本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01380020520.2、申請(qǐng)日為2013年4月18日的中國發(fā)明專利申請(qǐng)《治療糖尿病和/或促進(jìn)胰島移植后存活的方法》的分案申請(qǐng)。

與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2012年4月18日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/625,904的利益，所述臨時(shí)申請(qǐng)的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及針對(duì)smad7的反義寡核苷酸及其在治療和/或預(yù)防糖尿病和/或促進(jìn)胰島細(xì)胞移植后存活中的用途。

背景技術(shù)：

糖尿病是以血液中高的糖水平為特征的代謝疾病。兩種最普遍的糖尿病類型是1型糖尿病(t1dm)和2型糖尿病(t2dm)。1型或胰島素依賴性糖尿病(iddm)是以產(chǎn)生胰島素的胰島中的β細(xì)胞的大量喪失為特征的慢性自體免疫疾病。在肌肉、脂肪和肝細(xì)胞不能對(duì)胰島素正常應(yīng)答(胰島素抗性)時(shí)，患有2型糖尿病或非胰島素依賴性糖尿病(niddm)。特別是，受到許多國家中肥胖和久坐生活方式增加以及人口總體老齡化的影響，2型糖尿病變?yōu)橐环N流行病。在最近的臨床實(shí)踐中，由于許多患有t1dm的兒童在診斷時(shí)體重過重，并且相當(dāng)大比例的醫(yī)生診斷為t2dm的年輕人有證據(jù)顯示胰腺自體免疫，因此辨別t1dm與t2dm變得日益困難(badaru,a.和pihoker,c，“兒童期2型糖尿?。害?細(xì)胞自體免疫的臨床特征和作用”(type2diabetesinchildhood:clinicalcharacteristicsandroleofbeta-cellautoimmunity)，curr.diab.rep.,2012,12,75-81)。在2011年，全世界超過3億4千6百萬人患有糖尿病。

最近的研究證實(shí)，tgf-β在胰島功能和糖尿病發(fā)展中發(fā)揮作用(moritani,m.等，“通過轉(zhuǎn)基因旁分泌tgf-β1在非肥胖糖尿病小鼠中自體免疫糖尿病的廢除和針對(duì)效應(yīng)淋巴細(xì)胞的保護(hù)”(abrogationofautoimmunediabetesinnonobesediabeticmiceandprotectionagainsteffectorlymphocytesbytransgenicparacrinetgf-β1)，j.clin.invest.,1998,102,499-506；olivieri,a.等，“在非肥胖糖尿病小鼠和人類中糖尿病發(fā)展期間的血清轉(zhuǎn)化生長因子β1”(serumtransforminggrowthfactorβ1duringdiabetesdevelopmentinnon-obesediabeticmiceandhumans)，clin.exp.immunol.,2010,162,407-414)。例如，已顯示，tgf-β表達(dá)的為期一周的胰島特異性脈沖，在nod小鼠中延緩糖尿病發(fā)展(m.等，“tgf-β的胰島特異性脈沖廢除ctl功能并促進(jìn)不依賴于foxp3⁺t細(xì)胞的β細(xì)胞存活”(anislet-specificpulseoftgf-βabrogatesctlfunctionandpromotesβcellsurvivalindependentoffoxp3⁺tcells)，j.immunol.,2011,186,2543-2551)，所述nod小鼠是1型糖尿病的一種常用的動(dòng)物模型(roep,b.o.等，“(不)保證的滿意：重新評(píng)估1型糖尿病動(dòng)物模型的用途”(satisfaction(not)guaranteed:re-evaluatingtheuseofanimalmodelsoftype1diabetes)，nat.rev.immunol.,2004,4,989-997)。tgf-β1不僅有效地在糖尿病nod小鼠中治愈糖尿病并阻斷胰島破壞性自體免疫，而且有效地誘導(dǎo)胰島再生(luo,x.等，“在明顯的糖尿病非肥胖糖尿病小鼠中系統(tǒng)性轉(zhuǎn)化生長因子β1基因療法誘導(dǎo)foxp3+調(diào)節(jié)性細(xì)胞，恢復(fù)自身耐受，并促進(jìn)β細(xì)胞功能的再生”(systemictransforminggrowthfactor-β1genetherapyinducesfoxp3+regulatorycells,restoresself-tolerance,andfacilitatesregenerationofbetacellfunctioninovertlydiabeticnonobesediabeticmice)，transplantation,2005,79,1091-1096)。因此，沿著這條通路的治療性干預(yù)可能不僅終止疾病的進(jìn)展，而且甚至可能在高血糖癥發(fā)作后恢復(fù)功能(即，產(chǎn)生足夠的胰島素)。

tgf-β1-3參與各種不同生物功能，包括細(xì)胞生長、器官發(fā)育、纖維形成和免疫細(xì)胞的調(diào)控。tgf-β1是在免疫系統(tǒng)中表達(dá)的主要形式，并且它現(xiàn)在已被明確認(rèn)為是在免疫應(yīng)答中可以抑制t細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控因子(li,m.o.和flavell,r.a.，“tgf-β：所有t細(xì)胞掌控者的貿(mào)易”(tgf-beta:amasterofalltcelltrades)，cell,2008,134,392-404)。具體來說，tgf-β1結(jié)合含有兩個(gè)亞基tgf-β1r1和tgf-β1r2的異二聚體跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。在配體結(jié)合后，tgf-β1r1受體被持續(xù)活化的tgf-β1r2受體磷酸化，并通過屬于smad家族的蛋白將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核。活化的tgf-β1r1直接磷酸化smad2和smad3蛋白，它們?nèi)缓笈csmad4相互作用。smad2/smad3/smad4復(fù)合物轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核并調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄。smad7是這個(gè)蛋白質(zhì)家族的另一個(gè)成員，其通過負(fù)反饋機(jī)制起到針對(duì)tgf-β的通用拮抗劑的作用(yan,x.和chen,y.g.，“smad7：不僅是調(diào)控因子，而且是tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)的交互作用介導(dǎo)物”(smad7:notonlyaregulator,butalsoacross-talkmediatoroftgf-betasignalling)，biochem.j.,2011,434,1-10)。

