本發(fā)明屬于中藥、天然藥物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種八仙花葉提取物及其藥物組合物、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

八仙花(hydrangeamacrophylla)又名繡球花、紫陽(yáng)花、粉團(tuán)花，為虎耳草科八仙花屬多年生草本植物。原產(chǎn)中國(guó)大陸長(zhǎng)江中下游以南和日本本州等地，在我國(guó)的栽培歷史悠久，分布于我國(guó)南北各地?！吨兴幋笤~典》記載：“苦微辛，寒，有小毒?！逼鋸?fù)方治瘧疾和治腎囊風(fēng)。近年來(lái)，日本學(xué)者對(duì)其多有研究，其有效成分具有抗?jié)?、抗過(guò)敏等生物活性。甲狀腺癌的背景介紹甲狀腺癌是臨床上較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，近10年來(lái)發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì)(1)。最新數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌發(fā)病率每年增加5％左右(2)。盡管有學(xué)者認(rèn)為近年來(lái)的發(fā)病率增加是由于甲狀腺球蛋白和抗甲狀腺球蛋白抗體等生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、臨床診斷技術(shù)的進(jìn)步提高了甲狀腺癌確診率，而非真性發(fā)病率的升高，但甲狀腺癌的死亡率每年增長(zhǎng)了0.9％。甲狀腺癌主要有4種病理分型：甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroidcarcinoma，ptc)、甲狀腺濾泡狀癌(follicularthyroidcarcinoma，ftc)、髓樣癌(medullathyroidcarcinoma，mtc)和未分化癌(anaplasticthyroidcarcinoma，atc)。ptc與ftc為分化型甲狀腺癌(differentiatedthyroidcarcinoma，dtc)，占甲狀腺癌的90-95％。大部分患者通過(guò)傳統(tǒng)方法治療都能獲得良好的療效。因此，dtc患者的20年生存率達(dá)到90％。但仍有少部分的dtc患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并對(duì)放射性碘不吸收，這些患者因缺少有效的治療方法10年生存率只有15-20％(3)。

隨著近年來(lái)甲狀腺癌分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展，許多有效的藥物分子作用靶標(biāo)相繼被發(fā)現(xiàn)，并且基于這些靶點(diǎn)研發(fā)出許多有效的靶向治療藥物，其中靶向藥物索拉非尼(sorafenib)和樂(lè)伐替尼(lenvatinib)已成功上市。靶向治療為難治性甲狀腺癌提供了新的治療手段，顯著改善了晚期甲狀腺癌患者的預(yù)后生存期，呈現(xiàn)良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。雖然分子靶向藥物已取得了巨大的成就，但由于有些藥物毒副作用較大且較嚴(yán)重，有些患者不得不減少使用劑量，甚至停止用藥，從而不能達(dá)到其應(yīng)有的治療效果。因此，開(kāi)發(fā)出高效、低毒的全新治療藥物仍是甲狀腺癌治療的重點(diǎn)。

目前未見(jiàn)八仙花(hydrangeamacrophylla)葉或其總酚酸提取物具有抗甲狀腺癌的報(bào)道，而八仙花總酚酸提取物的生產(chǎn)工藝在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道也屬空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種八仙花葉提取物及其制備方法和應(yīng)用。尤其是八仙花葉的總酚酸提取物在制備治療甲狀腺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明八仙花葉提取物是采用以下方法制備，步驟如下：

(1)取八仙花葉的干燥藥材，粉碎，加乙醇水溶液浸泡，加熱提?。?/p>

(2)過(guò)濾，得濾液，濃縮，濃縮液備用；

(3)將步驟(2)所得的濃縮液，用石油醚或正己烷萃取，然后再用正丁醇萃取，取正丁醇層萃取液減壓濃縮得浸膏，加水溶解浸膏，抽濾，濾液備用；

(4)將步驟(3)所得濾液，大孔樹(shù)脂柱吸附，依次用蒸餾水、10％v/v-20％v/v的乙醇水溶液，20％v/v-30％v/v的乙醇洗脫，30％v/v-40％v/v的乙醇洗脫，收集30％v/v-40％v/v的乙醇洗脫液，濃縮干燥，粉碎，過(guò)篩，得八仙花葉提取物。

