本發(fā)明屬于醫(yī)藥學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是人類尚未攻克的頑癥，預(yù)計(jì)到2030年全球?qū)⒂?600萬(wàn)新增癌癥病例，死亡例數(shù)將躍至1700萬(wàn)，而其中大多數(shù)將發(fā)生在中低收入的發(fā)展中國(guó)家，癌癥正成為新世紀(jì)人類第一殺手并成為全球最大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，惡性腫瘤造成大量勞動(dòng)力的損失，社會(huì)資源的大量消耗。據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)報(bào)道我國(guó)已經(jīng)成為世界第二大癌癥高發(fā)區(qū)；據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：城鄉(xiāng)居民前十位疾病死亡率及死亡原因中惡性腫瘤居于首位。惡性腫瘤已嚴(yán)重威脅人類的生命健康。故我國(guó)迫切需要新的更為有效的腫瘤治療技術(shù)和手段。近年來(lái)，盡管各學(xué)科(手術(shù)、放療、化療、熱療、基因治療等)都有長(zhǎng)足的發(fā)展，但隨著研究的深入，單一治療手段遠(yuǎn)非治療腫瘤的最優(yōu)策略，對(duì)患者進(jìn)行聯(lián)合治療已經(jīng)形成共識(shí)，聯(lián)合治療可發(fā)揮不同治療手段之間的協(xié)同增益效果，從而提高療效。生物熱效應(yīng)致細(xì)胞凋亡的腫瘤熱療是近年來(lái)發(fā)展較快的一種腫瘤治療手段。“現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之父”希波克拉底曾經(jīng)說(shuō)過(guò)“藥物治愈不了的疾病用手術(shù)，手術(shù)治愈不了的疾病，可以用熱來(lái)治療，用熱不能治好的疾病，就無(wú)法治愈了”。他對(duì)熱療給予了高度的評(píng)價(jià)。然而在腫瘤的臨床治療方案中，熱療多是作為術(shù)后放化療的輔助手段以提高腫瘤臨床治療的效果和患者的生存質(zhì)量。結(jié)合了熱療和腫瘤納米技術(shù)的雙重優(yōu)勢(shì)，磁感應(yīng)納米熱療將“納米磁性材料在交變磁場(chǎng)下感應(yīng)升溫”的基本原理應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。隨著材料學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程和臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科的綜合發(fā)展，功能性生物材料應(yīng)用于腫瘤綜合治療逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。迄今為止，無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是臨床試驗(yàn)，對(duì)于載體磁性納米復(fù)合微粒磁感應(yīng)熱療用于腫瘤單一治療模式，抑或是結(jié)合該治療手段與其他治療方法的腫瘤磁感應(yīng)綜合治療模式，特別是將化療藥物與溫控材料聯(lián)合用于腫瘤的磁感應(yīng)熱化療的研究鮮有報(bào)道。目前化療還是治療腫瘤的重要方法，但是其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞，對(duì)患者造成嚴(yán)重的毒副作用，具有無(wú)毒與生物相容性的磁導(dǎo)靶向石墨烯載藥系統(tǒng)可以將化療藥物定向輸送到腫瘤部位，提高對(duì)腫瘤的治療效果，降低對(duì)人體的毒副作用，而納米氧化石墨烯在808nm近紅外激光照射下的光熱轉(zhuǎn)化性能，恰好成就了其作為熱療藥源的優(yōu)勢(shì)，負(fù)載上化療藥物，經(jīng)過(guò)磁導(dǎo)靶向用藥后，借助紅外線對(duì)腫瘤病灶進(jìn)行局部照射，使特異性攝取納米藥物的腫瘤細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生過(guò)高熱，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞熱損傷及加速腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其高光學(xué)吸收特性并協(xié)同化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)雙重靶向、光熱化療聯(lián)合治療癌癥的目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，提供一種磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體及其制備方法和應(yīng)用，制備出的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani穩(wěn)定性優(yōu)良、溶解性好及生物相容性佳，并用于制備磁性納米靶向氧化石墨烯抗癌藥物。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani的制備方法，以氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體為原料，利用化學(xué)共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體的質(zhì)量比為7～8：23～25：47～49：0.5～1.5。上述的制備方法包括以下步驟：(1)將氧化石墨烯在乙二醇中超聲分散形成均勻的分散液，然后分別稱取fecl3·6h2o、醋酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，攪拌使之形成澄清溶液；(2)將上述溶液移入高壓反應(yīng)釜中于180～200℃反應(yīng)，待反應(yīng)10～12h后使之冷卻至室溫，將所得溶液用透析袋透析，得到產(chǎn)物a；(3)將產(chǎn)物a和苯胺單體加入到預(yù)分散有十二烷基苯磺酸鈉的蒸餾水中，超聲分散形成均一體系b；(4)將濃度為0.024～0.032g/ml的過(guò)硫酸銨緩慢滴加到體系b中，攪拌反應(yīng)18～24h，然后用透析袋透析后制得磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani。上述步驟(2)和步驟(4)中用透析袋透析的方法具體為用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3～4天，且每12～18h更新一次透析介質(zhì)。