本發(fā)明涉及透皮給藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片及其制備方法。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，op)是常見(jiàn)的老年性疾病，隨著中國(guó)人口老齡化的加劇，患有骨質(zhì)疏松的患者也在成倍上升，給社會(huì)、患者及患者家庭帶來(lái)了嚴(yán)重的困擾。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨吸收大于骨重建的負(fù)平衡導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低、骨脆性增加為特征的全身性骨骼系統(tǒng)退化性病變，其臨床表現(xiàn)和體征多為骨骼疼痛、骨折、駝背和身材變矮。發(fā)生骨折后1年之內(nèi)，患者死于各種并發(fā)癥者達(dá)20％，存活的50％致殘，因此治療骨質(zhì)疏松是非?，F(xiàn)實(shí)和重要的問(wèn)題。其治療方法主要是減少骨質(zhì)丟失，維持或增加骨密度(bmd)。降鈣素(calcitonin,ct)是調(diào)節(jié)骨代謝的激素之一，是由甲狀腺濾泡旁細(xì)胞分泌的激素，是一種含有32個(gè)氨基酸殘基的多肽激素，通過(guò)1,7位半胱氨酸(cys)形成的二硫鍵和脯氨酰胺羧端是其結(jié)構(gòu)的共同特征。天然降鈣素可由不同種屬動(dòng)物分離得到，其中以魚(yú)等脊椎動(dòng)物的活性最強(qiáng)，哺乳類動(dòng)物的活性較弱。目前應(yīng)用于臨床的主要有合成的人降鈣素(hct)，豬降鈣素(pct)，鮭魚(yú)降鈣素(sct)以及依降鈣素(ect)等。其中，鮭魚(yú)降鈣素(salmoncalcitonin，sct)的生物活性最高(4000iu/mg-7000iu/mg)，相當(dāng)于人降鈣素生物活性(200iu/mg)的30-40倍；半衰期為50-80min，為人降鈣素的3～6倍。sct分子式為c145h240n44o48s2，相對(duì)分子質(zhì)量3431.85，等電點(diǎn)9.3，易溶于水，不易溶于乙醇等有機(jī)溶劑。鮭魚(yú)降鈣素是從鮭魚(yú)中提取的一種具有抑制骨吸收、促進(jìn)骨重建的肽類激素。它通過(guò)作用于破骨細(xì)胞受體抑制破骨細(xì)胞的活性和減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞功能而抑制骨的吸收；同時(shí)可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性及數(shù)量來(lái)促進(jìn)骨的生成。鮭魚(yú)降鈣素還具有中樞抑制作用，它可以減輕患者疼痛，增強(qiáng)患者順應(yīng)性，提高患者生活質(zhì)量。與其他生物技術(shù)藥物一樣，sct理化性質(zhì)不穩(wěn)定，口服生物利用度低，臨床主要采用注射給藥。由于注射給藥具有血藥濃度波動(dòng)較大，患者順應(yīng)性較差，給藥需要專業(yè)人員操作等缺陷，近年來(lái)非注射途徑給藥研究受到關(guān)注，主要有胃腸道、鼻腔、肺部、經(jīng)皮、直腸等給藥途徑，鮭魚(yú)降鈣素目前主要通過(guò)注射給藥，由于沒(méi)有替代的給藥途徑，長(zhǎng)期注射對(duì)病患造成了極大的不便和痛苦。微痛或無(wú)痛且可以自行施用的可溶性微針貼片是解決此問(wèn)題很好的途徑。可溶微針主要以微針貼片的形式給藥，包括基層貼片和連接在貼片平面上的多個(gè)可溶微針，微針貼片的大小和微針的數(shù)量可以根據(jù)具體給藥劑量和給藥部位調(diào)節(jié)?；鶎右话悴缓幬?，可以由可溶性或者不溶性材料制成，與微針能很好的融合成一體，充當(dāng)給藥時(shí)施加壓力的平臺(tái)?？扇芪⑨樦械乃幬铮S微針插入皮膚，遇組織液溶解從而主動(dòng)傳遞藥物至皮內(nèi)，溶解的水溶性可生物降解的微針材料在皮內(nèi)降解消除，基層則在給藥后剝離皮膚?？扇芪⑨樔芙膺^(guò)程中微針內(nèi)藥物全部釋放，可以通過(guò)控制微針的載藥量實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)敷貼和定量給藥；微針的溶解也可以解決給藥后針頭的醫(yī)療廢品二次危害等問(wèn)題。目前還沒(méi)有鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針的相關(guān)研究的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片，用于治療骨質(zhì)疏松癥。