研究證實(shí)，smad7在糖尿病和β-細(xì)胞功能中發(fā)揮作用。已顯示，smad7這種細(xì)胞內(nèi)蛋白干擾smad2/smad3與tgf-β1r1的結(jié)合，阻止這些蛋白質(zhì)的磷酸化和活化，導(dǎo)致tgf-β1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。已顯示，smad7在胰腺β-細(xì)胞中的表達(dá)阻斷tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)并誘導(dǎo)可逆的糖尿病(smart,n.g.等，“smad7在胰腺β細(xì)胞中的條件性表達(dá)阻斷tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)并誘導(dǎo)可逆的糖尿病”(conditionalexpressionofsmad7inpancreaticbetacellsdisruptstgf-betasignalingandinducesreversiblediabetesmellitus)，plosbiol.,2006,4,e39)。此外，nod小鼠中的結(jié)果也暗示了在糖尿病形成中活化的樹突細(xì)胞中的smad2和tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，并且存在來自于人類全基因組關(guān)聯(lián)研究的證據(jù)支持smad7在人類1型糖尿病中的作用(hook,s.m.等，“smad2：鼠類自體免疫性糖尿病位點(diǎn)idd21.1的候選基因”(smad2:acandidategeneforthemurineautoimmunediabeteslocusidd21.1)，j.clin.endocrinol.metab.,2011,96,e2072-e2077)。由于已顯示tgf-β1有助于細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制、t細(xì)胞應(yīng)答的抑制和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)的誘導(dǎo)(kawamoto,k.等，“轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgf-β1)和雷帕霉素協(xié)同增效，通過foxp3⁺treg的上調(diào)有效地抑制人類t細(xì)胞應(yīng)答”(transforminggrowthfactorbeta1(tgf-β1)andrapamycinsynergizetoeffectivelysuppresshumantcellresponsesviaupregulationoffoxp3⁺tregs)，transpl.immunol.,2010,23,28-33)，因此通過支持移植物功能、限制毒性和防止免疫排斥，smad7調(diào)節(jié)在胰島移植中也可能是有益的。

因此，對(duì)于糖尿病和胰島移植中的新療法，存在著未滿足的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明方法是部分地基于發(fā)現(xiàn)抑制smad7并因此恢復(fù)tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)的smad7表達(dá)或功能的特異性抑制劑，例如針對(duì)smad7的反義寡核苷酸。示例性的針對(duì)smad7的反義寡核苷酸包含例如seqidno:5或seqidno：6，其可用于藥物組合物中。所公開的smad7抑制劑可用于治療和/或預(yù)防糖尿病例如1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。所述針對(duì)smad7的反義寡核苷酸也可用于促進(jìn)胰島細(xì)胞移植后存活。

通過引用下面的圖、詳細(xì)描述和權(quán)利要求書，可以更充分地理解本發(fā)明的上述方面和實(shí)施方式。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“包括”意味著沒有限制，并且引用的實(shí)例是非限制性的。

附圖簡述

圖1(a)提供smad7的核酸序列(seqidno：1)，并且(b)提供了smad7的氨基酸序列(seqidno：2)。

圖2(a)是示出在hek-bluetnf-α感應(yīng)細(xì)胞(sensorcell)中tgfβ和ged-0301(一種smad7反義寡核苷酸，seqidno：6)對(duì)nf-κb活化的影響的圖，并且(b)是示出了在分別用tnf-α和cd40l刺激的hek-bluecd40l感應(yīng)細(xì)胞中tgfβ和ged-0301對(duì)nf-κb活化的影響的圖。

圖3(a)是示出在小鼠中，在通過各種不同途徑給藥后熒光素標(biāo)記ged-0301的器官特異性攝取的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的分析中使用的選通方法的圖，并且圖3(b)示出了在所指示的器官組織中，在活細(xì)胞中的相應(yīng)攝取百分?jǐn)?shù)(fitc+)。

圖4是示出來自于對(duì)照小鼠和皮下給藥熒光素標(biāo)記ged-0301的小鼠(給藥后4小時(shí))的胰腺切片的多通道高分辨率顯微鏡圖像。顏色圖例說明：綠色–熒光ged-0301，灰色–dapi(細(xì)胞核的標(biāo)志物)，紅色–胰島素(指示產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞)，以及藍(lán)色–cd45(指示cd45或白細(xì)胞共同抗原lca，lca是白細(xì)胞這種包含免疫和炎性細(xì)胞的循環(huán)血液系統(tǒng)的要素的標(biāo)志物)。

圖5(a)是示出在高血糖癥發(fā)作后，用smad7反義寡核苷酸ged-0301(asged-0301)、相應(yīng)的正義對(duì)照(s對(duì)照)和鹽水(對(duì)照)(125μg/動(dòng)物，皮下(s.c.)，每日)治療的noc小鼠中血糖水平的圖，圖5(b)是示出了保持無糖尿病的動(dòng)物的百分?jǐn)?shù)隨時(shí)間變化的相應(yīng)的kaplan-meier存活曲線。

圖6是比較在到研究結(jié)束(第150天)時(shí)ged-0301治療的沒有患糖尿病的nod小鼠和對(duì)照小鼠中進(jìn)行的口服葡萄糖耐受試驗(yàn)的結(jié)果的圖。

圖7示出了比較來自于到研究結(jié)束(第150天)時(shí)ged-0301治療的沒有患糖尿病的nod小鼠和相應(yīng)對(duì)照的胰腺的代表性含胰島切片的多通道高分辨率z-堆疊共聚焦顯微術(shù)圖像。顏色圖例說明：藍(lán)色–dapi(細(xì)胞核的標(biāo)志物)，紅色–胰島素(指示產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞)，綠色–胰高血糖素(指示產(chǎn)生胰高血糖素的α-細(xì)胞)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明總的來說涉及針對(duì)smad7的反義寡核苷酸及其在治療和/或預(yù)防糖尿病和/或促進(jìn)胰島細(xì)胞移植后存活中的用途。

抗smad7療法

本發(fā)明方法涉及將特異性smad7抑制劑用于治療和/或預(yù)防糖尿病和/或用在促進(jìn)胰島細(xì)胞移植后存活中的用途，所述特異性smad7抑制劑選自由小結(jié)合分子(例如天然和合成的化合物)、抗體、適體(aptamer)、intramers、rnai(雙鏈rna，sirna)和抗smad7反義分子所組成的組。smad7抑制劑還可以包含截短和/或突變的smad7分子，其干擾smad7并因此抑制smad7功能。