上述氧化石墨烯的制備方法包括以下步驟：在燒瓶中加入98％h2so4，并移入冰水浴中攪拌，穩(wěn)定溫度在10℃以下；隨即加入鱗片石墨與硝酸鈉的混合物，攪拌使其充分混合；接著加入高錳酸鉀，在10℃以下反應(yīng)2～2.5h，然后移入35℃的水浴鍋中反應(yīng)12～13h；反應(yīng)結(jié)束后向其緩慢注入去離子水并攪拌使其溶解，再在98℃中反應(yīng)15～20min后，將反應(yīng)液趁熱加入30％的h2o2并攪拌，待無(wú)氣泡產(chǎn)生后加入8％～12％的hcl溶液，攪拌均勻后進(jìn)行離心洗滌，取下層膠體冷凍干燥后得到氧化石墨烯。上述鱗片石墨、硝酸鈉、高錳酸鉀的質(zhì)量比為1～2：0.5～1.5：5～7；每1g鱗片石墨加入23～25ml的98％h2so4。利用上述的制備方法制得磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani。利用上述的制備方法制得的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani在醫(yī)藥學(xué)方面的應(yīng)用。上述的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani在醫(yī)藥學(xué)方面的應(yīng)用具體為聯(lián)合磁療、光熱療、化療法在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：本發(fā)明揭示了一種磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)hummers法進(jìn)行改良，制備氧化石墨烯(go)，以化學(xué)共沉淀方法制備出可增大go表面積、抑制fe3o4顆粒團(tuán)聚、具備磁性及靶向、光熱療法特性的復(fù)合物go-fe3o4，再以聚苯胺(pani)對(duì)其進(jìn)行修飾制備出穩(wěn)定性優(yōu)良、溶解性好及生物相容性佳的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani，以該磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體負(fù)載抗癌藥物(如cddp)，制備磁性納米靶向氧化石墨烯抗癌藥物，并對(duì)該藥物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)、靶向抗癌活性測(cè)定及機(jī)制的初步研究。本發(fā)明制得的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani，是以磁導(dǎo)靶向、載藥功能為基礎(chǔ)，兼具聯(lián)合磁療、熱療、化療多功能的抗癌新型靶向氧化石墨烯藥物載體，具有如下優(yōu)點(diǎn)：①具有良好的生物相容性；②具有良好的水溶性及穩(wěn)定性；③具有磁導(dǎo)靶向性(納米四氧化三鐵的磁性)；④具備有熱療的功效；⑤負(fù)載上抗腫瘤藥物(如順鉑)具備光熱療與靶向化療等多功能、多維度癌癥治療的功效。附圖說(shuō)明圖1是紅外光譜分析實(shí)驗(yàn)的紅外吸收光譜圖。圖2是go的掃描電鏡圖譜。圖3是go-fe3o4-pani的掃描電鏡圖譜。圖4是go-fe3o4-pani對(duì)7702細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5是go-fe3o4-pani對(duì)7721細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6是go-fe3o4-pani對(duì)hepg-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7是go-fe3o4-pani對(duì)raw264.7細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8是鐵含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖9是go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用24h的結(jié)果。圖10是go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用48h的結(jié)果。圖11是go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用72h的結(jié)果。圖12是go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用24h的結(jié)果。圖13是go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用48h的結(jié)果。圖14是go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用72h的結(jié)果。圖15是考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)用到的bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖16是吸附時(shí)間對(duì)go-fe3o4-pani吸附bsa性能的影響。圖17是初始bsa濃度對(duì)吸附的影響。圖18是go-fe3o4-pani在不同ph條件下對(duì)bsa吸附的影響。圖19是順鉑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖20是go-fe3o4-pani負(fù)載cddp的釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果。附圖標(biāo)記：a——go-fe3o4的紅外光譜；b——go的紅外光譜；c——go-fe3o4-pani的紅外光譜；1——鐵含量為0.000μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用24h的結(jié)果；2——鐵含量為3.373μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用24h的結(jié)果；3——鐵含量為6.745μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用24h的結(jié)果；4——鐵含量為0.000μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用48h的結(jié)果；5——鐵含量為3.373μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用48h的結(jié)果；6——鐵含量為6.745μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用48h的結(jié)果；7——鐵含量為0.000μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用72h的結(jié)果；8——鐵含量為3.373μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用72h的結(jié)果；9——鐵含量為6.745μg/ml的go-fe