本發(fā)明涉及一種提取物的制備方法，具體涉及一種云南特色植物絨苞藤提取物的制備方法，還涉及該方法獲得的提取物及其在制備選擇性抗腫瘤、抗衰老治療藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的致死性疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明，治療效果亦不盡人意。目前常規(guī)用于腫瘤治療的大部分藥物，均是針對細胞增殖過程中dna復(fù)制或細胞骨架的調(diào)控來設(shè)計的。這些藥物在對快速增殖的腫瘤細胞進行殺傷的同時，對人體功能維持所需的正常增殖細胞（如骨髓干細胞等等）也有很大的毒性，導(dǎo)致接受治療的病人機體正常功能嚴重受損，對于腫瘤的抵抗能力反而下降，難以取到很好的治療效果。因此，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高效、安全的靶向個性化治療藥物，也成為國內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究者的重要方向。

衰老是機體各種生化反應(yīng)綜合作用的體現(xiàn)，是體內(nèi)外諸多因素之間互相作用的結(jié)果，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，衰老的本質(zhì)是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增大，自身機能減退，機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、功能逐步退行性改變的不可逆過程。衰老是人類必然經(jīng)歷的過程，而延緩衰老幾乎是每個人的愿望。古今中外，人們一直在尋找各種延年益壽的方法和抗衰老藥物以期能在遺傳學(xué)上所界定的壽限內(nèi)延遲衰老或提高生命質(zhì)量。最近研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物（如白藜蘆醇、黃芪多糖、葉黃素等）具有抗衰老作用，植物中含有多種天然活性物質(zhì)，它們具有抗癌、抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老等諸多生理活性。隨著人們健康意識的提高，研發(fā)安全、有效的延緩衰老、防病保健的天然產(chǎn)物有著廣闊的市場，也為抗衰老藥物或保健品的研究提供廣闊的前景。

云南省是世界生物多樣性的熱點地區(qū)之一，各種生物種類占全國的50%以上，為天然藥物的研究和開發(fā)提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時云南26個民族在與疾病的長期斗爭中積累了豐富的民族民間用藥經(jīng)驗，為云南天然藥物研究提供了寶貴的傳統(tǒng)知識、藥物背景信息和資料，也為我們開發(fā)和研究抗腫瘤和抗衰老的天然藥用植物提供了豐富的來源。

高速逆流色譜（high-speedcountercurrentchromatography，hsccc）是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，該技術(shù)不需要固體支撐體，主要依據(jù)物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同對物質(zhì)進行分離，相對其他常用色譜（如柱色譜、高效液相色譜等）來說，具有無不可逆吸附和回收率高的特點，其分離效率高、制備量大、分離成本低，特別適合用于含量極低的天然活性成分的分離和純化。

絨苞藤（congeachinensis），產(chǎn)自云南屏邊和西雙版納，常生長在海拔700-1450米的溝谷林邊，主要作為觀賞植物。迄今為止，未見關(guān)于絨苞藤中活性組分同時有抗腫瘤活性和抗衰老活性的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了拓展云南特色植物研究的新領(lǐng)域，充分利用我國植物資源，開發(fā)其新用途，提供了一種絨苞藤提取物的制備方法；本發(fā)明應(yīng)用hsccc技術(shù)對絨苞藤中活性成分進行提取分離純化，制備高純度的活性組分，為絨苞藤的抗腫瘤和抗衰老藥物或保健品開發(fā)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本發(fā)明具體通過以下方案實現(xiàn)：

一種絨苞藤提取物的制備方法，其特征在于按如下步驟進行：

（1）粉碎和粗提

將絨苞藤曬干粉碎后，用石油醚脫脂處理，再用乙醇浸提，濃縮合并濾液，得乙醇浸提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，得到水層浸膏；