例如，抗smad7療法包括針對(duì)smad7的靶向療法(例如抗smad7反義療法，即針對(duì)smad7的反義寡核苷酸，以及針對(duì)smad7的抗體)。反義寡核苷酸是短的合成寡核苷酸序列，其與編碼靶蛋白(例如smad7)的信使rna(mrna)互補(bǔ)。反義寡核苷酸序列雜交mrna，產(chǎn)生雙鏈雜合體，其可以引起遍在催化酶例如rnaseh的激活，所述rnaseh降解dna/rna雜合鏈，由此阻止蛋白質(zhì)翻譯。

在某些實(shí)施方式中，抗smad7反義寡核苷酸可以靶向人類smad7mrna(例如seqidno：1)的位點(diǎn)403、233、294、295、296、298、299和/或533(即分別為403、233、294、295、296、298、299和533位核苷酸)(參見圖1)。在示例性實(shí)施方式中，抗smad7反義寡核苷酸靶向人類smad7mrna的403-423位核酸。

在某些實(shí)施方式中，反義寡核苷酸可以源自于下列抗smad7反義寡核苷酸5'-gtcgccccttctccccgcagc-3'(seqidno：3)。

在本文中設(shè)想了靶向smad7的反義寡核苷酸可以包含混合骨架，其中cpg對(duì)中的胞嘧啶殘基被5’-甲基胞嘧啶取代(縮寫為me-dc)。在反義寡核苷酸的5’和/或3’端處也可以放置甲基膦酸酯連鍵(縮寫為mep)。所設(shè)想的抗smad7反義寡核苷酸的膦酸酯骨架可以任選地包含1、2、3、4個(gè)或更多硫代磷酸酯鍵(例如硫代磷酸酯鍵取代磷酸二酯鍵)。在實(shí)施方式中，所有膦酸酯鍵可以是硫代磷酸酯鍵。

靶向smad7的示例性反義寡核苷酸療法包含但不限于：

5'-gtxyccccttctcccxycag-3'(seqidno：4)，其中x是包含選自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶或2'-o-甲基胞嘧啶核苷所組成的組的含氮堿基的核苷酸，并且其中y是包含選自由鳥嘌呤和5-甲基鳥嘌呤或2'-o-甲基鳥嘌呤核苷所組成的組的含氮堿基的核苷酸，條件是至少一個(gè)核苷酸x或y包含甲基化的含氮堿基；

5'-gtxgccccttctcccxgcag-3'(seqidno：5)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單磷酸；

5'-gtxgccccttctcccxgcagc-3'(seqidno：6)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單磷酸；

5'-ztxgccccttctcccxgcaz-3'(seqidno：7)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單磷酸并且z是2'-脫氧鳥苷甲基膦酸酯；

5'-ztxgccccttctcccxgcazc-3'(seqidno：8)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單磷酸并且z是2'-脫氧鳥苷甲基膦酸酯。

在特定實(shí)施方式中，所設(shè)想的smad7反義物可以是包含下列之一的序列：

5'-gtxgccccttctcccxgcag-3'(seqidno：9)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單硫代磷酸酯；

5'-gtxgccccttctcccxgcagc-3'(seqidno：10)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單硫代磷酸酯；

5'-ztxgccccttctcccxgcaz-3'(seqidno：11)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單磷酸并且z是2'-脫氧鳥苷甲基硫代膦酸酯；

5'-ztxgccccttctcccxgcazc-3'(seqidno：12)，其中x是5-甲基2'-脫氧胞苷5'-單磷酸并且z是2'-脫氧鳥苷甲基硫代膦酸酯。

例如，seqidnos.9-12包含1、2、3、4個(gè)或更多硫代磷酸酯鍵。在實(shí)施方式中，seqidnos.9-12的所有o,o膦酸酯鍵是硫代磷酸酯鍵。

治療方法

本文中提供促進(jìn)器官和/或細(xì)胞例如胰島細(xì)胞移植后存活的方法，所述方法包含向需要的患者給藥有效量的smad7表達(dá)或功能的特異性抑制劑，例如針對(duì)smad7的反義寡核苷酸。

本文中還提供了治療和/或預(yù)防糖尿病例如1型糖尿病和2型糖尿病的方法，所述方法包含向需要的患者給藥有效量的smad7表達(dá)或功能的特異性抑制劑，例如針對(duì)smad7的反義寡核苷酸。

糖尿病包括以高血糖或酮酸中毒以及由長期高血糖狀態(tài)或葡萄糖耐受降低引起的慢性、普遍的代謝異常為特征的一組代謝疾病。糖尿病包括所述疾病的1型和2型兩種形式、妊娠期糖尿病和胰島素缺乏的其他病癥。

應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，所公開的方法還適用于治療和預(yù)防隱匿性自體免疫糖尿病(即1.5型糖尿病)、代謝失衡、糖尿病前期狀態(tài)、代謝綜合征、與脂類或葡萄糖相關(guān)的障礙例如高脂血癥和/或高膽固醇血癥，以及其他相關(guān)障礙。

代謝失衡可以包括與血漿葡萄糖升高相關(guān)的任何障礙或疾病狀態(tài)或病癥。代謝失衡包括例如糖尿病、妊娠期糖尿病、β-細(xì)胞功能的遺傳缺陷、胰島素作用的遺傳缺陷、胰腺外分泌的疾病、內(nèi)分泌病、藥物或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的感染、與糖尿病相關(guān)的其他遺傳綜合征、糖尿病前期狀態(tài)和代謝綜合征。

代謝綜合征以一個(gè)人中一組代謝風(fēng)險(xiǎn)因子為特征，正如由美國心臟協(xié)會(huì)(americanheartassociation)(aha)所描述的。代謝綜合征還被稱為代謝綜合征x、綜合征x、胰島素抵抗綜合征、reaven's綜合征或chaos。所述風(fēng)險(xiǎn)因子包括但不限于腹型肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化血脂異常、高血壓、胰島素抵抗或葡萄糖不耐受、血栓前狀態(tài)(高血纖維蛋白原或纖溶酶原激活物抑制劑-1)和促炎癥狀態(tài)(高c-反應(yīng)性蛋白)。

術(shù)語“治療”(treat)、“治療”(treatment)、“治療”(treating)等在本文中用于通常指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分地預(yù)防疾病或其癥狀而言可能是預(yù)防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或歸因于疾病的不利影響而言可能是治療性的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“治療”涵蓋在哺乳動(dòng)物、尤其是人類中疾病的任何治療，并包括：(a)在可能對(duì)疾病易感但尚未被診斷為患有所述疾病的受試者中預(yù)防所述疾病發(fā)生；(b)抑制疾病，即停滯其發(fā)展；或(c)緩解疾病，即使疾病消退。