3o4-pani與7702細(xì)胞作用72h的結(jié)果；10——鐵含量為0.000μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用24h的結(jié)果；11——鐵含量為3.373μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用24h的結(jié)果；12——鐵含量為6.745μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用24h的結(jié)果；13——鐵含量為0.000μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用48h的結(jié)果；14——鐵含量為3.373μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用48h的結(jié)果；15——鐵含量為6.745μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用48h的結(jié)果；16——鐵含量為0.000μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用72h的結(jié)果；17——鐵含量為3.373μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用72h的結(jié)果；18——鐵含量為6.745μg/ml的go-fe3o4-pani與hepg-2細(xì)胞作用72h的結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例及其附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步非限制性的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1一、氧化石墨烯的制備方法在燒瓶中加入98％h2so4，并移入冰水浴中攪拌，穩(wěn)定溫度在10℃以下；隨即加入鱗片石墨與硝酸鈉的混合物，攪拌使其充分混合；接著加入高錳酸鉀，在10℃以下反應(yīng)2h，然后移入35℃的水浴鍋中反應(yīng)12h；反應(yīng)結(jié)束后向其緩慢注入去離子水并攪拌使其溶解，再在98℃中反應(yīng)15min后，將反應(yīng)液趁熱加入30％的h2o2并攪拌，待無(wú)氣泡產(chǎn)生后加入8％的hcl溶液，攪拌均勻后進(jìn)行離心洗滌，取下層膠體冷凍干燥后得到氧化石墨烯。其中鱗片石墨、硝酸鈉、高錳酸鉀的質(zhì)量比為1:0.5:5；每1g鱗片石墨加入23ml的98％h2so4。二、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani的制備方法以氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體為原料，利用化學(xué)共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體的質(zhì)量比為7：23：47：0.5。具體包括以下步驟：(1)將氧化石墨烯在乙二醇中超聲分散形成均勻的分散液(乙二醇作為溶劑)，然后分別稱取fecl3·6h2o、醋酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，攪拌使之形成澄清溶液；(2)將上述溶液移入高壓反應(yīng)釜中于180℃反應(yīng)，待反應(yīng)10h后使之冷卻至室溫，將所得溶液用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3天，且每12h更新一次透析介質(zhì)，得到產(chǎn)物a；(3)將產(chǎn)物a和苯胺單體加入到預(yù)分散有十二烷基苯磺酸鈉的蒸餾水中(十二烷基苯磺酸鈉作為表面活性劑)，超聲分散形成均一體系b；(4)將濃度為0.024g/ml的過(guò)硫酸銨緩慢滴加到體系b中，攪拌反應(yīng)18h，然后用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3天，且每12h更新一次透析介質(zhì)，制得磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani。實(shí)施例2一、氧化石墨烯的制備方法在燒瓶中加入98％h2so4，并移入冰水浴中攪拌，穩(wěn)定溫度在10℃以下；隨即加入鱗片石墨與硝酸鈉的混合物，攪拌使其充分混合；接著加入高錳酸鉀，在10℃以下反應(yīng)2.5h，然后移入35℃的水浴鍋中反應(yīng)13h；反應(yīng)結(jié)束后向其緩慢注入去離子水并攪拌使其溶解，再在98℃中反應(yīng)20min后，將反應(yīng)液趁熱加入30％的h2o2并攪拌，待無(wú)氣泡產(chǎn)生后加入12％的hcl溶液，攪拌均勻后進(jìn)行離心洗滌，取下層膠體冷凍干燥后得到氧化石墨烯。其中鱗片石墨、硝酸鈉、高錳酸鉀的質(zhì)量比為2：1.5：7；每1g鱗片石墨加入25ml的98％h2so4。二、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani的制備方法以氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體為原料，利用化學(xué)共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體的質(zhì)量比為8：25：49：1.5。具體包括以下步驟：(1)將氧化石墨烯在乙二醇中超聲分散形成均勻的分散液，然后分別稱取fecl3·6h2o、醋酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，攪拌使之形成澄清溶液；(2)將上述溶液移入高壓反應(yīng)釜中于200℃反應(yīng)，待反應(yīng)12h后使之冷卻至室溫，將所得溶液用分子截留量為8000～14000的透析袋透析4天，且每18h更新一次透析介質(zhì)，得到產(chǎn)物a；(3)將產(chǎn)物a和苯胺單體加入到預(yù)分散有十二烷基苯磺酸鈉的蒸餾水中，超聲分散形成均一體系b；(4)將濃度為0.032g/ml的過(guò)硫酸銨緩慢滴加到體系b中，攪拌反應(yīng)24h，然后用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3天，且每18h更新一次透析介質(zhì)，制得磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani。實(shí)施例3一、氧化石墨烯的制備方法在燒瓶中加入98％h2so4，并移入冰水浴中攪拌，穩(wěn)定溫度在10℃以下；隨即加入鱗片石墨與硝酸鈉的混合物，攪拌使其充分混合；接著加入高錳酸鉀，在10℃以下反應(yīng)2.3h，然后移入35℃的水浴鍋中反應(yīng)12.5h；反應(yīng)結(jié)束后向其緩慢注入去離子水并攪拌使其溶解，再在98℃中反應(yīng)18min后，將反應(yīng)液趁熱加入30％的h2o2并攪拌，待無(wú)氣泡產(chǎn)生后加入10％的hcl溶液，攪拌均勻后進(jìn)行離心洗滌，取下層膠體冷凍干燥后得到氧化石墨烯。