具體技術(shù)方案如下：一種鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片，由基底與針體組成，所述針體是由鮭魚(yú)降鈣素、右旋糖酐和海藻糖的混合溶液制備而成，所述鮭魚(yú)降鈣素、右旋糖酐和海藻糖的質(zhì)量比為1：5-20:4-8；所述基底由水溶性高分子材料的溶液制備而成。在其中一些實(shí)施例中，所述鮭魚(yú)降鈣素、右旋糖酐和海藻糖的質(zhì)量比為1：9-11:4-6。在其中一些實(shí)施例中，所述鮭魚(yú)降鈣素、右旋糖酐和海藻糖的質(zhì)量比為1：10:5。在其中一些實(shí)施例中，所述右旋糖酐為右旋糖酐40，所述海藻糖為d-海藻糖二水。在其中一些實(shí)施例中，所述右旋糖酐40的分子量為32000～42000。在其中一些實(shí)施例中，所述混合溶液的溶劑為水，所述混合溶液中鮭魚(yú)降鈣素、右旋糖酐和海藻糖的總濃度為0.5-1.0g/ml。在其中一些實(shí)施例中，所述混合溶液中鮭魚(yú)降鈣素、右旋糖酐和海藻糖的總濃度為0.75-0.85g/ml。在其中一些實(shí)施例中，所述水溶性高分子材料為聚乙烯吡咯烷酮。在其中一些實(shí)施例中，所述基底由聚乙烯吡咯烷酮k90(pvpk90)的乙醇溶液制備而成。在其中一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液中pvpk90的濃度為0.2-0.5g/ml。在其中一些實(shí)施例中，所述pvpk90的分子量為600000-1300000。本發(fā)明還提供了上述鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備方法。具體技術(shù)方案如下：一種鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備方法，包括以下步驟：(1)將所述鮭魚(yú)降鈣素、海藻糖和右旋糖酐溶解在溶劑中，溶脹過(guò)夜，所得溶液a作為針體制作液；(2)將所述水溶性高分子材料溶解在溶劑中，溶脹過(guò)夜，所得溶液b作為基底液；(3)將所述針體制作液加入陰模模具中，離心，去除陰模模具上方多余的針體制作液；(4)將所述基底液加入步驟(3)中的覆蓋針體制作液的陰模模具中，離心；(5)將覆蓋有基底液的陰模模具干燥，即得所述鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片。在其中一些實(shí)施例中，所述離心的力為2800-3200g，溫度為0-8℃，離心時(shí)間為5-15min。在其中一些實(shí)施例中，所述干燥包括將覆蓋有基底液的陰模模具置于溫度為10～30℃、濕度為8-12％的干燥器中干燥20-28h。本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片及其制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明從大量的微針骨架材料中篩選得到右旋糖酐，發(fā)現(xiàn)以右旋糖酐為微針針體的骨架材料，并且在骨架材料中添加特定量的穩(wěn)定劑海藻糖，可以制備得到機(jī)械強(qiáng)度好，穩(wěn)定性好的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片。海藻糖的添加有利于提高鮭魚(yú)降鈣素的穩(wěn)定性以及微針的經(jīng)皮釋藥效率，提高鮭魚(yú)降鈣素的生物利用度，獲得更高的降血鈣效果。本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片具有良好的機(jī)械性能，可以有效的穿透皮膚角質(zhì)層，深入皮內(nèi)溶解釋放藥物，顯著提高鮭魚(yú)降鈣素的體內(nèi)傳遞效率?？梢酝ㄟ^(guò)微針尺寸的控制，避開(kāi)真皮層內(nèi)豐富的毛細(xì)血管和神經(jīng)末梢，從而減少感染，降低或消除疼痛，提高患者順應(yīng)性和給藥安全性，產(chǎn)品方便于自行施用，避免了凍干類產(chǎn)品臨用配置，專業(yè)人員注射的要求。本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片，以固態(tài)形式存儲(chǔ)，有利于包載其中的鮭魚(yú)降鈣素的穩(wěn)定性，沒(méi)有過(guò)于苛刻的冷鏈儲(chǔ)存運(yùn)輸要求。在高溫低濕和常溫高濕的條件下儲(chǔ)存兩個(gè)月后，鮭魚(yú)降鈣素的含量均未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明本發(fā)明的可溶性微針貼片有助于鮭魚(yú)降鈣素的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片對(duì)大鼠進(jìn)行給藥后，大鼠血鈣水平與靜脈注射以及皮下注射組類似，生物利用度高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于凝膠經(jīng)皮敷貼組。