本發(fā)明八仙花葉提取物以槲皮素為定量指標(biāo)，其中總酚酸含量超過(guò)40％，即本發(fā)明八仙花葉提取物為八仙花葉的總酚酸提取物。

上述技術(shù)方案中，步驟(1)中所述的乙醇水溶液的濃度為60-90％，料液比按重量比計(jì)為1:5-20，浸泡時(shí)間為12-24小時(shí)，加熱回流提取2-3次，每次2-3小時(shí)。

上述技術(shù)方案中，步驟(2)濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.20。

上述技術(shù)方案中，步驟(3)中濃縮液用石油醚或正己烷、正丁醇各萃取2-3次，每次萃取采用的有機(jī)溶劑用量按濃縮液:有機(jī)溶劑的重量比為0.5-1:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加水溶解，按浸膏:蒸餾水的重量比為1:10-35的比例加入蒸餾水溶解浸膏。

優(yōu)選的，步驟(3)中濃縮液用石油醚、正丁醇各萃取2-3次，每次萃取采用的有機(jī)溶劑用量按濃縮液:有機(jī)溶劑的重量比為0.5:1的比例萃取，正丁醇萃取物浸膏加水溶解，按浸膏:蒸餾水的重量比為1:10-35的比例加入蒸餾水溶解浸膏。

上述技術(shù)方案中，步驟(4)所述的大孔樹(shù)脂柱為ab-8、hpd300、hpd400或d101型的大孔吸附樹(shù)脂。

上述技術(shù)方案中，步驟(4)中蒸餾水洗脫3-6個(gè)柱體積，10％v/v-20％v/v的乙醇水溶液洗脫3-6個(gè)柱體積，30％v/v-40％v/v的乙醇洗脫3-10個(gè)柱體積。

上述技術(shù)方案中，步驟(4)中上樣量，按藥材:樹(shù)脂的重量比為1:1-2上大孔樹(shù)脂柱。

上述技術(shù)方案中，步驟(4)所述洗脫的洗脫速度均為0.1-0.5l/h。

通過(guò)以上技術(shù)方案制備所得的八仙花葉總酚酸提取物的成分分析：經(jīng)過(guò)tlc和hplc分析，結(jié)合esi-ms、¹hnmr和¹³cnmr波譜數(shù)據(jù)解析驗(yàn)證，確定其中含有槲皮素，且hplc分析結(jié)果表明，提取物中的化合物多為槲皮素類(lèi)似物(具有類(lèi)似的紫外吸收)。故以槲皮素為對(duì)照品，采用紫外分光度法測(cè)定總酚酸的含量。結(jié)果顯示，八仙花葉總酚酸提取物中總酚酸的含量超過(guò)40％。

進(jìn)一步的，對(duì)本發(fā)明提取物進(jìn)行了體內(nèi)外抗甲狀腺癌藥理作用的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的八仙花葉總酚酸提取物，在人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株皮下瘤移植模型中，對(duì)甲狀腺髓樣癌腫瘤具有用量依賴(lài)性的抗腫瘤效果。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)表明，八仙花葉總酚酸提取物能夠抑制人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株的增殖，并且抑制作用存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，具有治療甲狀腺癌的作用。故本發(fā)明提供的八仙花葉總酚酸提取物的用途為八仙花葉總酚酸提取物在制備治療甲狀腺癌藥物中的應(yīng)用。

為了利用上述應(yīng)用，本發(fā)明還提供了以八仙花葉總酚酸提取物為主要活性成分，加入藥學(xué)上常規(guī)輔料制成的藥劑。如可以制成口服制劑或注射制劑。具體的，口服制劑可制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等；注射制劑可以為靜脈注射制劑。

本發(fā)明的有益效果如下：

1)首次提供了制備提取八仙花葉總酚酸提取物的制備方法。

2)本發(fā)明八仙花葉總酚酸提取物中總酚酸含量高達(dá)40％，質(zhì)量穩(wěn)定可控。

3)本發(fā)明八仙花葉總酚酸提取物通過(guò)體內(nèi)外抗甲狀腺癌藥理試驗(yàn)明確了其對(duì)于甲狀腺癌有明確的治療效果。

4)本發(fā)明的制備方法工藝經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為八仙花葉總酚酸提取物對(duì)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞tt細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖2表示八仙花葉總酚酸提取物對(duì)甲狀腺髓樣癌腫瘤的生長(zhǎng)的抑制作用。