其中鱗片石墨、硝酸鈉、高錳酸鉀的質(zhì)量比為2：1：6；每1g鱗片石墨加入24ml的98％h2so4。二、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani的制備方法以氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體為原料，利用化學(xué)共沉淀法以及原位合成法制得；所述氧化石墨烯、fecl3·6h2o、醋酸鈉和苯胺單體的質(zhì)量比為7：24：48：1。具體包括以下步驟：(1)將氧化石墨烯在乙二醇中超聲分散形成均勻的分散液(乙二醇作為溶劑)，然后分別稱取fecl3·6h2o、醋酸鈉和聚乙烯吡咯烷酮溶解于乙二醇中，攪拌使之形成澄清溶液；(2)將上述溶液移入高壓反應(yīng)釜中于190℃反應(yīng)，待反應(yīng)11h后使之冷卻至室溫，將所得溶液用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3.5天，且每15h更新一次透析介質(zhì)，得到產(chǎn)物a；(3)將產(chǎn)物a和苯胺單體加入到預(yù)分散有十二烷基苯磺酸鈉的蒸餾水中(十二烷基苯磺酸鈉作為表面活性劑)，超聲分散形成均一體系b；(4)將濃度為0.029g/ml的過(guò)硫酸銨緩慢滴加到體系b中，攪拌反應(yīng)18h，然后用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3.5天，且每15h更新一次透析介質(zhì)，制得磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani。實(shí)施例4一、氧化石墨烯(go)的制備方法在250ml燒瓶中加入11.5ml的98％h2so4，將燒瓶移入冰水浴中低速攪拌，穩(wěn)定溫度在10℃以下；隨即加入0.5g鱗片石墨與0.25g硝酸鈉的混合物，中速攪拌30min使其充分混合；接著在1h內(nèi)分6次加入1.5g高錳酸鉀，在10℃以下(低溫)反應(yīng)2.5h后，此時(shí)反應(yīng)液變?yōu)槟G色，將反應(yīng)瓶移入35℃(中溫)的水浴鍋中繼續(xù)反應(yīng)13h；反應(yīng)結(jié)束后向其中緩慢注入23ml的去離子水并攪拌，保持溫度98℃攪拌20min，接著將反應(yīng)液倒入500ml的燒杯中，趁熱加入20ml30％h2o2并攪拌，溶液立即變?yōu)榱咙S色；待無(wú)氣泡產(chǎn)生后加入10mlhcl(1:10)的稀溶液，攪拌均勻后2000rpm離心10min，獲取下層膠體，用預(yù)先制備好的10％hcl溶液洗滌3～5遍，再用去離子水反復(fù)充分洗滌，直至上層液體ph＝7，將上層液分離，下層膠體冷凍干燥48h后即得氧化石墨烯，密封保存?zhèn)溆谩６?、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體氧化石墨烯-四氧化三鐵-聚苯胺(go-fe3o4-pani)的制備(1)將0.25g氧化石墨烯在80ml乙二醇中超聲3h分散形成均勻的分散液，然后稱取0.8gfecl3·6h2o、1.6g醋酸鈉和2.49g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，溶解于70ml乙二醇中，攪拌使之形成澄清溶液；(2)將所得溶液移入高壓反應(yīng)釜中200℃反應(yīng)10h，反應(yīng)完成后使之冷卻至室溫，將所得墨綠色溶液用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3天，每12h更換一次透析介質(zhì)，得到產(chǎn)物a；(3)將10ml產(chǎn)物a和0.5g苯胺單體加入到預(yù)分散有2.5g十二烷基苯磺酸鈉的20ml蒸餾水中，超聲分散60min形成均一體系b；(4)將0.7g過(guò)硫酸銨溶解于25ml蒸餾水中，緩慢滴加到體系b中，攪拌反應(yīng)12h后用分子截留量為8000～14000的透析袋透析3天，每12h更換一次透析介質(zhì)，得到水溶性良好的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)施例5一、氧化石墨烯(go)的制備方法在250ml燒瓶中加入24ml的98％h2so4，將燒瓶移入冰水浴中低速攪拌，穩(wěn)定溫度在10℃以下；隨即加入1g鱗片石墨與1g硝酸鈉的混合物，中速攪拌25min使其充分混合；接著在1h內(nèi)分4次加入5g高錳酸鉀，在10℃以下(低溫)反應(yīng)2.5h后，此時(shí)反應(yīng)液變?yōu)槟G色，將反應(yīng)瓶移入35℃(中溫)的水浴鍋中繼續(xù)反應(yīng)12h；反應(yīng)結(jié)束后向其中緩慢注入40ml的去離子水并攪拌，保持溫度98℃攪拌20min，接著將反應(yīng)液倒入500ml的燒杯中，趁熱加入30ml30％h2o2并攪拌，溶液立即變?yōu)榱咙S色；待無(wú)氣泡產(chǎn)生后加入10mlhcl(1:10)的稀溶液，攪拌均勻后2000rpm離心12min，獲取下層膠體，用預(yù)先制備好的12％hcl溶液洗滌3～5遍，再用去離子水反復(fù)充分洗滌，將上層液分離，下層膠體冷凍干燥40h后即得氧化石墨烯，密封保存?zhèn)溆?。二、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體氧化石墨烯-四氧化三鐵-聚苯胺(go-fe3o4-pani)的制備(1)將0.5g氧化石墨烯在100ml乙二醇中超聲4h分散形成均勻的分散液，然后稱取1.7gfecl3·6h2o、3.3g醋酸鈉和5.0g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，溶解于80ml乙二醇中，攪拌使之形成澄清溶液；(2)將所得溶液移入高壓反應(yīng)釜中190℃反應(yīng)11h，反應(yīng)完成后使之冷卻至室溫，將所得墨綠色溶液用分子截留量為8000～14000的透析袋透析4天，每12h更換一次透析介質(zhì)，得到產(chǎn)物a；(3)將20ml產(chǎn)物a和1.0g苯胺單體加入到預(yù)分散有5.0g十二烷基苯磺酸鈉的40ml蒸餾水中，超聲分散60min形成均一體系b；(4)將0.96g過(guò)硫酸銨溶解于30ml蒸餾水中，緩慢滴加到體系b中，攪拌反應(yīng)11h后用分子截留量為8000～14000的透析袋透析4天，每12h更換一次透析介質(zhì)，得到水溶性良好的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠脤?shí)施例1至實(shí)施例5的制備方法制得的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani，并將其應(yīng)用在醫(yī)藥學(xué)方面，具體為負(fù)載抗癌藥物(如cddp)，聯(lián)合磁療、光熱療、化療法在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用。