本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種大蒜提取物的應(yīng)用和應(yīng)用其的產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱。癌細(xì)胞的特點是無限制、無止境地增生，使患者體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗。并且，癌細(xì)胞通過釋放出多種毒素，會使人體產(chǎn)生一系列癥狀。同時，癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到全身各處生長增殖，導(dǎo)致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等等。

其中，肝細(xì)胞癌(hcc)是最常見的原發(fā)性肝癌腫瘤，是全球癌癥死亡的主要原因。它的發(fā)展與多種因素和條件有關(guān)，包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎、病毒感染，慢性攝入酒精、食物中的致癌物質(zhì)或者肝硬化。目前，治療肝癌最常用的方法是綜合治療，即中西醫(yī)結(jié)合治療手術(shù)、放療、化療及中醫(yī)藥化療。

順鉑(ddp)是一種最廣泛抗腫瘤藥物，免疫印跡分析顯示，順鉑可下調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2并且上調(diào)促凋亡蛋白bax。然而，因為其耐藥性和毒副作用，如腎毒性、外周神經(jīng)毒性和耳毒性等副作用，給病人帶來極大痛苦，且對病人機(jī)體的免疫系統(tǒng)損傷也較大，致使順鉑的使用受到嚴(yán)重限制，導(dǎo)致其在非特異性全身器官和腫瘤內(nèi)的濃度與分布均不足，達(dá)不到治療疾病的最優(yōu)藥物濃度。

多糖是大分子碳水化合物，不僅在生物體的生長發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，也是重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。近年來，許多多糖已從自然資源中分離出來，他們在抗擊癌癥中起著重要作用，具有廣泛的生物學(xué)特性。大蒜提取物中的大蒜多糖(gps)是liliaceae家族的大蒜的主要活性成分。作為一種雜多糖，大蒜多糖由果聚糖和少量的葡萄糖組成。研究表明大蒜多糖具有多種活性，如強(qiáng)抗氧化，抗病毒，保護(hù)角質(zhì)層抗紫外線，保護(hù)肝臟和增強(qiáng)免疫活性等。

因此，開發(fā)一種毒副作用小，抑制腫瘤生長同時能夠誘導(dǎo)早期腫瘤細(xì)胞凋亡的有效的抗肝癌藥物尤為重要。目前，利用大蒜提取物作為低毒高效的輔助抗腫瘤候選藥物尚未見報道。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供大蒜提取物在制備降低化療藥物毒副作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種用于降低化療藥物毒副作用的藥物；

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種大蒜提取物在制備抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用；以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的化療藥物毒副作用大，尚未發(fā)現(xiàn)低毒高效的輔助抗腫瘤的候選藥物的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種大蒜提取物的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括所述大蒜提取物在制備降低化療藥物毒副作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用和在制備抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述大蒜提取物為大蒜多糖。

進(jìn)一步地，所述毒副作用包括腎毒性、耳毒性和神經(jīng)毒性中的一種或多種。

進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品為藥物。

進(jìn)一步地，所述腫瘤為肝癌。

進(jìn)一步地，所述肝癌包括單純型、硬化型和炎癥型中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種用于降低化療藥物毒副作用的藥物，所述藥物包括上述的大蒜提取物。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于抗腫瘤的藥物，所述藥物包括上述的大蒜提取物。

進(jìn)一步地，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載劑或輔料。

進(jìn)一步地，所述化療藥物為順鉑。

本發(fā)明提供的大蒜提取物，通過實驗發(fā)現(xiàn)能夠表現(xiàn)一定的抗腫瘤活性，通過應(yīng)用由大蒜提取物制備的產(chǎn)品，能夠起到抗腫瘤的作用；同時，將大蒜提取物聯(lián)合化療藥物共同作用于腫瘤細(xì)胞，能夠通過縮短作用時間，降低化療藥物使用量，降低其毒副作用；并且，大蒜為食藥兩用植物，應(yīng)用大蒜作為輔助抗腫瘤的藥物，在能夠降低化療藥物毒副作用的同時，不產(chǎn)生其他不良反應(yīng)，用藥更安全。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例1提供的應(yīng)用q-sepharose陰離子交換層析柱測得的洗脫曲線結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實施例2提供的應(yīng)用sephadexg-50凝膠滲透色譜柱測得的洗脫曲線結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實施例5提供的大蒜多糖和順鉑對hepg2細(xì)胞增殖的抑制作用的結(jié)果圖；

圖4a為本發(fā)明實施例6提供的空白對照組細(xì)胞用hoechst33342染色后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

