動脈血引流經(jīng)過樣品后導(dǎo)回至頸靜脈，這個過程持續(xù)90min；清洗表面殘留血液后將樣品收集固定；試驗中所有與血液接觸的物品均需無菌處理并用肝素(150u/ml)潤洗(樣品除外)；圖7為其熒光顯微圖，其中cd34為內(nèi)皮祖細胞表面特異性抗體，用于鑒定材料對內(nèi)皮祖細胞的捕獲能力；圖8為樣品的sem圖；從圖中可以看出與ti和c0相比，引入cxcl12的c200能夠提高對內(nèi)皮祖細胞的捕獲，說明sema4d和cxcl12具有協(xié)同促進原位內(nèi)皮化的能力；其中圖中dapi指熒光染料，用于細胞核的染色，用于內(nèi)皮祖細胞的計數(shù)；merge圖為dapi和cd34染色細胞后的合成圖。

將實施例1、對比例1和對比例2中的基材制備成2-3cm的樣品；將樣品經(jīng)上述處理后植入小鼠腹主動脈內(nèi)部并于腹主動脈內(nèi)壁相貼；3周后將樣品連同腹主動脈一起截取并固定，石蠟包埋前將樣品小心取出后將組織切片并染色；圖9為蘇木精-伊紅(he)染色圖；從圖中可以看出ti會導(dǎo)致腹主動脈組織過度增殖和鋪展，嚴(yán)重影響血管的有效血流面積；c0和c200樣品對血管的組織增殖影響較小，新生血管組織所占血管整體面積比例較??；c200形成的新生組織最少，對正常血管的影響最?。粓D10為免疫熒光圖，圖中，α-sma和cd31分別用于標(biāo)記平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞；其中圖中dapi指熒光染料，用于細胞核的染色；merge圖為dapi、α-sma和cd31染色細胞后的合成圖；相比于ti，sema4d-cxcl12的c200涂層材料能形成較完整的內(nèi)皮細胞層和較少的平滑肌細胞；說明c200涂層材料能夠加速原位內(nèi)皮化同時減少組織增生；相對于c200，c0形成的內(nèi)皮層較不完整，而且增生組織中平滑肌細胞較多；整體而言原位內(nèi)皮化效果不如c200，說明樣品引入cxcl12后，能與sema4d協(xié)同促進原位內(nèi)皮化。

本發(fā)明中sema4d和肝素在中性ph條件下攜帶不同電荷，靜電結(jié)合形成特定的蛋白糖復(fù)合物(即sema4d/heparin復(fù)合物)，富-oh層能夠?qū)⒏话被膒ll固定于材料表面，pll上的氨基能與sema4d/heparin復(fù)合物表面上的肝素分子通過特定的離子作用結(jié)合，從而將sema4d/heparin復(fù)合物固定在材料表面；sema4d主要作用于內(nèi)皮細胞，能夠促進內(nèi)皮細胞的粘附、遷移及增殖，而cxcl12主要有促進內(nèi)皮祖細胞(epcs)的動員和歸巢及促進內(nèi)皮祖細胞(epcs)向內(nèi)皮細胞分化的作用，兩種分子共同存在能夠促進快速原位內(nèi)皮化；肝素不僅能夠?qū)Ψ肿舆M行固定，還能對分子進行保護，并且促進分子與受體間的識別，肝素的存在模擬了細胞外基質(zhì)中的蛋白聚糖部分，肝素的強負(fù)電性能夠進一步吸引并固定cxcl12，并對cxcl12進行保護，同時促進cxcl12與相應(yīng)受體的結(jié)合，很好模擬細胞外基質(zhì)的作用。

本發(fā)明創(chuàng)造性的將肝素與多種因子結(jié)合并固定在材料表面，肝素能延緩生物因子的半衰期，生理環(huán)境下能夠?qū)ι镆蜃悠鸬奖Ｗo，避免生物因子被蛋白酶降解，同時促進生物因子與受體間的識別與結(jié)合，保證生物因子功能的發(fā)揮；構(gòu)建促原位內(nèi)皮化涂層能夠較好的模擬機體時序應(yīng)答血管原位內(nèi)皮化過程；首先，肝素作為抗凝劑能夠抑制體內(nèi)血栓形成，抑制血小板和纖維蛋白在材料表面的激活和粘附；其次，sema4d、cxcl12分子均為血小板激活后所釋放的促進內(nèi)皮再生的生物因子，具有協(xié)同促進原位內(nèi)皮化的作用；sema4d能夠激活t細胞啟動(tcellpriming)，促進b細胞增殖和抗體產(chǎn)生，產(chǎn)生正向免疫調(diào)控作用，同時通過受體plexinb1促進內(nèi)皮細胞粘附和增殖，促進損傷血管內(nèi)皮化；而cxcl12能夠動員和捕獲epcs，并促進epcs增殖分化形成內(nèi)皮，從而促進血管的內(nèi)皮化進程。促原位內(nèi)皮化涂層構(gòu)建工藝簡單易于操作，無需昂貴復(fù)雜的設(shè)備，浸沒固定生物分子的方法保證樣品表面生物分子均勻覆蓋，適用于各種復(fù)雜的心血管植入器械如血管支架、血栓濾器等具有抗凝/促進內(nèi)皮遷移要求的表面。