利用本發(fā)明的制備方法制出的磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani分別用于人正常肝細(xì)胞株7702、smmc-7721細(xì)胞株、人肝癌hepg-2及小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞raw264.7的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和胎牛血清白蛋白bsa吸附實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani具有良好的生物相容性，為氧化石墨烯磁性納米靶向載藥體系及其聯(lián)合光熱療法在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：一、紅外光譜分析實(shí)驗(yàn)稱取干燥的go-fe3o4-pani1mg與100mgkbr粉末于瑪瑙研缽研磨均勻，壓成薄片，放入樣品室，以氧化石墨烯、氧化石墨烯-四氧化三鐵為對(duì)照，通過(guò)傅里葉紅外變換光譜儀在4000～400cm-1范圍內(nèi)掃描，得到如圖1所示的紅外吸收光譜圖，光譜a為go-fe3o4，光譜b為go，光譜c為go-fe3o4-pani。由圖1可知，光譜a中3436.00cm-1處吸收峰和光譜b中3402.95cm-1處吸收峰歸屬于oh的伸縮振動(dòng)峰；光譜a中2925.75cm-1處附近的吸收峰屬于ch2的伸縮振動(dòng)峰；光譜b中1735.59cm-1處吸收峰和1620.36cm-1處吸收峰歸屬于go邊緣的c＝o伸縮振動(dòng)；1487.65cm-1處吸收峰歸屬于go表面的c-o-c伸縮振動(dòng)。結(jié)果表明，本發(fā)明中的石墨烯被氧化，且至少有oh、cooh、c＝o、c-o-c這四種官能團(tuán)，這些極性基團(tuán)使go具有良好的親水性。光譜a比光譜b在587.52cm-1處多了一個(gè)強(qiáng)吸收峰，這是fe-o-fe的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明制得了純度較高的go-fe3o4。光譜c中587.52cm-1處附近的吸收峰相對(duì)于光譜a中弱了很多，且光譜c中可以明顯的觀察到pani的特征吸收峰(1139.09、1300.44、1494.87和1579.29cm-1)，證明pani成功的包覆在go-fe3o4表面。二、掃描電鏡分析實(shí)驗(yàn)圖2為go的掃描電鏡圖譜(sem圖)，圖3為go-fe3o4-pani的掃描電鏡圖譜(sem圖)，從圖2中我們可以看出合成了單層氧化石墨烯(go)，表面上有些許類似波動(dòng)的褶皺是由于碳的存在；而在圖3中清楚地看見(jiàn)單層狀的氧化石墨烯表面分布著很過(guò)顆粒狀的物質(zhì)，其中類似圓球形的顆粒狀物質(zhì)就是磁性納米四氧化三鐵(fe3o4)，而另外一些類似橢圓形的顆粒則是吸附上的提高生物相容性的聚苯胺(pani)顆粒。fe3o4和pani吸附分散在氧化石墨烯的表面抑制了其的卷曲和皺縮，增大了表面積。三、水溶性靶向載體go-fe3o4-pani濃度的確定及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按照《藥典(2015年版)》規(guī)定利用恒重法計(jì)算水溶性靶向載體go-fe3o4-pani的濃度，準(zhǔn)備三個(gè)潔凈的表面皿在十萬(wàn)分之一天平上精密稱取其質(zhì)量并編號(hào)記錄，用移液槍精確吸取1ml液體轉(zhuǎn)移入表面皿中平鋪，放入烘箱中干燥至恒重，稱量，利用減重法計(jì)算得出載體濃度。取100μl的水溶性納米載體于玻璃離心管中分別加入蒸餾水和dmem完全培養(yǎng)基稀釋至6ml，充分混勻然后靜置，每隔一段時(shí)間觀察其是否有沉淀析出以判斷其穩(wěn)定性。結(jié)果：靶向載體溶于蒸餾水，放置30天；靶向載體溶于dmem完全培養(yǎng)基，同樣放置30天。根據(jù)《藥典(2015年版)》中關(guān)于溶解度的定義及分類判斷，我們所制備的靶向載藥水溶性良好，溶液中并沒(méi)有靶向載體物質(zhì)析出，說(shuō)明該載體穩(wěn)定性良好，為其在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。四、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani對(duì)細(xì)胞毒性及免疫原性的檢測(cè)(1)mtt法檢測(cè)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani對(duì)細(xì)胞的毒性：原理：mtt為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，活細(xì)胞中含有脫氫酶，mtt試劑能被脫氫酶還原成不溶于水的藍(lán)紫色mtt-甲瓚結(jié)晶沉淀在細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞沒(méi)有此功能。dmso能溶解細(xì)胞內(nèi)沉淀的藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)，溶解后溶液的顏色與細(xì)胞內(nèi)沉積德甲瓚量成正比，用酶標(biāo)儀可測(cè)定溶液的od值。實(shí)驗(yàn)步驟：①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來(lái)，800r/min離心5min棄上清液；②培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)；③將細(xì)胞稀釋，配制成密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液；④接種到96孔板中，每孔100μl，周圍用pbs緩沖溶液填充防止邊緣化；⑤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁；⑥加入納米粒子，設(shè)置對(duì)照組，8個(gè)濃度(終濃度為0.977、1.953、3.906、7.813、15.625、31.250、62.500、125.000μg/ml)，每孔加入100μl；⑦將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h和72h；⑧24h、48h和72h后，每孔加入20μlmtt，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h；⑨小心吸掉孔內(nèi)上清液，每孔加入150μldmso溶解細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)，震蕩10min是完全溶解；⑩在免疫酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度(a)值。