（2）分離和純化

將步驟（1）的水層浸膏經(jīng)過反相樹脂初步分離，以甲醇-水混合液進行梯度洗脫，其中，甲醇：水體積比依次為0:100、40:60、80:20、100:0，收集合并40:60和80:20甲醇洗脫部位，濃縮，得到絨苞藤粗提物，用水將粗提物溶解，經(jīng)高速逆流色譜進一步純化，高速逆流色譜制備溶劑體系為1%-5%乙酸濃度下的正丁醇-水或氯仿-甲醇-水，最終得到絨苞藤提取物。

進一步地，所述步驟（1）的乙醇提取為用1l體積濃度為95%乙醇超聲浸提取3次，每次1小時。

進一步地，所述步驟（2）中萃取為用乙酸乙酯和水的體積比為1:1的混合液萃取三次，將三次水層萃取液合并后濃縮。

進一步地，所述正丁醇-水的體積比為1:1，所述氯仿-甲醇-水的體積比為4:3:2。

所述高速逆流色譜純化得到絨苞藤提取物的具體參數(shù)如下：

進一步地，溶劑體系中上相為流動相，下相為固定相；

高速逆流色譜主機順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為750-900rpm；樣品量40.0-60.0mg，固定相保留值為：60％-73.0％，流動相的流速為0.8-1.2ml/min；檢測波長為254nm；分離溫度為17-23℃；

進樣后40-60min收集活性成分。

本發(fā)明涉及的上述絨苞藤提取物的制備方法制得的提取物。

本發(fā)明涉及的上述絨苞藤提取物在制備抗腫瘤和抗衰老藥物或保健品中的應(yīng)用。

進一步地，所述藥物的劑型為固體制劑或液體制劑。

本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤和抗衰老活性的提取物，該提取物可含有藥學(xué)上可接受的載體。所述的藥學(xué)上可接受的載體包括填充劑、濕潤劑、粘合劑、甜味劑、吸收促進劑等；

本發(fā)明提供的藥物劑型可以為固體制劑或液體制劑，主要包括片劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、滴丸劑、栓劑、氣霧劑等。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明提供的絨苞藤提取物同時具有抗腫瘤和抗衰老活性，且對正常細胞無毒性；

（2）本發(fā)明提供的絨苞藤提取物的抗腫瘤和抗衰老活性，其效果優(yōu)于目前大部分植物提取物（如靈芝、三七、黃精等）；

（3）使用高速逆流色譜（hsccc）純化，制備高純度提取物具有簡便、快速、高效等優(yōu)點；

本發(fā)明開拓了絨苞藤提取物活性組分新的用途，為抗腫瘤和抗衰老藥物或保健品的研發(fā)進行基礎(chǔ)性研究，具有重要的顯示意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的絨苞藤提取物對宮頸癌細胞（hela）的抑制作用；

圖2為本發(fā)明的絨苞藤提取物對人臍靜脈細胞（ea.hy926）的抑制作用；

圖3為本發(fā)明絨苞藤提取物活性組分對酵母復(fù)制壽命的影響效果圖；

圖4為不同植物提取物的抗衰老活性試驗結(jié)果。

具體實施方式

下面通過對該活性組分制備實例的實施方式和附圖再對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不局限于所述內(nèi)容，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例中方法如無特殊說明均采用常規(guī)方法，使用試劑如無特殊說明，均為常規(guī)市售試劑或采用常規(guī)方法配置的試劑。

實施例1絨苞藤提取物提取物活性組分的制備

絨苞藤樣品采自云南省思茅地區(qū)，植物種名由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所研究員鑒定，生藥標本存放于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所。

從植物絨苞藤中獲得具有抗腫瘤和抗衰老的活性組分提取物的制備方法，具體步驟為：

（1）粉碎和浸提

將100g絨苞藤曬干粉碎后，先用石油醚按絨苞藤粉末：石油醚質(zhì)量比為1:1進行脫脂處理，再用1l體積濃度為95%的乙醇超聲浸提取3次，每次1小時，濾液合并濃縮后，再用乙酸乙酯和水混合溶液（乙酸乙酯和水的體積比為1:1）萃取三次，將三次水層萃取液合并后濃縮，得到水層浸膏備用；

