本發(fā)明屬于生物組織工程細胞載體材料，涉及一種髓核細胞源性活性微載體的構(gòu)建方法，是一種新型細胞載體。

背景技術(shù)：

椎間盤退行性病變是目前社會的常見病，但當前卻無有效手段從病因上修復退變?；诮M織工程的椎間盤修復是目前治療椎間盤退變的新思路，適當?shù)募毎d體搭載間充質(zhì)干細胞后，可誘導間充質(zhì)干細胞向髓核細胞分化，從而修復退變的椎間盤。目前細胞載體的研究處于瓶頸期，以高分子聚合物為原料的細胞載體在體內(nèi)椎間盤環(huán)境中的降解產(chǎn)物易加劇椎間盤的惡劣環(huán)境，不利于椎間盤修復。網(wǎng)狀或纖維網(wǎng)狀的生物大分子材料在植入體內(nèi)時需要有開放性切口，破壞了椎間盤天然密閉微環(huán)境，同樣缺陷明顯。凝膠狀的生物大分子材料雖然具有可注射特性，植入過程中避免了椎間盤結(jié)構(gòu)的破壞，但水凝膠的彈性模量遠低于天然椎間盤，無法為搭載于其中的干細胞提供原生態(tài)微環(huán)境，導致干細胞定向分化能力減弱，不利于退變椎間盤的修復。而為了優(yōu)化材料的理化特性，往往需要加入許多化學試劑，容易導致生物材料活性的降低，影響最后載體的促干細胞分化的效果。在椎間盤的主要結(jié)構(gòu)髓核中，主要細胞成分為髓核細胞，其分泌的細胞外基質(zhì)成分構(gòu)成了正常髓核環(huán)境，利用髓核細胞這一特性，可一改原先通過物理或化學方法構(gòu)建細胞載體的傳統(tǒng)思路，通過生物的方法在體外構(gòu)建出一種髓核細胞源性的具有生物活性的原生態(tài)干細胞載體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種髓核細胞源性活性微載體構(gòu)建方法，是一種為了得到能搭載干細胞且能通過注射進入生物體內(nèi)的細胞載體，該載體是用于負載干細胞從而進行退變椎間盤體內(nèi)修復的。

本發(fā)明提供的細胞載體利用髓核細胞自身分泌能力構(gòu)建，通過以下步驟實現(xiàn)：首先從大鼠體內(nèi)獲得髓核細胞，體外擴增至一定數(shù)量后利用離心法構(gòu)建出髓核細胞微球，在含有特定的生長因子的環(huán)境中培養(yǎng)12天，使髓核細胞分泌足夠的細胞外基質(zhì)成分。通過聯(lián)合使用脫細胞劑將細胞微球中原有的髓核細胞組分除去，從而獲得一種由髓核細胞自身分泌的基質(zhì)構(gòu)成的髓核細胞源性活性微載體。

具體構(gòu)建方法如下：

(1)髓核細胞微球制備

取sd大鼠髓核細胞，體外使用f12培養(yǎng)基擴增至第3代，取4×10^{^5}個髓核細胞使用1mlf12培養(yǎng)基(含3151mg/ld-葡萄糖，365mg/ll-谷氨酰胺，55mg/l丙酮酸鈉，2438mg/l碳酸氫鈉，100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，ph7.0-7.4)重懸，并置于15ml離心管，通過離心富集法在1000rpm下離心5分鐘，在f12培養(yǎng)基中靜置24h，利用髓核細胞自卷曲能力獲得髓核細胞微球；

(2)髓核細胞微球基質(zhì)合成

更換髓核細胞微球的培養(yǎng)環(huán)境：dmem高糖培養(yǎng)基(含4500mg/ld-葡萄糖，584mg/ll-谷氨酰胺，110mg/l丙酮酸鈉，1.5g/l碳酸氫鈉，100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，ph7.0-7.2)中添加特定生長因子(10ng/ml的tgf-β3，10％胎牛血清，50nm維生素c)，于37℃，5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)12天，每3天換一次液，促進髓核細胞微球中基質(zhì)產(chǎn)生和沉積；(3)獲得髓核細胞源性活性微載體

首先，聯(lián)合使用脫細胞劑2％triton-100和50mm的sb-10對培養(yǎng)后的髓核細胞微球進行脫細胞處理，37℃恒溫搖床中以100轉(zhuǎn)/分鐘的速率處理1小時，在脫去髓核細胞后利用720mu/ml脫氧核糖核酸酶和720mu/ml核糖核酸酶對殘留核酸成分進行滅活，最后使用磷酸鹽緩沖液在先前搖床環(huán)境下對獲得的微載體清洗3次，每次5分鐘，從而獲得一種由髓核細胞自身分泌的基質(zhì)構(gòu)成的髓核細胞源性活性微載體。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述的活性微載體在負載干細胞中應用。

本發(fā)明方法能得到具有高效誘導干細胞成髓核細胞定向分化的載體材料；獲得的細胞載體所含成分由髓核細胞自身合成，符合椎間盤原生態(tài)微環(huán)境；避免了載體構(gòu)建過程中所引入的化學成分對載體生物活性的破壞，不含其他高分子材料，避免了載體降解產(chǎn)物對椎間盤環(huán)境的影響。

附圖說明

圖1是髓核細胞源性活性微載體構(gòu)建流程示意圖。

圖2髓核細胞源性活性微載體對載荷干細胞增殖能力和細胞毒性的效應。

圖3基質(zhì)相關(guān)基因檢測。其中a：acan，b：col2，c：sox9為髓核細胞功能基因標記物，與干細胞細胞外基質(zhì)分泌能力相關(guān)，高表達說明細胞外基質(zhì)合成能力增強。