本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備條件溫和，有利于鮭魚(yú)降鈣素載藥過(guò)程的穩(wěn)定性以及微針的規(guī)模化生產(chǎn)。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1制備的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的示意圖。圖2為實(shí)施例1制備的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的豬皮穿透情況圖。圖3為實(shí)施例5中各鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針受力前后形態(tài)和長(zhǎng)度的改變情況圖。圖4為實(shí)施例6中鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針帖片儲(chǔ)存后載藥量變化圖。圖5為實(shí)施例7中對(duì)照組血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線。圖6為實(shí)施例7中sct凝膠敷貼組血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線。圖7為實(shí)施例7中可溶性微針貼片組血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片及其制備方法做進(jìn)一步闡述。鮭魚(yú)降鈣素購(gòu)于成都凱捷生物科技有限公司。實(shí)施例1鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備本實(shí)施例的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備方法如下：(1)sct/dex-tre微針針體制作液：稱取2.5mgsct溶于50μl去離子水中，另取25mg右旋糖酐40(分子量為40000)，12.5mgd-海藻糖二水溶于上述溶液中，溶脹過(guò)夜，制得sct/dex-tre微針針體制作液。(2)空白基底溶液：將50mg聚乙烯基吡咯烷酮k90(pvpk90，分子量為1100000)溶于150μl乙醇中，攪拌均勻，溶脹過(guò)夜，制得空白基底溶液k90e。(3)微針貼片制備將sct/dex-tre微針針體制作液注入微針陰模中，在3000g力的作用下離心10min，離心溫度為4℃，待溶液注滿微針陰模的微孔，刮除陰模表面多余的溶液，回收利用。在完成了微針針體制作液注模的微針陰模上注入空白基底溶液k90e，在3000g力的作用下離心5min，離心溫度為4℃。然后室溫下在干燥器中干燥24h，干燥器內(nèi)的濕度為10％，即得所述鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片，記為sct/dex-tre/k90e。用掃描電鏡和電子顯微鏡觀察制得的sct/dex-tre/k90e微針貼片，所得微針貼片平整無(wú)氣泡，無(wú)色透明，表面光滑，微針矩陣規(guī)整，微針較硬，微針針形尺寸與模具吻合度高，見(jiàn)圖1。采用離體豬皮檢測(cè)sct/dex-tre/k90e微針貼片的機(jī)械性能，測(cè)試方法如下：西藏豬處死后，用電動(dòng)寵物剃毛刀剔除背部長(zhǎng)毛后改用電動(dòng)剃須刀剃凈短毛。剝離整塊背部皮膚，以刀片刮除皮下脂肪層，保留1.5mm厚度的皮膚。生理鹽水清洗后，分成小塊，可溶微針用雙面膠固定于質(zhì)構(gòu)儀的圓柱形探頭上，西藏豬離體皮膚角質(zhì)層向上鋪平于pdms平板，置于探頭正下方的不銹鋼平臺(tái)上。實(shí)驗(yàn)時(shí)，探頭以2mm/s的速度向不銹鋼平臺(tái)移動(dòng)，隨著微針接觸到皮膚角質(zhì)層，探頭探測(cè)到壓力變化，當(dāng)?shù)竭_(dá)0.05n的觸發(fā)壓力時(shí)，探頭改變速度為0.5mm/s繼續(xù)向下移動(dòng)，當(dāng)壓力升至10n時(shí)(0.1n/n)，探頭停止移動(dòng)，并保持30s。隨后，探頭反向平臺(tái)移動(dòng)，離開(kāi)不銹鋼平臺(tái)。