在某些實(shí)施方式中，受試者對(duì)使用抗smad7療法的治療的反應(yīng)，可以相對(duì)于從治療前的受試者獲得的對(duì)照樣本(在下文描述)來說明。如果存在smad7表達(dá)的降低，如果存在總胰腺胰島素含量的增加，如果β-細(xì)胞功能得以維持和/或恢復(fù)(例如，正如通過標(biāo)準(zhǔn)方法例如靜脈內(nèi)葡萄糖耐受試驗(yàn)ivgtt所評(píng)估的)，和/或如果正常血糖、即正常的血液葡萄糖含量得以維持和/或恢復(fù)，則受試者可以被確定為對(duì)使用抗smad7療法的治療作出反應(yīng)。在其他實(shí)施方式中，已接受胰島移植物例如異體胰島移植的受試者，如果存在排斥反應(yīng)的預(yù)防和/或延長胰島存活，可以被確定為對(duì)使用抗smad7療法的治療作出反應(yīng)。

可以在例如療法開始后第1周、第2周、第4周、第8周、第10周或更晚時(shí)間從患者獲得試驗(yàn)樣本，以判定對(duì)治療的敏感性。在某些實(shí)施方式中，可以在例如療法開始后一周、兩周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、五個(gè)月、六個(gè)月和/或一年或更長時(shí)間獲得試驗(yàn)樣本，以監(jiān)測(cè)對(duì)初始治療的敏感性。

對(duì)照樣本可以包括在用抗smad7療法治療之前從受試者獲得的樣本(例如，血液或組織樣本)。對(duì)照樣本為監(jiān)測(cè)受試者的治療進(jìn)展提供了基線。對(duì)照樣本可以在抗smad7療法首次給藥的當(dāng)天(例如治療方案的第1天)從受試者獲得。在其他實(shí)施方式中，對(duì)照樣本可以在抗smad7療法開始前一天(例如治療方案的第0天)從受試者獲得?；蛘撸瑢?duì)照樣本可以在抗smad7療法開始前2、3、4、5、6、7或更多天從受試者獲得。例如，某些細(xì)胞樣本的上調(diào)或下調(diào)，可以在治療之前(例如對(duì)照樣本)、治療期間和/或治療之后進(jìn)行測(cè)量，以監(jiān)測(cè)受試者對(duì)療法例如抗smad7療法的反應(yīng)。

對(duì)照樣本可以包括例如用于監(jiān)測(cè)受試者的葡萄糖水平的樣本，其中所述樣本在使用抗smad7療法治療之前從所述受試者獲得。

在某些實(shí)施方式中，可以在受試者中某些細(xì)胞群體的長期監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上為受試者建立對(duì)照水平。在這樣的情形中，設(shè)想了受試者可以經(jīng)歷使用抗smad7療法的多輪治療。在多輪治療后檢測(cè)到的某些細(xì)胞群體的量，可以與所述受試者以前的對(duì)照水平進(jìn)行比較，以判定受試者是否已經(jīng)對(duì)療法作出反應(yīng)和/或可能對(duì)使用抗smad7療法的進(jìn)一步治療作出反應(yīng)。在其他實(shí)施方式中，可以在從隨時(shí)間獲得的(例如在數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年的過程中獲得的)多個(gè)基線樣本判定的某些細(xì)胞群體的平均測(cè)量值的基礎(chǔ)上，為受試者建立對(duì)照或基線水平。因此，可以將如本文中所公開的進(jìn)行的任何試驗(yàn)或測(cè)定與以前或已建立的對(duì)照水平進(jìn)行比較，并且例如如果受試者接受使用抗smad7療法的超過一輪的治療的話，可以不必從受試者獲得新的對(duì)照樣本用于比較。

給藥和制劑

在某些實(shí)施方式中，本文中設(shè)想了包含所設(shè)想的針對(duì)smad7的反義寡核苷酸和可藥用載體的藥物組合物。例如，藥物組合物可以皮下給藥?；蛘?，藥物組合物可以口服給藥。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，“可藥用載體”是指適用于與人類和動(dòng)物的組織接觸而沒有過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥，與合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的緩沖劑、載體和賦形劑。載體在與制劑的其他成分相容和對(duì)受體無害的意義上應(yīng)該是“可接受的”?？伤幱幂d體包含與藥物給藥相容的緩沖劑、溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、等滲和吸收延遲劑等。這樣的用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用，在本領(lǐng)域中是已知的。

在一種實(shí)施方式中，所設(shè)想的針對(duì)smad7的反義寡核苷酸及其任何藥物組合物，可以通過一種或幾種途徑給藥，包括口服給藥、局部給藥、腸胃外給藥例如皮下注射、通過吸入噴劑或直腸給藥。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語腸胃外給藥包括皮下注射、胰腺內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。例如，針對(duì)smad7的反義寡核苷酸可以皮下給藥于受試者。在另一個(gè)實(shí)例中，針對(duì)smad7的反義寡核苷酸可以口服給藥于受試者。

含有例如本文中所公開的針對(duì)smad7的反義寡核苷酸的藥物組合物，可以以劑量單位形式存在，并且可以通過任何適合的方法制備。藥物組合物應(yīng)該被配制成與其既定給藥途徑相容。有用的制劑可以通過制藥技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法來制備。例如參見《remington制藥學(xué)》(remington'spharmaceuticalsciences)第18版(mackpublishingcompany,1990)。

藥物制劑優(yōu)選地是無菌的。滅菌可以例如通過無菌過濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。在組合物被凍干的情況下，過濾滅菌可以在凍干和重構(gòu)之前或之后進(jìn)行。

在示例性實(shí)施方式中，用于針對(duì)smad7的反義寡核苷酸的皮下給藥的藥物組合物包含例如由seqidno：6所表示的反義寡核苷酸或其可藥用鹽(例如鈉鹽)以及可藥用載體。