圖4b為本發(fā)明實施例6提供的1mg/ml大蒜多糖組細(xì)胞用hoechst33342染色后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

圖4c為本發(fā)明實施例6提供的1mg/ml大蒜多糖與5μg/ml順鉑共同作用組細(xì)胞用hoechst33342染色后倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖；

圖5a為本發(fā)明實施例7提供的空白對照組hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5b為本發(fā)明實施例7提供的單獨應(yīng)用0.5μg/ml順鉑作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5c為本發(fā)明實施例7提供的單獨應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5d為本發(fā)明實施例7提供的聯(lián)合應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5e為本發(fā)明實施例7提供的單獨應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5f為本發(fā)明實施例7提供的聯(lián)合應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5g為本發(fā)明實施例7提供的單獨應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖5h為本發(fā)明實施例7提供的聯(lián)合應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時hepg2細(xì)胞株細(xì)胞周期相分布結(jié)果圖；

圖6a為本發(fā)明實施例8提供的空白對照組hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡情況結(jié)果圖；

圖6b為本發(fā)明實施例8提供的單獨應(yīng)用0.5μg/ml順鉑作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6c為本發(fā)明實施例8提供的單獨應(yīng)用5μg/ml順鉑作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6d為本發(fā)明實施例8提供的單獨應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6e為本發(fā)明實施例8提供的單獨應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6f為本發(fā)明實施例8提供的單獨應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6g為本發(fā)明實施例8提供的聯(lián)合應(yīng)用0.25mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6h為本發(fā)明實施例8提供的聯(lián)合應(yīng)用0.5mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖6i為本發(fā)明實施例8提供的聯(lián)合應(yīng)用1.0mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明實施例8提供的單獨應(yīng)用大蒜多糖和大蒜多糖與順鉑聯(lián)合應(yīng)用作用48小時對hepg2細(xì)胞株細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

在腫瘤治療過程中，通常會使用廣譜抗腫瘤藥物，例如順鉑。但此類藥物的使用往往伴有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，包括腎毒性、外周神經(jīng)毒性和耳毒性等副作用，給病人帶來極大痛苦，對病人機(jī)體的免疫系統(tǒng)損傷也較大，致使其使用受到嚴(yán)重限制，在非特異性全身器官和腫瘤內(nèi)的濃度與分布均不足，達(dá)不到治療疾病的最優(yōu)藥物濃度。

因此，針對上述問題，本發(fā)明提供了大蒜提取物的應(yīng)用，包括大蒜提取物在制備降低化療藥物毒副作用的產(chǎn)品中的應(yīng)用和在制備抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，大蒜提取物為大蒜多糖。

在本發(fā)明中，毒副作用包括腎毒性、耳毒性和神經(jīng)毒性中的一種或多種。

在本發(fā)明中，產(chǎn)品為藥物。

在本發(fā)明中，腫瘤為肝癌。

在本發(fā)明中，肝癌包括單純型、硬化型和炎癥型中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種用于降低化療藥物毒副作用的藥物，包括上述的大蒜提取物。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于抗腫瘤的藥物，包括上述的大蒜提取物。

在本發(fā)明中，藥物還包括藥學(xué)上可接受的載劑或輔料。

其中，載劑例如可以為，但不限于殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒中的一種或多種；輔料例如可以為，但不限于糊精、淀粉或蔗糖。

在本發(fā)明中，藥物的劑型例如可以為，但不限于片劑、膠囊或沖劑。

在本發(fā)明中，化療藥物為順鉑。

本發(fā)明提供的大蒜提取物，通過實驗發(fā)現(xiàn)能夠表現(xiàn)一定的抗腫瘤活性，通過應(yīng)用由大蒜提取物制備的產(chǎn)品，能夠起到抗腫瘤的作用；同時，將大蒜提取物聯(lián)合化療藥物共同作用于腫瘤細(xì)胞，能夠通過縮短作用時間，降低化療藥物使用量，降低其毒副作用；并且，大蒜為食藥兩用植物，應(yīng)用大蒜作為輔助抗腫瘤的藥物，在能夠降低化療藥物毒副作用的同時，不產(chǎn)生其他不良反應(yīng)，用藥更安全。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實施例詳細(xì)介紹如下。如未明確指出，以下實施例中采用的白大蒜為市售200克；hepg2細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞資源中心；mtt購自sigma；順鉑購自豪森藥業(yè)有限公司；培養(yǎng)基(mem)和胎牛血清均購自gibco；非必需氨基酸溶液100×，胰蛋白酶-edta溶液1×(胰蛋白酶)購自gibco；碘化丙啶(pi)試劑盒、annexinv-fitc和hoechst33342染色試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純級別。