立刻用0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液浸染皮膚表面，10min后除去皮膚表面的染色劑，并用棉球蘸生理鹽水擦拭干凈，觀察皮膚表面染色小孔的情況并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示能實(shí)現(xiàn)95％以上的微針穿透率，見(jiàn)圖2，說(shuō)明該微針具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，能夠有效穿透皮膚。實(shí)施例2本實(shí)施例的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備方法如下：(1)sct/dex-tre微針針體制作液：稱取2.7mgsct溶于50μl去離子水中，另取24.3mg右旋糖酐40(分子量為40000)，10.8mgd-海藻糖二水溶于上述溶液中，溶脹過(guò)夜，制得sct/dex-tre微針針體制作液。其它步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例3本實(shí)施例的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的制備方法如下：(1)sct/dex-tre微針針體制作液：稱取2.3mgsct溶于50μl去離子水中，另取25.3mg右旋糖酐40(分子量為40000)，13.8mgd-海藻糖二水溶于上述溶液中，溶脹過(guò)夜，制得sct/dex-tre微針針體制作液。其它步驟同實(shí)施例1。對(duì)比例1本對(duì)比例的鮭魚(yú)降鈣素可溶微針貼片的制備方法同實(shí)施例1，不同在于微針針體制作液中沒(méi)有添加d-海藻糖二水，只加有37.5mg右旋糖酐40(分子量為40000)。所得微針貼片記為sct/dex/k90e。對(duì)比例2本對(duì)比例的鮭魚(yú)降鈣素可溶微針貼片的制備方法同實(shí)施例1，不同在于將微針針體制作液中的右旋糖酐40替換為羥丙基甲基纖維素e4(hpmce4，分子量為86000)。對(duì)比例3本對(duì)比例的鮭魚(yú)降鈣素可溶微針貼片的制備方法同實(shí)施例1，不同在于右旋糖酐40的加入量為25mg，d-海藻糖二水的加入量為25mg。實(shí)施例4測(cè)試實(shí)施例1-3，對(duì)比例1-3制備的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的尺寸。以上實(shí)施例或?qū)Ρ壤兴玫奈⑨橁幠５某叽缛缦拢汉?00個(gè)微針，微針為圓錐形，以10×10排列，微針高度為0.8mm，底部直徑為0.3mm，尖端直徑為0.001mm，針尖距為0.9mm。用顯微鏡測(cè)量所制備的微針的針體長(zhǎng)度和針體的底部直徑，結(jié)果如表1所示。表1針體高度針體的底部直徑實(shí)施例10.798mm0.298mm實(shí)施例20.797mm0.297mm實(shí)施例30.798mm0.296mm對(duì)比例10.797mm0.297mm對(duì)比例20.794mm0.293mm對(duì)比例30.791mm0.292mm實(shí)施例1-3及對(duì)比例1制備的微針的針體高度和針體的底部直徑均與微針陰模的尺寸吻合度較好。但是對(duì)比例2由于羥丙基甲基纖維素(hpmce4)黏性較大，配制時(shí)，攪拌較為困難，溶脹難以均勻，制備的dmna基層不平整，有不規(guī)律的氣泡，微針極細(xì)而彎曲，不適合做為本發(fā)明的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的微針輔料。對(duì)比例3加入了固含量占比為43％的d-海藻糖二水的針尖液，制備的微針出針不完整，且部分針體直接折斷，表明其具有一定的脆性，因此，d-海藻糖二水的含量不宜過(guò)高。實(shí)施例5測(cè)試實(shí)施例1-3，對(duì)比例1制備的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的機(jī)械強(qiáng)度。采用質(zhì)構(gòu)儀和顯微鏡測(cè)試可溶性微針的機(jī)械性能。方法如下：將含100個(gè)微針的dmna背部用雙面膠貼于質(zhì)構(gòu)儀的圓柱形探頭上，針尖向下垂直于不銹鋼平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，探頭以2mm/s的速度向不銹鋼平臺(tái)移動(dòng)，隨著微針接觸到平臺(tái)，探頭探測(cè)到壓力變化，當(dāng)?shù)竭_(dá)0.05n的觸發(fā)壓力時(shí)，探頭改變速度為0.5mm/s繼續(xù)向下移動(dòng)，當(dāng)壓力升至50n(0.5n/n)時(shí)，保持5s。隨后，探頭反向平臺(tái)移動(dòng)，離開(kāi)不銹鋼平臺(tái)。