在另一種實(shí)施方式中，用于針對(duì)smad7的反義寡核苷酸的口服給藥的藥物片劑包含內(nèi)相顆粒，其中所述內(nèi)相顆粒包含例如由seqidno：6所表示的反義寡核苷酸或其可藥用鹽(例如鈉鹽)以及可藥用填充劑，并且其還可以包含顆粒外相，其可以包含可藥用賦形劑例如崩解劑。例如，用于口服使用的可藥用片劑可以包含內(nèi)相顆粒，其包含約5至約10重量％的由seqidno6所表示的反義寡核苷酸或其可藥用鹽、約40重量％的甘露糖醇、約8重量％的微晶體纖維素、約5重量％的羥丙基甲基纖維素和約2重量％的羥基乙酸淀粉鈉；顆粒外相，其包含約17重量％的微晶體纖維素、約2重量％的羥基乙酸淀粉鈉、約0.4重量％的硬脂酸鎂；以及片劑之上的腸溶包衣，其包含約13重量％的(參見例如pct公開no.wo/2010/054826，以其全部內(nèi)容通過引用并入本文)。

示例性制劑包含：包含約35mg至約500mg的針對(duì)smad7的反義寡核苷酸或基本上由其構(gòu)成的劑量形式。例如，在本文中設(shè)想了包含約35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg或250mg針對(duì)smad7的反義寡核苷酸的制劑。在一種實(shí)施方式中，制劑可以包含約40mg、80mg或160mg針對(duì)smad7的反義寡核苷酸。給藥的量取決于各種變量，例如待治療的疾病或指征的類型和程度、患者的總體健康、抗體的體內(nèi)效能、藥物制劑和給藥途徑。初始劑量可以增加超過上限水平，以便快速獲得所需血液水平或組織水平?；蛘撸跏紕┝靠梢缘陀谧钸m量，并且可以在治療過程中逐漸增加劑量。例如被設(shè)計(jì)成從40mg至160mg運(yùn)行的常規(guī)i期劑量遞增研究中，人類劑量可以被優(yōu)化。給藥頻率可以隨著多種因素例如給藥途徑、劑量和待治療的疾病而改變。示例性的給藥頻率是每天一次、每周一次和每兩周一次。在某些實(shí)施方式中，給藥每天一次，共7天。優(yōu)選的給藥途徑是皮下給藥。

在某些實(shí)施方式中，本文中提供的方法還可以包含給藥針對(duì)本文中描述的疾病和障礙的治療的至少一種其他藥劑。在一種實(shí)施方式中，所設(shè)想的其他藥劑可以協(xié)同給藥(例如順序或同時(shí)地)。

所設(shè)想的藥劑包含：免疫抑制劑包含糖皮質(zhì)激素類、細(xì)胞抑制劑、抗體、作用于親免蛋白的藥劑、干擾素、阿片類藥物、tnf結(jié)合蛋白、霉酚酸酯和小的生物藥劑。例如，所設(shè)想的免疫抑制劑包含但不限于：他克莫司，環(huán)孢霉素，吡美莫司，西羅莫司，依維莫司，霉酚酸，芬戈莫德，地塞米松，氟達(dá)拉濱，環(huán)磷酰胺，甲氨蝶呤，硫唑嘌呤，來氟米特，特立氟胺，阿那白滯素，抗胸腺細(xì)胞球蛋白，抗淋巴細(xì)胞球蛋白，莫羅單抗-cd3，阿福圖珠(afutuzumab)，利妥昔單抗，teplizumab，依法利珠單抗，達(dá)利珠單抗，巴利昔單抗，阿達(dá)木單抗，英夫利昔單抗和依那西普。

所設(shè)想的藥劑包含用于調(diào)控血糖水平的藥物療法，包含使用降血糖藥和/或口服抗糖尿病藥劑的口服療法、注射療法等。用于調(diào)控血糖水平的非藥物療法包括但不限于糖尿病和/或鍛煉控制措施。

用于調(diào)控血糖水平的口服藥物療法包含降血糖藥，其可以包含但不限于：阿卡波糖，乙酰苯磺酰環(huán)己脲，氯磺丙脲，達(dá)格列酮鈉，格列美脲，格列吡嗪，格列本脲，瑞格列奈，曲格列酮，妥拉磺脲和甲苯磺丁脲。

用于調(diào)控血糖水平的口服藥物療法包含抗糖尿病藥物，其可以包含但不限于：阿卡波糖，乙酰苯磺酰環(huán)己脲，丁福明，布托沙明鹽酸鹽，卡格列波糖，氯磺丙脲，環(huán)格列酮，恩格列酮鈉，鹽酸依托福明，格列胺脲，格列波脲，格列他尼，格列齊特鈉，格列氟胺，格列吡嗪，胰高血糖素，格列本脲，格列己脲，格列嘧啶鈉，格列辛脲，格列帕脲，低精蛋白胰島素，人類胰島素鋅，長效胰島素，賴脯胰島素，利諾格列，富馬酸利諾格列，二甲雙胍，帕莫酸甲酯，帕莫酸鈉鹽，鹽酸吡格列酮，吡咯格列酒石酸鹽，人類胰島素原，瑞格列奈，司格列肽乙酸鹽，妥拉磺脲，甲苯磺丁脲，甲苯磺吡胺，曲格列酮和唑泊司他。

用于調(diào)控血糖水平的注射劑療法可以包含但不限于速效胰島素、長效胰島素和相關(guān)的胰島素。速效胰島素包含常規(guī)胰島素、速效胰島素鋅懸液和胰島素、注射液、r、iletinii、novolinr、純化的pork常規(guī)胰島素和velosulinbr人類胰島素。長效胰島素包含魚精蛋白胰島素鋅懸液、長效胰島素鋅懸液、胰島素和u。其他胰島素包含低精蛋白胰島素懸液、nph胰島素、低精蛋白胰島素；胰島素鋅懸液胰島素、人類低精蛋白胰島素懸液/人類胰島素注射液、50/50、70/30和70/30。

實(shí)施例

通過下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。提供實(shí)施例僅僅是出于說明的目的，并且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。