圖3表示八仙花葉總酚酸提取物對(duì)小鼠體重的影響。

圖4表示八仙花葉總酚酸提取物對(duì)小鼠腫瘤瘤重生長(zhǎng)的影響。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，說(shuō)明但不限制本發(fā)明。以及以下實(shí)施例制備所得八仙花葉總酚酸提取物的總酚酸含量采用紫外光譜法測(cè)定。

實(shí)施例一八仙花葉總酚酸提取物的制備(一)

將2kg粉碎后的八仙花葉的干燥藥材，按照藥材:乙醇溶液重量比1:5的比例，加入60％乙醇浸泡12小時(shí)，然后加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間分別為2h、2h、2h。合并三次提取液，過(guò)濾，回收溶劑，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.20。濃縮液分別用石油醚、正丁醇各萃取三次，按濃縮液:溶劑重量比1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，濃縮，得正丁醇萃取物浸膏67.8g。正丁醇萃取物加蒸餾水1.5l溶解，過(guò)濾，將濾液吸附于2kg的ab-8型大孔樹(shù)脂柱，反復(fù)吸附三次。首先用3倍柱體積的蒸餾水、3倍柱體積的10％乙醇溶液洗脫出去雜質(zhì)；再用5倍柱體積的30％的乙醇溶液洗脫。收集30％乙醇的洗脫液，濃縮，得本發(fā)明的八仙花葉總酚酸提取物2.2g。八仙花葉總酚酸提取物總酚酸含量為45％。

實(shí)施例二八仙花葉總酚酸提取物的制備(二)

將2kg粉碎后的八仙花葉的干燥藥材，按照藥材:乙醇溶液重量比為1:10的比例，加入70％乙醇浸泡12小時(shí)，然后加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間分別為2h、2h、2h。合并三次提取液，過(guò)濾，回收溶劑，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.20。濃縮液分別用石油醚、正丁醇各萃取三次，按濃縮液:溶劑重量比為1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，濃縮，得正丁醇萃取物浸膏85.3g。正丁醇萃取物加蒸餾水2.8l溶解，過(guò)濾，將濾液吸附于4kg的hpd300型大孔樹(shù)脂柱，反復(fù)吸附三次。首次用4倍柱體積的蒸餾水、5倍柱體積的20％乙醇溶液洗脫出去雜質(zhì)；再用10倍柱體積的40％的乙醇溶液洗脫。收集40％乙醇的洗脫液，濃縮，得本發(fā)明的八仙花葉總酚酸提取物5.5g。八仙花葉總酚酸提取物總酚酸含量為42％。

實(shí)施例三八仙花葉總酚酸提取物的制備(三)

將2kg粉碎后的八仙花葉的干燥藥材，按照藥材:乙醇溶液重量比為1:20的比例，加入90％乙醇浸泡24小時(shí)，然后加熱回流提取3次，每次提取時(shí)間分別為3h、3h、3h。合并三次提取液，過(guò)濾，回收溶劑，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.20。濃縮液分別用石油醚、正丁醇各萃取三次，按濃縮液:溶劑重量比為1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，濃縮，得正丁醇萃取物浸膏167g。正丁醇萃取物加蒸餾水2.0l溶解，過(guò)濾，將濾液吸附于3kg的d101型大孔樹(shù)脂柱，反復(fù)吸附三次。首次用6倍柱體積的蒸餾水、6倍柱體積的20％乙醇溶液洗脫出去雜質(zhì)；再用10倍柱體積的40％的乙醇溶液洗脫。收集40％乙醇的洗脫液，濃縮，得本發(fā)明的八仙花葉總酚酸提取物10.6g。八仙花葉總酚酸提取物總酚酸含量為55％。

實(shí)施例四八仙花葉總酚酸提取物的制備(四)