實施例1大蒜多糖的提取、分離與純化

大蒜去皮磨碎。磨碎后的大蒜勻漿加4倍體積水80℃浸提3小時，然后用200目紗布過濾。濾渣再經(jīng)4倍體積的水在80℃提取2小時，之后再次過濾取上清，合并上清液。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮液冷卻后加入3倍體積的95％(v/v)的預(yù)冷乙醇進(jìn)行沉淀，將沉淀物用95％(v/v)的乙醇洗滌三次并凍干。利用sevage法去除多糖中的蛋白質(zhì)，之后再次干燥，獲得粗多糖。

取5g粗多糖，重新溶解在100ml蒸餾水中，并利用q-sepharosefastflow層析柱(20mmid×350mm，法瑪西亞公司)，用蒸餾水和0.1-0.5m濃度梯度的nacl在1ml/min的流速下進(jìn)行洗脫。采用苯酚-硫酸法檢測洗脫糖含量高的餾分(峰值1)并收集、透析、凍干，得大蒜多糖純品。利用sephadexg-50(26mmid×1000mm)凝膠滲透色譜，用0.1m的nacl在0.5ml/min的流速下對上一步驟中獲得的大蒜多糖進(jìn)行純度驗證，獲得洗脫峰為單一對稱峰，說明上一步驟制備的大蒜多糖為純品。

在本實驗中，白蒜分離大蒜粗多糖得率26.06克，收率為13.08％。粗多糖經(jīng)q-sepharosefastflow層析純化。主要組分通過凝膠過濾層析純度驗證，洗脫曲線如圖1所示。

實施例2大蒜多糖重均分子量

采用高效凝膠滲透色譜法(hpgpc)，并利用液相色譜儀器(安捷倫，美國)測定大蒜多糖的重均分子量。其中，plaquagel-oh30柱(7.5mmid×300mm，8μm)維持在25℃，流動相為0.02m的硝酸鈉(nano3)和0.01m的磷酸二氫鈉(naoh，ph7.0)，流量為0.6ml/min，并通過rid-10a檢測器檢測。將2mg樣品溶解在流動相中，過0.45μm濾膜。大蒜多糖的重均分子量以dextrant-系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(t-10、t-40、t-70、t-500和t-2000)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為參考進(jìn)行評估。

通過在sephadexg-50中觀察到單一對稱峰，說明大蒜多糖是均一多糖，如圖2所示。利用高效凝膠色譜法檢測大蒜多糖的重均分子量，根據(jù)校準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖，得到大蒜多糖的重均分子量約為2714.94da。

實施例3大蒜多糖單糖組成分析

大蒜多糖中單糖的鑒定與定量采用pmp柱前衍生法和高性能液相色譜分析。大蒜多糖用2mtfa在100℃下水解2小時，并轉(zhuǎn)化為所述的糖醇乙酸酯。由此產(chǎn)生的糖醇乙酸酯通過紫外檢測器(245nm)和色譜毛細(xì)管柱(4.6mm內(nèi)徑×250mm，5μm)，利用agilent1280高效液相色譜分析儀進(jìn)行分析。其中，色譜毛細(xì)管柱的溫度保持在25℃，樣品折射量為10μl。流動相為經(jīng)磷酸二氫鉀：乙腈(83:17，v/v)稀釋的0.05m的kh2po4-naoh緩沖液，流速為1ml/min。以甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

氣相色譜分析表明，大蒜多糖是由相對摩爾質(zhì)量比為4.6：0.8：0.9：0.5的葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、木糖(xyl)和阿拉伯糖(ara)組成。

實施例4細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系hepg2細(xì)胞利用mem培養(yǎng)基(含10％的胎牛血清、100u/ml的青霉素和100u/ml的鏈霉素)，在37℃，5％co2/95％空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

實施例5抗增殖活性

采用mtt法檢測大蒜多糖對hepg2細(xì)胞生長抑制作用。將hepg2細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％時，分別加入100μg/ml、250μg/ml和500μg/ml的大蒜多糖，5μg/ml的順鉑以及大蒜多糖與順鉑聯(lián)合用藥，用藥方案為大蒜多糖100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml分別與5μg/ml順鉑共同作用于人肝癌細(xì)胞系hepg2，在37℃條件下分別孵育24小時和48小時。孵育完成后，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，37℃孵育4小時。之后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液并每孔加入150μldmso。紫色結(jié)晶溶解充分后，設(shè)定波長為490nm的酶標(biāo)儀(perkinelmer，美國)檢測。