取下微針，將微針垂直于顯微鏡頭，固定于一透明小盒，用顯微鏡測(cè)量微針的長(zhǎng)度和針底直徑。每個(gè)針形選擇3片微針貼片進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)量至少20個(gè)微針長(zhǎng)度以計(jì)算平均值。實(shí)施例1-3和對(duì)比例1制備的微針經(jīng)質(zhì)構(gòu)儀施壓前后微針的形態(tài)、長(zhǎng)度及長(zhǎng)度變化如圖3所示，圖中的數(shù)值是單個(gè)微針受力0.5n后長(zhǎng)度占初始長(zhǎng)度的比值。對(duì)比例1中未加入d-海藻糖二水的針尖液制備的微針硬度較低，尖端出現(xiàn)彎折變化較大。實(shí)施例1-3制備的微針受壓后長(zhǎng)度改變較小，微針尖端彎折與斷裂變化較小，表明其具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，且相比對(duì)比例中的其他微針，尖端明顯更小，更有利于皮膚的穿刺。其中，實(shí)施例1-3，更優(yōu)選實(shí)施例1所使用的配方。實(shí)施例6測(cè)試實(shí)施例1和對(duì)比例1制備的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的存儲(chǔ)穩(wěn)定性本實(shí)施例中，采用hplc法測(cè)定鮭魚(yú)降鈣素的含量。hplc測(cè)試條件如下：色譜柱jupiter5uc18(250mm×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相a相為0.02mol/l四甲基氫氧化銨(tmah)溶液(磷酸調(diào)ph2.5)，b相為純乙腈，流速1.0ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，進(jìn)樣量100μl，采用二元梯度洗脫。理論塔板數(shù)按鮭魚(yú)降鈣素峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。(1)可溶性微針貼片總載藥量：將新制得的鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片(sct-dmna)整片溶于4mlph5.8的pbs溶液(磷酸氫二鉀0.87g和磷酸二氫鉀8.34g用超純水定容至1000m)中，以hplc測(cè)定sct含量。經(jīng)過(guò)測(cè)定和計(jì)算，sct/dex/k90e微針貼片的總載藥量為48.06±6.08ug，sct/dex-tre/k90e微針貼片的總載藥量為46.10±5.46μg。穩(wěn)定劑d-海藻糖二水的加入對(duì)于微針貼片的總載藥量無(wú)明顯影響。(2)sct-dmna的存儲(chǔ)穩(wěn)定性將新制得的sct/dex/k90e和sct/dex-tre/k90e以及50μg/ml的sct溶液分別在以下四種條件下儲(chǔ)存：a)低溫低濕：4℃，10％濕度(放入干燥器置于4℃冰箱)；b)常溫低濕：常溫，10％濕度(放入干燥器置于室溫)；c)高溫低濕：40℃，10％濕度(放入干燥器置于40℃烘箱)；d)常溫高濕：常溫，55％濕度。兩個(gè)月后取出sct溶液和sct-dmna，測(cè)定各sct-dmna總載藥量及sct溶液中sct含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。儲(chǔ)存兩月后，四種條件下的sct溶液均未檢測(cè)出sct，而所有的sct-dmna均能檢測(cè)出sct，并且sct/dex-tre/k90e的sct含量大于sct/dex/k90e，說(shuō)明可溶性微針中的sct的儲(chǔ)存穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于溶液狀態(tài)，鮭魚(yú)降鈣素可溶微針貼片有利于維持多肽藥物sct的穩(wěn)定性，并海藻糖的加入可以大大提高鮭魚(yú)降鈣素可溶微針的sct穩(wěn)定性。實(shí)施例7本實(shí)施例中，對(duì)鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的體內(nèi)藥效學(xué)進(jìn)行研究。(1)試藥準(zhǔn)備sct注射溶液配制：準(zhǔn)確稱取sct5mg于50ml容量瓶中，以生理鹽水定容，配制100g/ml的sct注射溶液。sct凝膠配制：按照常規(guī)凝膠的配制處方，精密稱取5mgsct，0.72g泊洛沙姆407，加生理鹽水至總重量為4g，攪拌均勻，得sct凝膠。dex/k90e空白dmna制備：稱取25mg右旋糖酐，溶于50μl去離子水(含疊氮鈉0.05％w/v)，攪拌均勻，溶脹過(guò)夜，制得空白微針針體制作液。