實(shí)施例1：smad7反義寡核苷酸對(duì)nf-κb激活的影響

設(shè)計(jì)了hek-blue^tm(invivogen)tnf-α/il-1β感應(yīng)細(xì)胞，以通過監(jiān)測(cè)nf-κb通路的激活來檢測(cè)生物活性tnf-α和il-1β。這些細(xì)胞通過用在融合到5個(gè)nf-κb和5個(gè)ap-1結(jié)合位點(diǎn)的ifn-β極小啟動(dòng)子控制下的seap報(bào)告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人類胚胎腎hek293細(xì)胞來產(chǎn)生。hek-blue^tm(invivogen)cd40l感應(yīng)細(xì)胞被用于通過經(jīng)在cd40刺激后nf-κb激活后胚胎堿性磷酸酶(seap)的分泌，來測(cè)量cd154(cd40l)的生物活性。這些細(xì)胞通過用人類cd40基因和可由nf-κb誘導(dǎo)的seap構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞來產(chǎn)生。因此，hek-blue^tm細(xì)胞通過經(jīng)在tnfr/cd40刺激后nf-κb激活后胚胎堿性磷酸酶(seap)的分泌，來測(cè)量tnfα/cd40l的生物活性。腫瘤壞死因子α(tnf-α)是參與全身炎癥和免疫細(xì)胞調(diào)控的已知的細(xì)胞因子。cd40l是參與t-細(xì)胞激活和有效的免疫應(yīng)答發(fā)展的共刺激蛋白，并且被認(rèn)為參與自體免疫疾病包括t1dm的發(fā)展(margolles-clark,e.等，“小分子共刺激性阻斷：cd40-cd154相互作用的有機(jī)染料抑制劑”(smallmoleculecostimulatoryblockade:organicdyeinhibitorsofthecd40-cd154interaction)，j.mol.med.,2009,87,1133-1143)。

將hekbluetnfα和cd40l感應(yīng)細(xì)胞(invivogen)(50,000/孔)與ged-0301反義(as)或?qū)φ照x(s)寡核苷酸(ogn；4μg/ml)，在lipofectamine(lpf)存在下溫育6小時(shí)，然后在培養(yǎng)基中溫育18小時(shí)，然后在存在或不存在tgf-β(200ng/ml；24小時(shí)，dmemp/s2％血清)的情況下用tnfα(1ng/ml)或cd40l(25ng/ml)刺激。ged-0301是smad7反義寡核苷酸(gtxgccccttctcccxgcagc，其中x是5-甲基-2′-脫氧胞苷5′單磷酸(5-me-dc)(seqidno：6))。在這些細(xì)胞中，由tnfα或cd40l誘導(dǎo)的seap分泌使用quanti-blue^tm來定量，所述quanti-blue^tm是由制造商提供并為此目的特意開發(fā)的比色酶測(cè)定法，其具有在seap存在下變成藍(lán)紫色的介質(zhì)，所述顏色變化可以通過在625-655nm處讀取od來定量。數(shù)據(jù)是使用每塊板4份平行樣的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，使用歸一化到在未處理的對(duì)照細(xì)胞中刺激的響應(yīng)(單獨(dú)的tnfα或cd40l)的值。

tgf-β和ged-0301對(duì)hek-blue細(xì)胞中nf-κb分別被tnfα和cd40l的激活的影響，示出在圖2a和2b中。結(jié)果顯示，tnfα和cd40l兩者產(chǎn)生相當(dāng)大的nf-κb活化(正如通過seap表達(dá)所測(cè)量的)，并且這兩者都被tgf-β抑制。通過用smad7反義寡核苷酸ged-0301處理，這種抑制被進(jìn)一步相當(dāng)大地增強(qiáng)，表明這種處理能夠增強(qiáng)和/或恢復(fù)tgf-β的效應(yīng)。在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，取決于所使用的細(xì)胞類型，tgf-β可以促進(jìn)或抑制nf-κb激活(hong,s.等，“通過抑制核因子κb通路的激活，smad7通過抗凋亡基因表達(dá)的抑制來致敏腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的凋亡”(smad7sensitizestumornecrosisfactorinducedapoptosisthroughtheinhibitionofantiapoptoticgeneexpressionbysuppressingactivationofthenuclearfactor-kappabpathway)，cancerres.,2007,67,9577-9583以及其中的引用文獻(xiàn))。在b細(xì)胞和人類腸粘膜固有層單核細(xì)胞(lpmc)中，tgf-β是nf-κb的負(fù)調(diào)控因子。轉(zhuǎn)染的hek細(xì)胞的結(jié)果類似于對(duì)lpmc所觀察到的，在lpmc中已顯示，tgf-β1在正常lpmc中負(fù)調(diào)控nf-κb激活(因?yàn)橛胻gf-β1預(yù)處理抑制了tnf-α誘導(dǎo)的nf-κb激活)，并且用特異性smad7反義寡核苷酸處理ibdlpmc，導(dǎo)致nf-κb激活的抑制(monteleone,g.等，“在腸道炎癥中，轉(zhuǎn)化生長因子β1負(fù)調(diào)控的失效維持nf-κb持續(xù)激活”(afailureoftransforminggrowthfactor-β1negativeregulationmaintainssustainednf-κbactivationingutinflammation)，j.biol.chem.,2004,279,3925-3932)。

為了證實(shí)ged-0301能夠穿透被測(cè)定的細(xì)胞，將hekblue感應(yīng)細(xì)胞(50,000/孔)與熒光素標(biāo)記的ged-0301asogn在lipofectamine(lpf，invitrogen)存在或不存在的情況下溫育48小時(shí)，然后分析細(xì)胞攝取。顯微鏡成像證實(shí)了在lipofectamine存在下與熒光素標(biāo)記的ged-0301溫育的hekblue感應(yīng)細(xì)胞比沒有用lipofectamine處理的細(xì)胞顯示出更好的攝取。