圖4分化相關(guān)基因檢測。其中a：krt19為髓核細胞特異性基因標記物，表達量高說明髓核細胞分化效率高，b：col1為軟骨細胞基因標記物，表達量低表明干細胞向軟骨細胞表型分化較少。

圖5髓核細胞源性活性微載體的掃描電子顯微鏡照片。a：低倍鏡下微球微觀結(jié)構(gòu)全態(tài)(×400)；b：高倍鏡下表面形貌(×1000)。

圖6髓核細胞源性活性微載體載荷間充質(zhì)干細胞后對sd大鼠退變椎間盤的修復作用。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作出進一步的具體說明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。實施例1：欲以4×10^{^5}個髓核細胞構(gòu)建髓核細胞源性活性微載體。

參見圖1，取體外擴增的4×10^{^5}個第3代sd大鼠髓核細胞，使用1mlf12培養(yǎng)基重懸后置于15ml離心管，通過離心富集法在1000rpm下離心5分鐘，在f12培養(yǎng)基中靜置24h，利用髓核細胞自卷曲能力獲得髓核細胞微球。更換髓核細胞微球的培養(yǎng)環(huán)境：dmem高糖培養(yǎng)基中添加10ng/ml的tgf-β3，10％胎牛血清，50nm維生素c。于37℃，5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)12天，每3天換一次液，促進髓核細胞微球中基質(zhì)產(chǎn)生和沉積。聯(lián)合使用脫細胞劑2％triton-100和50mm的sb-10對培養(yǎng)后的髓核細胞微球進行脫細胞處理，37℃恒溫搖床中以100轉(zhuǎn)/分鐘的速率處理1小時。在脫去髓核細胞后利用720mu/ml脫氧核糖核酸酶和720mu/ml核糖核酸酶對殘留核酸成分進行滅活。最后使用磷酸鹽緩沖液在先前搖床環(huán)境下對獲得的微載體清洗3次，每次5分鐘，從而獲得一種由髓核細胞自身分泌的基質(zhì)構(gòu)成的髓核細胞源性活性微載體。

實施例2：欲以8×10^{^5}個髓核細胞構(gòu)建髓核細胞源性活性微載體。

參見圖1，取體外擴增的8×10^{^5}個第3代sd大鼠髓核細胞，使用2mlf12培養(yǎng)基重懸，并平均分裝至2管15ml離心管，使每管離心管中細胞數(shù)量為4×10^{^5}個。通過離心富集法在1000rpm下離心5分鐘，在f12培養(yǎng)基中靜置24h，利用髓核細胞自卷曲能力獲得髓核細胞微球。更換髓核細胞微球的培養(yǎng)環(huán)境：dmem高糖培養(yǎng)基中添加10ng/ml的tgf-β3，10％胎牛血清，50nm維生素c。于37℃，5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)12天，每3天換一次液，促進髓核細胞微球中基質(zhì)產(chǎn)生和沉積。聯(lián)合使用脫細胞劑2％triton-100和50mm的sb-10對培養(yǎng)后的髓核細胞微球進行脫細胞處理，37℃恒溫搖床中以100轉(zhuǎn)/分鐘的速率處理1小時。在脫去髓核細胞后利用720mu/ml脫氧核糖核酸酶和720mu/ml核糖核酸酶對殘留核酸成分進行滅活。最后使用磷酸鹽緩沖液在先前搖床環(huán)境下對獲得的微載體清洗3次，每次5分鐘，從而獲得一種由髓核細胞自身分泌的基質(zhì)構(gòu)成的髓核細胞源性活性微載體。

實施例3：髓核細胞源性活性微載體體外活性驗證。

通過如前所述步驟獲得髓核細胞源性活性微載體后，在體外載荷間充質(zhì)干細胞，將所獲得的髓核細胞源性活性微載體置于培養(yǎng)皿中，滴加2ul含有5*10^{^4}間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)基，37℃靜置2h后使間充質(zhì)干細胞充分負載至髓核細胞源性活性微載體表面，轉(zhuǎn)移微球至dmem低糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14天后檢測干細胞增殖活性，并進行基因水平檢測，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞種植于髓核細胞源性活性微載體后其增殖能力較平面培養(yǎng)和殼聚糖水凝膠載體培養(yǎng)增強(見圖2a)，髓核細胞源性活性微載體對載荷的干細胞不產(chǎn)生細胞毒性(見圖2b)，基質(zhì)合成能力增強(見圖3)，髓核細胞表型分化能力增強(見圖4)。

實施例4：髓核細胞源性活性微載體大鼠體內(nèi)活性驗證。

對獲得的髓核細胞源性活性微載體進行掃描電子顯微鏡觀察，測定微載體直徑。在已構(gòu)建的椎間盤退變大鼠模型中通過注射器將髓核細胞源性活性微載體連同間充質(zhì)干細胞注射入退變椎間盤，8周后對大鼠進行mri拍攝，明確椎間盤含水量，處死后取材，通過he染色，so染色明確椎間盤內(nèi)基質(zhì)含量，評估退變椎間盤修復效果。結(jié)果顯示微載體直徑約為200ul(見圖5)，復合可注射標準，mri結(jié)果提示大鼠椎間盤水含量較退變對照組有所提高，椎間盤得到修復。he染色與so染色結(jié)果提示椎間盤基質(zhì)含量較退變組明顯提升，椎間盤髓核形態(tài)得到恢復(見圖6)，證明該髓核細胞源性活性微載體搭載間充質(zhì)干細胞后具有體內(nèi)修復效果。