將空白微針針體制作液注入陰模中，在3000g力的作用下離心10min，離心溫度為4℃，待溶液注滿微針陰模的微孔，刮除陰模表面多余的溶液，回收利用。然后，在完成了微針針體制作液注模的陰模上注入空白基底溶液k90e(50mg聚乙烯基吡咯烷酮k90(pvpk90)溶于150μl乙醇中)，在3000g力的作用下離心5min，離心溫度為4℃。然后室溫下在干燥器中干燥24h，干燥器內(nèi)的濕度為10％，即為dex/k90e空白可溶性微針貼片。sct-dmna：采用實(shí)施例1制備的sct/dex-tre/k90e和對(duì)比例1制備的sct/dex/k90e進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。(2)動(dòng)物分組：選取體重在200g左右的雌性sd大鼠52只，檢疫3天后隨機(jī)分為7組。分組、給予制劑、給藥劑量及給藥方法如表2所示。表2大鼠分組及鮭魚(yú)降鈣素給藥分組sd大鼠/只制劑sct劑量/μg1組7control-2組7sct溶液靜脈注射(iv)203組7sct溶液皮下注射(sc)204組7sct凝膠405組8dex/k90e-6組8sct/dex/k90e～41.317組8sct/dex-tre/k90e～39.56(3)動(dòng)物給藥control組僅進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)和各時(shí)間點(diǎn)取血，不給藥；靜脈注射組于頸靜脈注射sct溶液0.2ml(100μg/ml)；皮下注射組于腋下皮下注射sct溶液0.2ml(100μg/ml)；凝膠組大鼠事先腹部除毛，取2cm×2cm的無(wú)毛區(qū)，以sct凝膠涂抹，并以保鮮膜覆蓋；微針給藥組于左耳內(nèi)側(cè)插入微針，以金屬平夾固定，微針保持2h后除去，測(cè)定移除的微針貼片的含藥量，計(jì)算實(shí)際給藥量。(4)動(dòng)物采血分別于給藥前及給藥后5,15,30,45,60,90,120,180,240,360,480,720min采血200μl，置于0.5ml離心管中，放置1h，凝固后于7000rpm下離心7min，分離得到血清，待分析。取血時(shí)，為防止封管的肝素鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，先棄去最初50μl血液。每個(gè)點(diǎn)取血后，均補(bǔ)充生理鹽水200μl。(5)血清鈣濃度測(cè)定鄰甲酚酞絡(luò)合酮(ocpc)比色法測(cè)定血漿中的血清鈣濃度。血清檢測(cè)具體為：精密吸取待測(cè)血清樣品和超純水各50μl于10ml離心管中，加入鈣顯色劑4.0ml，混勻，放置5min，于波長(zhǎng)570nm測(cè)定吸光度。計(jì)算樣品中的血清鈣濃度。(6)體內(nèi)藥效學(xué)計(jì)算以大鼠給藥前血清鈣濃度為基準(zhǔn)(100％)，給藥后各時(shí)間點(diǎn)血清鈣相對(duì)濃度f(wàn)(％)由如下公式一計(jì)算：其中，ci表示i時(shí)間點(diǎn)的大鼠血清鈣濃度，c0表示給藥前大鼠血清鈣濃度。以血清鈣相對(duì)濃度f(wàn)％對(duì)時(shí)間點(diǎn)繪制血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線。采用梯形法計(jì)算血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線下的面積(areaunderconcentration-timecurve,auc)，如公式二：auc＝∑(ti-ti-1)×(fi-1+fi)/2(公式二)其中，ti和fi分別為第i個(gè)取血點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間值和血清鈣相對(duì)濃度百分?jǐn)?shù)值，auc為所有相鄰兩點(diǎn)與x軸構(gòu)成的梯形面積總和。降血鈣效應(yīng)d％由公式三計(jì)算：其中，aucx表示各制劑和陽(yáng)性對(duì)照的auc值，aucc表示aucx制劑對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照的auc值。相對(duì)生物利用度按公式四計(jì)算：其中，dx％和dosex表示載藥微針和凝膠制劑的降血鈣效應(yīng)和劑量，dsc％和dosesc表示皮下注射給藥途徑的降血鈣效應(yīng)和劑量。設(shè)置兩組陰性對(duì)照：不給藥的control組用來(lái)與非微針組對(duì)照，以消除頸靜脈插管可能造成的血鈣影響；空白微針組用來(lái)與微針給藥組對(duì)照，消除微針插入以及微針輔料溶解可能造成的血鈣影響。