本實驗中，如圖3所示，大蒜多糖可在一定濃度范圍內(nèi)抑制人肝癌細(xì)胞系hepg2的增殖，并呈劑量依賴性。系列濃度大蒜多糖作用腫瘤細(xì)胞24小時，當(dāng)大蒜多糖濃度為100μg/ml時，抑制率為7.85％；當(dāng)大蒜多糖濃度為250μg/ml時，抑制率為13.37％；當(dāng)大蒜多糖濃度為500μg/ml時，抑制率為19.52％；作用48小時，當(dāng)大蒜多糖濃度為100μg/ml時，抑制率為14.47％；當(dāng)大蒜多糖濃度為250μg/ml時，抑制率為22.38％；當(dāng)大蒜多糖濃度為500μg/ml時，抑制率為26.18％。5μg/ml順鉑作用腫瘤細(xì)胞24小時抑制率為13.68％，48小時抑制率為52.93％。對于大蒜多糖與順鉑聯(lián)合用藥，對腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于單獨用藥。100μg/ml大蒜多糖+5μg/ml順鉑作用24小時，其增殖抑制率為52.04％；500μg/ml大蒜多糖+5μg/ml順鉑作用24小時，增殖抑制率高達(dá)64.47％。聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞的抑制率均遠(yuǎn)高于順鉑單藥作用48小時42.93％的抑制率。可見大蒜多糖可幫助增加順鉑的抗腫瘤活性，并可通過減少用藥時間間接降低化療藥物使用量，減少其毒副作用。

實施例6大蒜多糖和順鉑誘導(dǎo)后的hepg2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)分析

將hepg2細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％時，分別加入1.0mg/ml的大蒜多糖以及大蒜多糖與順鉑的聯(lián)合用藥，用藥方案為1mg/ml大蒜多糖與0.5μg/ml順鉑共同作用，在37℃條件下孵育48小時。并設(shè)只加mem培養(yǎng)基的hepg2細(xì)胞為空白對照組。之后，收集細(xì)胞并通過hoechst33342在37℃條件下孵育15分鐘。熒光顯微鏡(尼康ts100，日本)下觀察細(xì)胞并拍照(400×)。

凋亡細(xì)胞的染色體dna結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使染料與dna結(jié)合更為高效，增強(qiáng)了凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光。在本實驗中，如圖4a所示，空白對照組可見均勻藍(lán)色橢圓形細(xì)胞核，未見明顯凋亡。然而，通過結(jié)合hoechst33342，1mg/ml大蒜多糖的實驗組可見較重藍(lán)色熒光，如圖4b所示；1mg/ml大蒜多糖聯(lián)合0.5μg/ml順鉑的實驗組與1mg/ml大蒜多糖的實驗組相比，顯示出更重的藍(lán)色熒光，如圖4c所示。hoechst33342染色結(jié)果顯示，是由大蒜多糖誘導(dǎo)凋亡途徑實現(xiàn)誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞的凋亡。順鉑是一種烷化劑抗腫瘤藥物，通過使dna不完整產(chǎn)生細(xì)胞毒性，作為一種非特異性的細(xì)胞周期藥物，主要干擾dna的復(fù)制。通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，其抗腫瘤作用也得到了證實，并且，通過實施例1提供的大蒜多糖可以協(xié)同順鉑誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞凋亡。

實施例7細(xì)胞周期分布測定

將hepg2接種于6孔板，接種密度為1×10⁵個/孔，利用mem培養(yǎng)基，在37℃，5％co2/95％空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度達(dá)到80％。之后，分別加入0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的大蒜多糖，0.5μg/ml的順鉑以及大蒜多糖與順鉑的聯(lián)合用藥，用藥方案為大蒜多糖0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml分別與0.5μg/ml順鉑共同作用于人肝癌細(xì)胞系hepg2，其中，單獨應(yīng)用0.5μg/ml順鉑的為陽性對照組，并設(shè)只加mem培養(yǎng)基的hepg2細(xì)胞為空白對照組，在37℃條件下孵育48小時。胰蛋白酶消化后離心法收集細(xì)胞，pbs清洗兩次后，用70％的酒精進(jìn)行固定，并于4℃儲存過夜。固定后的細(xì)胞經(jīng)pbs清洗后加入含有0.05％核糖核酸酶的pi溶液，37℃孵育30分鐘。之后，于室溫在黑暗條件下加入5μl濃度為5mg/ml的pi溶液。30分鐘后，細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特公司，美國)進(jìn)行分析。每組設(shè)置三個重復(fù)。流式細(xì)胞術(shù)測定dna含量。通過與空白對照組細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行比較，對用藥實驗組的細(xì)胞周期進(jìn)行評價。