（2）分離和純化

將水層浸膏經(jīng)反相樹脂mcigel（chp20）柱分離，以下溶劑系統(tǒng)均按體積比，以甲醇：水體積比依次為0:100、40:60、80:20、100:0進行梯度洗脫，收集合并40:60和80:20（40%~80%）甲醇洗脫部位，得到粗提物r-a（0.76g）。將r-a組分用水溶解，經(jīng)制備型高速逆流色譜（hsccc）進一步純化，hsccc制備溶劑體系為2%乙酸濃度下氯仿-甲醇-水（4:3:2），高速逆流色譜主機順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為780rpm；樣品量45.0mg，固定相保留值為：63％，流動相的流速為0.8ml/min；檢測波長為254nm；分離溫度為18℃；進樣后45min收集活性成分，得到絨苞藤提取物r-b（39mg）。

經(jīng)上述方法制備得的絨苞藤提取物活性組分（r-b），呈淡黃色，無味，易溶于水。

實施例2絨苞藤提取物提取物活性組分的制備

絨苞藤樣品采自云南省云南省思茅地區(qū)，植物種名由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所研究員鑒定，生藥標本存放于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所。

從植物絨苞藤中獲得具有抗腫瘤和抗衰老的活性組分提取物的制備方法，具體步驟為：

（1）粉碎和浸提

將100g絨苞藤曬干粉碎后，先用石油醚按絨苞藤粉末：石油醚質(zhì)量比為1:1進行脫脂處理，再用1l體積濃度為95%乙醇超聲浸提取3次，每次1小時，濾液合并濃縮后，再用乙酸乙酯和水混合溶液（乙酸乙酯和水的體積比為1:1）萃取三次，將三次水層萃取液合并后濃縮，得到水層浸膏備用，所用石油醚的沸點為60-90℃；

（2）分離和純化

將水層浸膏經(jīng)反相樹脂mcigel（chp20）柱分離，以下溶劑系統(tǒng)均按體積比，甲醇：水體積比依次為0:100、40:60、80:20、100:0進行梯度洗脫，收集合并40:60和80:20（40%~80%）甲醇洗脫部位，得到粗提物r-a（0.77g）。將r-a組分用水溶解，經(jīng)制備型高速逆流色譜（hsccc）進一步純化，hsccc制備溶劑體系為5%乙酸濃度下的正丁醇-水（1:1），高速逆流色譜主機順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為850rpm；樣品量52.0mg，固定相保留值為：68％，流動相的流速為1.0ml/min；檢測波長為254nm；分離溫度為20℃；進樣后50min收集活性成分。得到絨苞藤提取物r-b（32mg）。

經(jīng)上述方法制備得的絨苞藤提取物活性組分（r-b），呈淡黃色，無味，易溶于水。

實施例3絨苞藤提取物提取物活性組分的制備

絨苞藤樣品采自云南省思茅地區(qū)，植物種名由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所研究員鑒定，生藥標本存放于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所。

從植物絨苞藤中獲得具有抗腫瘤和抗衰老的活性組分提取物的制備方法，具體步驟為：

（1）粉碎和浸提

將100g絨苞藤曬干粉碎后，先用石油醚按絨苞藤粉末：石油醚質(zhì)量比為1:1進行脫脂處理，再用1l體積濃度為95%的乙醇超聲浸提取3次，每次1小時，濾液合并濃縮后，再用乙酸乙酯和水混合溶液（乙酸乙酯和水的體積比為1:1）萃取三次，將三次水層萃取液合并后濃縮，得到水層浸膏備用；