按照公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率：細(xì)胞相對(duì)增殖率(％)＝(實(shí)驗(yàn)組a均值/陰性對(duì)照組a均值)×100％將細(xì)胞相對(duì)增殖率值轉(zhuǎn)換成6級(jí)(如表1所示)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0或者1級(jí)則為合格，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2級(jí)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3～5級(jí)則為不合格。表1細(xì)胞相對(duì)增殖率與毒性分級(jí)轉(zhuǎn)換分級(jí)細(xì)胞相對(duì)增殖率(％)0級(jí)≥1001級(jí)75～992級(jí)50～743級(jí)25～494級(jí)1～245級(jí)0結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4至7所示，在一段時(shí)間內(nèi)，隨著納米載體濃度的增加并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p>0.05，不同濃度對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯差異。圖4、圖6和圖7中g(shù)o-fe3o4-pani在24h、48h、72h時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖率和細(xì)胞毒性分級(jí)結(jié)果顯示各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率均在80～140％之間，細(xì)胞毒性分級(jí)為1或0。圖5中g(shù)o-fe3o4-pani在24h、48h、72h時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖率和細(xì)胞毒性分級(jí)結(jié)果顯示各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率均在80～150％之間，細(xì)胞毒性分級(jí)為1或0。go-fe3o4-pani對(duì)7702、7721、hepg-2和raw264.7細(xì)胞的增殖相當(dāng)?？傊?，從總的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，go-fe3o4-pani分別與正常肝細(xì)胞7702、肝癌細(xì)胞7721、肝癌細(xì)胞hepg-2及小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞raw264.7直接接觸未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性分別為0級(jí)或1級(jí)。并且由go-fe3o4-pani與小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞raw264.7直接接觸未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性還可以說(shuō)明該納米載體無(wú)免疫原性。五、磁性納米靶氧化石墨烯藥物向載體go-fe3o4-pani的體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)(1)鄰二氮菲法測(cè)定鐵含量測(cè)定原理：以鹽酸羥胺將fe3+還原為fe2+，在ph＝2～9的范圍內(nèi)，與鄰二氮菲反應(yīng)生成穩(wěn)定的橙紅色配合物[(c12h8n2)3fe]2+，最大吸收峰在510nm處。①100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液的配制精密稱取0.04305g硫酸鐵胺，加1:1的鹽酸溶液40.00ml和少量蒸餾水,轉(zhuǎn)移至50.00ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻即得。②10％鹽酸羥胺溶液的配制精密稱取2.5300g鹽酸羥胺至25.00ml容量瓶中,蒸餾水溶解并稀釋至刻度,搖勻即得。③0.15％鄰二氮菲溶液的配制精密稱取0.0751g鄰二氮菲在5.00ml乙醇中攪拌溶解后，轉(zhuǎn)移至50.00ml的容量瓶中加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻即得。④1.00mol/lnaac溶液的配制精密稱取13.7000gnaac，先用少量蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中稀釋至刻度,搖勻即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：①在6只50.00ml的具塞比色管中，分別精密移取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液；②加入1.00ml10％鹽酸羥胺溶液，2.00ml0.15％鄰二氮菲溶液和5.00ml1.00mol/lnaac溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻；③在510nm波長(zhǎng)下，用1cm的石英比色皿以試劑溶液為空白，測(cè)定其各溶液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鐵濃度的測(cè)定：①精密移取0.50ml樣品溶液，加入7.50ml濃鹽酸充分反應(yīng)10min，轉(zhuǎn)移至50.00ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻；②精密移取1.00ml①中溶液置于50.00ml的具塞比色管中，加入1.00ml10％鹽酸羥胺溶液，2.00ml0.15％鄰二氮菲溶液和5.00ml1.00mol/lnaac溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置10min，待其充分顯色后，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)溶液吸光度，代入繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算樣品中鐵含量。結(jié)果：如圖8所示，實(shí)驗(yàn)得出鐵含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.201x+0.008，r2＝0.9994。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出go-fe3o4-pani中鐵含量為：710μg/ml。(2)普魯士藍(lán)染色觀察比較細(xì)胞內(nèi)鐵粒子含量鐵染色的原理：fe3+在酸性條件下與亞鐵氰化鉀(k4fe(cn)6)通過(guò)普魯士藍(lán)反應(yīng)生成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，可反映組織細(xì)胞內(nèi)攝取的go-fe3o4-pani納米粒子的情況。