用pi染色評價大蒜多糖和順鉑單獨或聯(lián)合作用48小時后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。結(jié)果如表1所示。

表1大蒜多糖和順鉑對hepg2細(xì)胞周期的影響

每種藥物單獨作用48小時均減少g1期細(xì)胞數(shù)，如圖5b，5c，5e和5g所示，大蒜多糖處理能夠增加g2或m期細(xì)胞比例，順鉑能夠顯著增加細(xì)胞周期中s期的細(xì)胞比例。而聯(lián)合用藥組s期和g2期細(xì)胞比例增加，如圖5d，5f和5h所示?？瞻讓φ战M如圖5a所示。因此，說明聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長是通過延長并阻止細(xì)胞在s和g2期的增殖來實現(xiàn)的。

實施例8凋亡檢測

確定藥物對細(xì)胞凋亡的影響，利用annexinv-fitc試劑盒及pi染色檢測細(xì)胞凋亡。annexinv-fitc及pi染色劑能夠進(jìn)入細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，并通過檢測細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸，檢測凋亡或壞死的細(xì)胞。將hepg2接種于6孔板，接種密度為1×10⁵個/孔，利用mem培養(yǎng)基，在37℃，5％co2/95％空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％時，分別加入0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的大蒜多糖，0.5μg/ml的順鉑以及大蒜多糖與順鉑的聯(lián)合用藥，用藥方案為大蒜多糖0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml分別與0.5μg/ml順鉑共同作用于人肝癌細(xì)胞系hepg2，其中，單獨應(yīng)用0.5μg/ml順鉑的為陽性對照組，并設(shè)只加mem培養(yǎng)基的hepg2細(xì)胞為空白對照組，在37℃條件下孵育48小時。之后，細(xì)胞與5μlannexinv-fitc及5μlpi共孵育，并通過流式細(xì)胞儀(加利福尼亞，貝克曼庫爾特公司)進(jìn)行分析。每組設(shè)置三個重復(fù)。細(xì)胞凋亡率(％)＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞×100％。

根據(jù)染色，正常細(xì)胞為annexinv(-)/pi(-)；早期凋亡細(xì)胞為annexinv(+)/pi(-)；晚期凋亡細(xì)胞annexinv(+)/pi(+)，壞死細(xì)胞為annexinv(-)/pi(+)。流式細(xì)胞儀分析表明，每組藥物單獨處理48小時均可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞凋亡，如圖6b、6c、6d、6e和6f所示。聯(lián)合用藥也增加腫瘤細(xì)胞早期和晚期凋亡率，如圖6g、6h和6i所示?？瞻讓φ战M如圖6a所示。通過大蒜多糖聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(74.1％、76.7％和79.3％)均顯著高于單獨應(yīng)用0.5μg/ml順鉑(50.3％)或單獨應(yīng)用大蒜多糖(49％，56.8％，63.8％)的凋亡率，如圖7所示(p＜0.05)。其中，大蒜多糖聯(lián)合0.5μg/ml順鉑用藥對細(xì)胞凋亡率的影響均接近5μg/ml順鉑單獨的作用。提示大蒜多糖能夠降低化療藥物90％的用量，并達(dá)到相同的抗腫瘤效果。由于順鉑能夠干擾dna的復(fù)制，并且具有多種細(xì)胞毒性，能夠產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因此，與其他藥物聯(lián)合用藥是一種增加療效但不增加不良反應(yīng)的好方法。本實驗的結(jié)果證實，作為低毒的天然大分子果聚糖成分的大蒜多糖，能顯著增加順鉑對hepg2細(xì)胞的抗增殖能力，且呈時間和劑量依賴性。

由本發(fā)明提供的實施例1至8的實驗結(jié)果中可以看出，本發(fā)明提供的大蒜提取物大蒜多糖，能夠表現(xiàn)一定的抗腫瘤活性，將大蒜多糖聯(lián)合化療藥物順鉑共同作用于腫瘤細(xì)胞，能夠通過縮短作用時間，降低順鉑使用量，從而降低其毒副作用；并且，大蒜為食藥兩用植物，應(yīng)用大蒜作為輔助抗腫瘤的藥物，在能夠降低化療藥物毒副作用的同時，不產(chǎn)生其他不良反應(yīng)，用藥更安全。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。