實(shí)施例2：smad7反義寡核苷酸在小鼠中的分布研究

向具有多次低劑量鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病(stz，β-細(xì)胞特異性毒素；40mg/kgi.p.連續(xù)5天)的常規(guī)b6小鼠(6周，雄性；jacksonlab.)，通過三種不同途徑給藥熒光素標(biāo)記的ged-0301反義寡核苷酸(trilink)：口服給藥(p.o.)，腹膜內(nèi)給藥(i.p.)和皮下給藥(s.c.)(125μg/小鼠＝5mg/kg；p.o.通過口腔喂食，使用500μlph9.5的碳酸氫鹽溶液，以保護(hù)免受胃降解)。在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(4小時(shí)和24小時(shí))，從兩只不同動(dòng)物收集器官并處理(一個(gè)用于顯微術(shù)，一個(gè)用于流式細(xì)胞術(shù))。收集下列器官：胰腺，肝，腎，脾，胸腺，腸，腦，血液，胰腺淋巴結(jié)，肱淋巴結(jié)，腸相關(guān)淋巴樣組織。對(duì)于流式細(xì)胞分析來說，將器官用膠原酶d(roche)消化，通過細(xì)胞濾網(wǎng)(70μm；bdfalcon)，重懸浮在hbss中，并對(duì)活細(xì)胞(可固定紫死細(xì)胞染色試劑盒；invitrogen)和白細(xì)胞(抗小鼠cd45apc；ebioscience)進(jìn)行染色。然后使用bdlsrii流式細(xì)胞儀(bdbiosciences,sanjose,ca)和軟件flowjo7.2.2版(ashland,or)，對(duì)它們進(jìn)行活細(xì)胞中的熒光素含量分析。圖3a示出了一個(gè)實(shí)例以說明用于分析流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的選通方法。圖3b包括為特定器官中活細(xì)胞中的相應(yīng)攝取百分比獲得的說明性流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，并且它們證實(shí)了通過胰腺、胰腺淋巴結(jié)和其他器官的顯著的反義寡核苷酸攝取(fitc+的百分比)(在白細(xì)胞cd45+/fitc+和其他細(xì)胞cd45-/fitc+兩者中)，特別是在s.c.給藥后。一些器官例如腦未顯示出顯著攝取。這些結(jié)果證實(shí)，使用臨床上可接受的給藥途徑包括皮下給藥，可以將ged-0301遞送到特定器官。

多通道高分辨率顯微鏡圖像(圖4)，證實(shí)了在熒光標(biāo)記的反義寡核苷酸的皮下給藥后ged-0301在小鼠胰腺中的分布，其與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖3b)相一致。顏色圖例說明：綠色–熒光ged0301，灰色–dapi(細(xì)胞核的標(biāo)志物)，紅色–胰島素(指示產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞)，以及藍(lán)色–cd45(指示cd45或白細(xì)胞共同抗原，lca，其是白細(xì)胞這種包含免疫和炎性細(xì)胞的循環(huán)血液系統(tǒng)的要素的標(biāo)志物)。

實(shí)施例3：使用smad7反義寡核苷酸的體內(nèi)研究

進(jìn)一步的體內(nèi)研究可用于確立在動(dòng)物模型中的治療效果。

在nod小鼠中smad7反義寡核苷酸的高血糖癥逆轉(zhuǎn)研究

非肥胖性糖尿病(nod)小鼠例如nod小鼠被用于干預(yù)型糖尿病預(yù)防試驗(yàn)，其中治療僅在高血糖癥發(fā)作后開始。nod小鼠是1型糖尿病的常用動(dòng)物模型(roep,b.o.等，“(不)保證的滿意：重新評(píng)估1型糖尿病動(dòng)物模型的用途”(satisfaction(not)guaranteed:re-evaluatingtheuseofanimalmodelsoftype1diabetes)，nat.rev.immunol.,2004,4,989-997)，并且它們已被用于評(píng)估大量可能的治療(shoda,l.k.等，“nod小鼠中的干預(yù)以及轉(zhuǎn)化的含義的綜合性評(píng)述”(acomprehensivereviewofinterventionsinthenodmouseandimplicationsfortranslation)，immunity,2005,23,115-126)。獲得8周齡的糖尿病前期雌性動(dòng)物(taconic)，并且從第10周(適應(yīng)環(huán)境后)開始，每周兩次監(jiān)測(cè)糖尿。在轉(zhuǎn)為陽性的動(dòng)物中，每周三次監(jiān)測(cè)血糖水平(血糖)。連續(xù)兩天具有升高的葡萄糖水平(非禁食血糖>200mg/dl)的動(dòng)物接受一顆持續(xù)釋放胰島素小球植入物(linbit,linshincanada,inc.)，以避免嚴(yán)重的高血糖癥和剩余的β-細(xì)胞的力竭/過度工作，并且開始對(duì)它們進(jìn)行治療。治療是s.c.給藥，因?yàn)檫@一途徑與臨床相關(guān)，并且上面描述的分配研究表明它在靶向胰腺、胰腺ln和可能感興趣的其他器官中有效。將動(dòng)物按照預(yù)定的旋轉(zhuǎn)模式，以它們的高血糖癥發(fā)展的次序指派到三個(gè)治療組之一。每日給藥治療(ged-0301＝smad7asogn；125μg/小鼠)和相應(yīng)的對(duì)照(sogn和僅鹽水)。動(dòng)物每周進(jìn)行兩次監(jiān)測(cè)，并評(píng)估它們維持正常血糖的能力。在植入的胰島素小球的效果消失(約25天)后，具有3個(gè)連續(xù)的>250mg/dl的葡萄糖讀數(shù)的動(dòng)物被當(dāng)作患有糖尿病并處死，收集代表性器官(胰腺，pln)。在未患有糖尿病的動(dòng)物中，在10周后停止每日治療，并對(duì)它們繼續(xù)監(jiān)測(cè)12周(直至總共150天)，以確定是否存在持久效果。在結(jié)束時(shí)，將所有動(dòng)物處死并收集代表性器官(胰腺，pln及其它)。

來自于研究的結(jié)果示出在圖5中，其中血糖水平在圖5a中，在圖5b中示出了保持無糖尿病的動(dòng)物的百分比隨時(shí)間的變化的相應(yīng)的kaplan-meier存活曲線。治療在高血糖癥發(fā)作后開始，此時(shí)β-細(xì)胞損傷已經(jīng)發(fā)生。因此，嚴(yán)重的高血糖癥可以非?？焖俚匕l(fā)展。正如由到第20-25天在具有持續(xù)釋放胰島素的linbit植入物耗盡之后它們的高血糖癥(血糖>250mg/dl)所指示的，用鹽水或正義寡核苷酸對(duì)照治療的所有動(dòng)物發(fā)展出糖尿病(分別為n＝7和6)。對(duì)于用有活性的ged-0301反義寡核苷酸治療的動(dòng)物來說，直至治療停止(第70天)后很長時(shí)間，研究結(jié)束(第150天)時(shí)，治療的11只動(dòng)物中的6只沒有發(fā)展出高血糖癥，并且它們保持無糖尿病。