反應(yīng)式為：4fe3++3k4(fe(cn)6)→fe4(fe(cn)6)3+12k+實(shí)驗(yàn)步驟：①取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的7702細(xì)胞和hepg-2細(xì)胞消化離心后用dmem高糖完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/ml，接種于6孔板中，每孔體積1000μl。②貼壁生長(zhǎng)24h后吸棄所有孔內(nèi)的培養(yǎng)基，分別加入1000μlgo-fe3o4-pani培養(yǎng)24h、48h、72h，藥物濃度按fe含量計(jì)算依次為0.000、3.373、6.745μg/ml。③吸棄全部培養(yǎng)液體，pbs緩沖溶液充分洗滌去除未被攝取的納米載體。④每孔加入1000μl4％多聚甲醛溶液室溫下固定30min，然后雙蒸水充分洗滌，加入200μl普魯士藍(lán)染液染色，室溫下避光作用30min。⑤雙蒸水洗滌后加入200μl中性紅作核染對(duì)比染色10min，加入雙蒸水充分洗滌后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果：普魯士藍(lán)染色的圖片如圖9至14所示，為不同濃度的藥物分別與7702細(xì)胞和hepg-2細(xì)胞作用不同時(shí)間的結(jié)果，藥物濃度按fe含量計(jì)算依次為0.000、3.373、6.745μg/ml，細(xì)胞內(nèi)的鐵均被染為藍(lán)色或者藍(lán)紫色。從實(shí)驗(yàn)拍攝的圖片中我們可以看出細(xì)胞的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯的異常，由此表明go-fe3o4-pani進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)并且沒(méi)有影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)繁殖，而go-fe3o4-pani是經(jīng)過(guò)何種方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。六、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani生物相容性的檢測(cè)(1)牛血清白蛋白bsa吸附實(shí)驗(yàn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取0.0170g牛血清白蛋白，用蒸餾水溶解并定容稀釋至100ml，配成濃度為0.1700mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白液。精密稱取0.0100g考馬斯亮藍(lán)g-250，用5.00ml無(wú)水乙醇充分溶解后，加入10.00ml85％磷酸，隨即轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶并用蒸餾水定容，即為0.1000mg/ml考馬斯亮藍(lán)g-250溶液。①bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密移取蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μl于試管中，再加入蒸餾水補(bǔ)充至1.00ml，加入5.00ml0.1000mg/ml考馬斯亮藍(lán)g-250溶液充分搖勻后靜置5min，于595nm波長(zhǎng)處測(cè)定每管溶液的紫外吸光度，以bsa濃度為橫坐標(biāo)，a595吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②吸附時(shí)間對(duì)bsa吸附的影響用ph＝7.4的pbs緩沖溶液配制納米載體溶液，濃度為5mg/ml，bsa的初始濃度為0.6mg/ml，納米載體溶液與bsa溶液以體積1:1的比例充分混勻后37℃水浴分別超聲吸附30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min，超聲后各取1.0ml并加入5.00ml考馬斯亮藍(lán)g-250工作液，室溫下顯色反應(yīng)5min，595nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紫外吸收，利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到納米載體對(duì)bsa的吸附量隨時(shí)間的變化規(guī)律。③bsa初始濃度對(duì)bsa吸附的影響用上述方法配制納米載體溶液，濃度為5mg/ml，bsa的初始濃度分別為0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml，納米載體溶液與bsa溶液以體積1:1的比例充分混勻后37℃水浴超聲吸附120min，超聲后各取1.0ml并加入5.00ml考馬斯亮藍(lán)g-250工作液，室溫下顯色反應(yīng)5min，595nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紫外吸收，利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到納米載體對(duì)bsa的吸附量隨bsa初始濃度的變化規(guī)律。④ph對(duì)bsa吸附的影響用0.2m的磷酸氫二鈉與0.2m的磷酸二氫鈉不同體積比混合組成不同ph緩沖溶液，其中ph值分別為5.7、6.0、6.8、7.0、7.4和8.0，用不同的緩沖溶液配制納米載體溶液，濃度均為5mg/ml，bsa的初始濃度為0.6mg/ml，納米載體溶液與bsa以體積1:1的比例充分混勻后37℃水浴超聲吸附120min，超聲后各取1.0ml并加入5.00ml考馬斯亮藍(lán)g-250工作液，室溫下顯色反應(yīng)5min，595nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紫外吸收，利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到納米載體對(duì)bsa的吸附量隨ph的變化規(guī)律。結(jié)果：如圖15所示，為考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)用到的bsa標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為bsa濃度，其濃度范圍為0～30μg/ml，縱坐標(biāo)為不同bsa濃度對(duì)應(yīng)的吸光度值，得到線性回歸方程：y＝0.0361x+0.1093，r2＝0.9989。如圖16所示，為吸附時(shí)間對(duì)go-fe3o4-pani吸附bsa性能的影響。圖中表明當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到120min時(shí)，go-fe3o4-pani對(duì)bsa的吸附量達(dá)到最大值，由于ph＝7.4時(shí)，go-fe3o4-pani表面的負(fù)電荷量(絕對(duì)值)最小，此時(shí)bsa表面帶有負(fù)電荷，與go-fe3o4-pani的靜電斥力最弱，因此對(duì)bsa的吸附量最多。