將2kg粉碎后的八仙花葉的干燥藥材，按照藥材:乙醇溶液重量比1:8的比例，加入70％乙醇浸泡12小時(shí)，然后加熱回流提取2次，每次提取時(shí)間分別為3h、2h、2h。合并三次提取液，過(guò)濾，回收溶劑，濃縮至相對(duì)密度為1.00-1.20。濃縮液分別用石油醚、正丁醇各萃取三次，按濃縮液:溶劑重量比為1:1的比例萃取。合并三次正丁醇萃取液，濃縮，得正丁醇萃取物浸膏68.9g。正丁醇萃取物加蒸餾水3.5l溶解，過(guò)濾，將濾液吸附于4kg的hpd400型大孔樹(shù)脂柱，反復(fù)吸附三次。首次用3倍柱體積的蒸餾水、4倍柱體積的10％乙醇溶液洗脫出去雜質(zhì)；再用40倍柱體積的30％的乙醇溶液洗脫。收集30％乙醇的洗脫液，濃縮至干，得本發(fā)明的八仙花葉總酚酸提取物2.3g。八仙花葉總酚酸提取物總酚酸含量為40％。

實(shí)施例五八仙花葉總酚酸提取物對(duì)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞的體外增殖的抑制作用

將1×10⁴個(gè)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，在孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，然后分別經(jīng)過(guò)空白(0.1％dmso)和不同濃度的八仙花總酚酸提取物處理24，48和72小時(shí)。在處理完成后，每個(gè)培養(yǎng)孔加入20μl5mg/ml的mtt，并在37℃孵育4個(gè)小時(shí)。然后除去每孔的上清溶液，并加入150μl的dmso溶解沉淀。用多功能檢測(cè)器(moleculardevices，usa)測(cè)定每孔的od值(570nm)。我們將空白對(duì)照孔的細(xì)胞假設(shè)為100％的生長(zhǎng)，而與空白對(duì)照相比較就可以計(jì)算出八仙花葉總酚酸提取物處理孔的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。八仙花總酚酸提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率用以下公式計(jì)算：

細(xì)胞增殖抑制率(％)＝(od空白對(duì)照孔-od八仙花總酚酸提取物處理孔)/od空白對(duì)照孔×100％

結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可見(jiàn)：八仙花葉總酚酸提取物能夠抑制人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株的增殖，并且抑制作用存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性，48小時(shí)八仙花葉總酚酸提取物對(duì)甲狀腺髓樣癌細(xì)胞增殖抑制的ic50為4.14mg/ml。

實(shí)施例六體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究八仙花葉總酚酸提取物對(duì)小鼠甲狀腺髓樣癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制情況

將100μl細(xì)胞接種于6周齡，雌性balb/c裸鼠的右前邊的腋下空白處。待腫瘤長(zhǎng)至100mm³左右時(shí)，將30只裸鼠隨機(jī)分為5個(gè)組，分別為空白對(duì)照組，陽(yáng)性(多柔比星)對(duì)照組和八仙花葉總酚酸提取物高中低(2000，1000和500mg/kg)劑量組。八仙花葉總酚酸提取物處理組(500，200和100mg/kg)每天灌胃一次200μl含有用2.5％tween-80和2.5％乙醇溶解的不同濃度的八仙花葉總酚酸提取物的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥18天的治療?？瞻讓?duì)照組給予同等體積的生理鹽水，而陽(yáng)性對(duì)照組每四天尾靜脈注射一次劑量為5mg/kg的多柔比星。腫瘤體積每?jī)商鞙y(cè)量一次，計(jì)算公式為：v(mm³)＝π/6×長(zhǎng)×寬×寬。

圖2-圖4均為八仙花葉總酚酸提取物抑制甲狀腺髓樣癌腫瘤生長(zhǎng)的影響，其中圖2-圖4分別表現(xiàn)了八仙花葉總酚酸提取物對(duì)甲狀腺髓樣癌腫瘤的生長(zhǎng)的抑制作用、對(duì)小鼠體重的影響、以及對(duì)小鼠腫瘤瘤重生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：在人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株皮下瘤移植模型中，八仙花葉總酚酸提取物對(duì)甲狀腺髓樣癌腫瘤具有用量依賴(lài)性的抗腫瘤效果。100mg/kg，200mg/kg和500mg/kg的八仙花葉總酚酸提取物對(duì)甲狀腺髓樣癌腫瘤的抑瘤率分別為64.14％，72.47％和74.58％。