（2）分離和純化

將水層浸膏經(jīng)反相樹脂mcigel（chp20）柱分離，以下溶劑系統(tǒng)均按體積比，以甲醇：水體積比依次為0:100、40:60、80:20、100:0進行梯度洗脫，收集合并40:60和80:20（40%~80%）甲醇洗脫部位，得到粗提物r-a（0.8g）。將r-a組分用水溶解，經(jīng)制備型高速逆流色譜（hsccc）進一步純化，hsccc制備溶劑體系為5%乙酸濃度下氯仿-甲醇-水（4:3:2），高速逆流色譜主機順時針轉(zhuǎn)動，轉(zhuǎn)速為900rpm；樣品量58.0mg，固定相保留值為：72％，流動相的流速為1.2ml/min；檢測波長為254nm；分離溫度為23℃；進樣后60min收集活性成分，得到絨苞藤提取物r-b（38mg）。

經(jīng)上述方法制備得的絨苞藤提取物活性組分（r-b），呈淡黃色，無味，易溶于水。

實施例4絨苞藤提取物的抗腫瘤活性

采用mtt試驗測定絨苞藤提取物活性組分的抗腫瘤活性。將不同濃度的絨苞藤提取物、人參提取物、靈芝提取物和黃精提取物與宮頸癌細胞（hela，20g/ml）和人臍靜脈細胞（ea.hy926，20g/ml）細胞共培養(yǎng)48h，測定其細胞存活率，以半抑制濃度ic50值表示，絨苞藤提取物的抑制作用結(jié)果見圖1-2和表1。結(jié)果顯示，絨苞藤提取物對宮頸癌細胞（hela）增殖均有明顯抑制作用，而對（ea.hy926）無明顯抑制作用；說明該提取物對腫瘤細胞具有明顯殺傷作用，同時對正常細胞（人臍靜脈細胞）無明顯毒性，其抗腫瘤作用具有可選擇性。

表1植物提取物對腫瘤細胞與正常細胞體外生長的抑制活性

實施例5絨苞藤提取物活性組分對酵母復(fù)制壽命的影響

酵母(saccharomycescerevisiae)作為人類衰老(壽命)研究最簡單的真核模式生物，為人體衰老機制的研究與認識提供了重要線索。最近有研究發(fā)現(xiàn)，酵母的衰老代謝機制與人體細胞衰老的機制相似，所以近年來選擇酵母模型研究衰老作用也是熱點之一。本實施例選擇釀酒酵母作為抗衰老研究的活性系統(tǒng)，以公認的具有抗衰老活性的天然化合物白藜蘆醇作為陽性對照，陰性對照為無水乙醇。

具體試驗方法包括以下步驟：

（1）將pbs處理后的酵母菌株加入5ml液體培養(yǎng)基（1%酵母粉，2%蛋白凍，3%半乳糖）中，28℃振搖培養(yǎng)24小時；

（2）培養(yǎng)結(jié)束后除去培養(yǎng)基，血球計數(shù)板計數(shù)，計算酵母濃度；

（3）用無水乙醇配置不同濃度的絨苞藤提取物、人參提取物、靈芝提取物和黃精提取物和對照品溶液；

（4）制備含1%酵母粉，2%蛋白凍，2%葡萄糖，2%瓊脂粉的固體培養(yǎng)基（5ml），然后加入配置好的樣品，待溶劑揮發(fā)后加入酵母細胞約4000個，涂布均勻，28℃培養(yǎng)48小時；

（5）顯微鏡下隨機觀察40個母細胞及其子細胞個數(shù)，本發(fā)明絨苞藤提取物活性組分對酵母復(fù)制壽命的影響見圖3；

（6）記錄進行數(shù)據(jù)分析，以子細胞代數(shù)（即個數(shù)）為橫坐標，存在等量子細胞代數(shù)的母細胞比率為縱坐標，作圖可知各待測樣品的抗衰老活性，見圖4。

如圖3-4所示，絨苞藤提取物可顯著延長酵母的復(fù)制性壽命，其效果優(yōu)于人參、靈芝、黃精等，具有顯著抗衰老活性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。