為了驗(yàn)證無糖尿病動(dòng)物在研究結(jié)束時(shí)(第150天)的葡萄糖響應(yīng)，在幾只ged-0301治療的以及對(duì)照小鼠中進(jìn)行了口服葡萄糖耐受試驗(yàn)(ogtt)。通過口腔喂食向禁食16小時(shí)的小鼠給藥150mg的葡萄糖劑量，并以預(yù)定時(shí)間間隔收集血樣直至150分鐘。圖6中示出的結(jié)果證實(shí)，葡萄糖響應(yīng)以及因此胰島素分泌能力與健康動(dòng)物相當(dāng)。在所有動(dòng)物中，在口服刺激的150分鐘內(nèi)，血糖水平恢復(fù)正常。

對(duì)來自于到研究結(jié)束時(shí)(第150天)為患有糖尿病的ged-0301治療的nod小鼠的胰腺切片進(jìn)行了高分辨率共聚焦顯微鏡成像，以證實(shí)產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞的存在。圖7示出了來自于ged-0301治療的小鼠及相應(yīng)對(duì)照的胰腺的代表性含胰島切片的一系列多通道z-堆疊圖像。不同的顏色(列)如下：藍(lán)色是dapi(細(xì)胞核的標(biāo)志物)，紅色是胰島素(指示產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞)，綠色是胰高血糖素(指示產(chǎn)生胰高血糖素的α-細(xì)胞)。比例尺指示100μm。盡管正常的非糖尿病對(duì)照動(dòng)物具有含有產(chǎn)生胰島素和胰高血糖素的兩種細(xì)胞的正常胰島(頂行)，但在研究期間患有糖尿病的nod小鼠從它們的胰島中失去了產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞(底行；來自于未恢復(fù)正常血糖的正義寡核苷酸治療的小鼠)。在高血糖癥發(fā)作時(shí)開始的治療后為患有糖尿病的ged-0301反義寡核苷酸(as)治療的動(dòng)物，具有失去了其產(chǎn)生胰島素細(xì)胞的幾個(gè)胰島(從上數(shù)第二行，示出了胰高血糖素的存在，但是未示出胰島素)，但是它們也具有保留了產(chǎn)生胰島素細(xì)胞的胰島(從上數(shù)第三行)。因此，在高血糖癥發(fā)作時(shí)開始的ged-0301治療似乎能夠?qū)筺od小鼠中自體免疫攻擊的效應(yīng)，并保留足夠數(shù)量的產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞，以維持正常血糖響應(yīng)并避免高血糖癥的發(fā)作。

胰島移植中smad7反義寡核苷酸的研究

在實(shí)驗(yàn)性異體胰島移植模型中，包括在隱匿性自體免疫疾病存在下，有望恢復(fù)在局部微環(huán)境中tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)。可以進(jìn)行使用ged-0301的治療以確立靶向smad7的反義寡核苷酸對(duì)異體胰島移植物的存活和/或耐受的影響。具體來說，在通過給藥β細(xì)胞特異性毒素(stz)而產(chǎn)生糖尿病的嚙齒動(dòng)物中，可以確定ged-0301在異體移植模型中在防止胰島排斥反應(yīng)和/或延長胰島存活中的效果。主要終點(diǎn)可以包括與移植位點(diǎn)中smad7的表達(dá)/調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)的胰島異體移植存活，t淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞上的活化標(biāo)志物，treg和其他抑制細(xì)胞的頻率和抑制功能。

2型糖尿病中smad7反義寡核苷酸和低度炎癥的研究

由于低度全身和局部炎癥是糖尿病前期和2型糖尿病的特征，因此可以確定smad7在胰島內(nèi)低度炎癥的發(fā)展中的潛在作用。此外，可以研究smad7在糖尿病中的胰島血管并發(fā)癥中的作用。

糖尿病腎病中smad7反義寡核苷酸的研究

在人類糖尿病腎病和其他蛋白尿性腎小球疾病中，smad7被強(qiáng)烈上調(diào)。這種上調(diào)主要發(fā)生在足細(xì)胞這種負(fù)責(zé)腎小球過濾屏障的完整性和防止白蛋白尿的腎小球細(xì)胞中，所述白蛋白尿是普通群體中心血管結(jié)果的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。tgf-β的靶向已成為大量轉(zhuǎn)化研究努力(translationaleffort)的主題(使用吡非尼酮的試驗(yàn))。在這些努力中，對(duì)于糖尿病腎病和其他慢性腎病的治愈來說，結(jié)果出人意料地是否定的。通過smad7抑制來恢復(fù)正確的tgf-β信號(hào)傳導(dǎo)，可能是治療這些病癥的有希望的新方法。由nih糖尿病并發(fā)癥學(xué)會(huì)(consortiumondiabeticcomplications)開發(fā)的已建立的糖尿病腎病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎糜诋a(chǎn)生關(guān)于軟硬腎病轉(zhuǎn)歸(白蛋白尿、腎小球?yàn)V過率、腎小球硬化癥)的初步體內(nèi)數(shù)據(jù)。隨后的臨床研究可以在糖尿病研究所(diabetesresearchinstitute)的糖尿病腎病診所中開發(fā)。

smad7反義寡核苷酸對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌的研究

具有smad7過表達(dá)的胰腺β-細(xì)胞的小鼠，以胰島素釋放受損和禁食葡萄糖升高為特征。因此，smad7抑制可能引起胰腺β-細(xì)胞功能的改善。可以在進(jìn)行了遺傳操作以表達(dá)不同水平的smad7的人類胰島中，進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn)。在將來的研究中，可以對(duì)人類患者進(jìn)行研究以確定smad7抑制在糖尿病前期受試者中的葡萄糖不耐受中的作用。

通過引用并入

本文中引用的每個(gè)專利文獻(xiàn)和科技論文的全部公開內(nèi)容，為所有目的通過引用并入本文。

等同性

本發(fā)明可以在不背離其本質(zhì)特征的情況下體現(xiàn)為其他特定形式。因此，上述實(shí)施方式被視為說明性的，而不是對(duì)本文描述的發(fā)明的限制。由隨附的權(quán)利要求書而不是由前面的描述指明本發(fā)明的范圍，并且意圖將進(jìn)入權(quán)利要求書的等同性意義和范圍之內(nèi)的所有變化涵蓋在其中。

序列表

<110>諾格爾制藥有限公司

邁阿密大學(xué)

<120>治療糖尿病和/或促進(jìn)胰島移植后存活的方法

<130>fpi170338-99

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<213>人類

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115120125

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glnproalaglnproprosersertyrserleuproleuleuleucys

145150155160

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165170175

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