如圖17所示，為初始蛋白濃度對(duì)bsa吸附的影響。bsa吸附量隨其初始濃度的增加而增多，當(dāng)初始濃度為1.0mg/ml時(shí)，go-fe3o4-pani對(duì)bsa吸附量最大，綜合考慮到吸光度值大小、go-fe3o4-pani量的多少以及線性問(wèn)題，我們選擇了初始濃度為0.6mg/ml作為研究濃度。如圖18所示，為go-fe3o4-pani在不同ph條件下對(duì)bsa吸附的影響。一般情況下，牛血清白蛋白(bsa)的等電點(diǎn)pi＝4.8，當(dāng)ph>pi時(shí)，由于ph＝7.4時(shí)，go-fe3o4-pani表面的負(fù)電荷量(絕對(duì)值)最小，此時(shí)bsa表面帶有負(fù)電荷，與go-fe3o4-pani的靜電斥力最弱，因此對(duì)bsa的吸附量最多。七、磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani載藥釋藥性能的研究(1)順鉑標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取5mg順鉑置于10.00ml的容量瓶中，加入ph＝6.0的pbs緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻得濃度為0.5mg/ml儲(chǔ)備液，配制濃度為240、160、80、64、48、32、16、8、0μg/ml的順鉑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按體積比1:1加入鄰苯二胺的dmf溶液，然后加熱顯色703nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線備用。結(jié)果：順鉑的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖19所示：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.0351x-0.032，r2＝0.9963。(2)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani負(fù)載順鉑(cddp)實(shí)驗(yàn)將go-fe3o4-pani用ph＝6.0的pbs緩沖溶液配制成1mg/ml溶液共10.00ml，然后加入5mgcddp避光攪拌24h，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分子截留量為8000～14000的透析袋避光透析3d(每12h更換一次透析介質(zhì))以除去游離的cddp，冷凍干燥得到go-fe3o4-pani-cddp，在十萬(wàn)分之一天平稱重計(jì)算載藥率。載藥率計(jì)算公式如下：載藥率＝(微球中藥物的質(zhì)量/微球的總質(zhì)量)×100％結(jié)果：計(jì)算得出載藥率為82.57％。(3)go-fe3o4-pani-cddp釋藥實(shí)驗(yàn)將go-fe3o4-pani用ph＝6.0的pbs緩沖溶液配制成1mg/ml溶液共10.00ml，然后加入5mgcddp避光攪拌24h，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分子截留量為8000～14000的透析袋避光透析3d(每12h更換一次透析介質(zhì))以除去游離的cddp，將透析袋連同里面的反應(yīng)液一起轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的100ml燒杯中，透析袋外介質(zhì)補(bǔ)充40mlph＝6.0的pbs緩沖溶液使總體積為50ml，然后37℃水浴磁力攪拌，每隔1h用移液槍精密吸取3.00ml透析外液于15ml離心管中并做好標(biāo)記，再補(bǔ)充相同體積ph＝6.0的緩沖溶液，12h之后攪拌過(guò)夜(12h),第二天也是每隔1h取一次出來(lái)，連續(xù)取12h。取出來(lái)的液體按體積比1:1加入鄰苯二胺的dmf溶液，然后加熱顯色703nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。結(jié)果:go-fe3o4-pani負(fù)載cddp的釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖20所示，從圖中我們可以明顯看出，隨著釋藥時(shí)間的增加，釋藥量也在逐漸增加，當(dāng)釋藥時(shí)間達(dá)到10h左右時(shí)，藥物的釋放量基本趨于穩(wěn)定，因此可以證明該載體對(duì)藥物的釋放具有一定緩釋的作用。上述實(shí)驗(yàn)表明，磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani在醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用包括以下5個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani具有良好的水溶性，便于人體注射或者口服以及吸收利用；(2)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani用于人肝癌hepg-2、smmc-7721細(xì)胞株、人正常肝細(xì)胞株7702及小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞raw264.7的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明該載體在0～125μg/ml之間對(duì)人體是無(wú)毒的，表明載體在0～125μg/ml的濃度范圍內(nèi)應(yīng)用于人體是安全的；(3)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani用于胎牛血清白蛋白bsa吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該載體具有良好的生物相容性；(4)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani用于人肝癌hepg-2細(xì)胞株及人正常肝細(xì)胞株7702的體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明該載體是破膜或穿膜通過(guò)進(jìn)入靶細(xì)胞的；(5)磁性納米靶向氧化石墨烯藥物載體go-fe3o4-pani通過(guò)負(fù)載抗癌藥物cddp及其釋放實(shí)驗(yàn)表明該載體具有較高的載藥率，可達(dá)82.57％，載藥量及釋放量滿足殺死肝癌細(xì)胞的常規(guī)劑量(文獻(xiàn)報(bào)道順鉑殺死肝癌細(xì)胞濃度在20μg/ml以內(nèi)，而本發(fā)明的釋藥量穩(wěn)定時(shí)可達(dá)40μg/ml)并具有緩釋的效果。當(dāng)前第1頁(yè)12