陽(yáng)性對(duì)照組選擇sct溶液靜脈注射與皮下注射，以研究皮下給予sct溶液與靜脈直接注入的藥效差別。對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，陰性對(duì)照組的兩條曲線較為接近，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明微針插入與微針輔料對(duì)大鼠血鈣影響較??；兩條曲線在最初1h內(nèi)均略有下降，后逐步回復(fù)且維持在基線水平，表明頸靜脈插管手術(shù)在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大鼠血清鈣有輕微影響，影響能很快消除。靜脈注射和皮下注射這兩條陽(yáng)性對(duì)照組曲線相互重合度較好，血清鈣水平在最初3h內(nèi)不斷下降，之后保持在較低水平，表明sct皮下注射的藥效與靜脈注射類似，均具有顯著的降血鈣的效果。陽(yáng)性對(duì)照曲線與陰性對(duì)照曲線之間有顯著差別，表明由頸靜脈插管手術(shù)造成的血清鈣的輕微影響不會(huì)影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。sct凝膠敷貼組的血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線如圖6所示，凝膠組的曲線位于陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組曲線之間，與陰性對(duì)照組曲線較為接近，相應(yīng)各點(diǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與陽(yáng)性對(duì)照組相距較遠(yuǎn)，3h后各點(diǎn)均有較大的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明凝膠敷貼組降血鈣效果不顯著。sct-dmna組血清鈣相對(duì)濃度-時(shí)間曲線如圖7所示，sct/dex/k90e和sct/dex-tre/k90e兩種可溶性微針貼片的曲線均與陽(yáng)性對(duì)照組曲線重合度較好，各點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，僅從曲線上無(wú)法分辨藥效學(xué)差異。表明這兩種微針貼片都具有與sct溶液注射類似的顯著的降血鈣效果。各實(shí)驗(yàn)組降血鈣效應(yīng)及藥理相對(duì)生物利用度如表3所示，表中的sct-dmna的劑量為初始劑量減去給藥后微針貼片中殘余的藥物含量后的實(shí)際釋藥劑量。表3各實(shí)驗(yàn)組降血鈣效應(yīng)及藥理相對(duì)生物利用度制劑aucsct劑量/μgd(％)pa(％)control68373.6---sct溶液靜脈注射(iv)55280.52019.1-sct溶液皮下注射(sc)55023.92019.5-sct凝膠65394.0404.411.2dex/k90e66044.0---sct/dex/k90e55553.327.5+3.715.959.2sct/dex-tre/k90e53983.130.0+3.518.362.4由表中結(jié)果可知，靜脈注射和皮下注射這兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組的降血鈣效應(yīng)相似，與圖4結(jié)果相符，進(jìn)一步表明sct經(jīng)過(guò)皮下和靜脈注射兩種給藥方式可以達(dá)到類似的降血鈣效果。sct-dmna降血鈣效果接近于陽(yáng)性對(duì)照，均達(dá)到60％左右的藥理相對(duì)生物利用度，表明sct-dmna具有理想的降血鈣效果和較高的相對(duì)生物利用度。與sct/dex/k90e相比，含有穩(wěn)定劑d-海藻糖二水的sct/dex-tre/k90e的初始載藥量略低，但是實(shí)際釋藥量卻略高，相應(yīng)的降血鈣效應(yīng)和相對(duì)生物利用度均更高，表明d-海藻糖二水的存在可以提高鮭魚(yú)降鈣素可溶性微針貼片的經(jīng)皮釋藥效率，從而獲得更高的降血鈣效果。鮭魚(yú)降鈣素凝膠貼片敷貼組的降血鈣效果顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組和sct-dmna組，相對(duì)生物利用度僅約10％，結(jié)果表明，可溶性微針貼片與常規(guī)經(jīng)皮釋藥方式凝膠貼劑相比能顯著提高多肽藥物sct的經(jīng)皮傳遞效率，具有極高的藥理生物利用度。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12