本發(fā)明涉及護膚品技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種酪氨酸酶抑制組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，人們越來越注重外部形象。以美好的形象在各自活動和場合增加自信，同時在美好的外表下，追求皮膚的健康，以健康的皮膚和美好的形象展現(xiàn)人們對高端生活的追求。

東方女性歷來推崇“膚如雪，凝如脂”的肌膚至高境界。人們已經(jīng)不再滿足于以粉等來掩飾面部瑕疵，而是更加追求自然的美白效果更加關(guān)注健康的美白方式。

黑色素的形成過程，存在于黑色素細胞組織中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下逐步轉(zhuǎn)化為純黑色素和褐黑素，進而黑色素細胞組織將黑色素轉(zhuǎn)移至表皮基底層細胞中，隨著細胞的新陳代謝而被帶到角質(zhì)層中，隨著角質(zhì)化細胞脫落。但當黑色過速增長或分布不均時，就會造成局部皮膚過黑及色素沉著。

世界上第一款美白產(chǎn)品于1897年正式問世于日本資生堂，其發(fā)展經(jīng)歷以下階段：

第一階段：“增白”階段。主要以表面遮蓋，物理性增白成分為主，簡單強調(diào)產(chǎn)品令肌膚更加白的表觀特性，如早期的增白粉蜜等。但其給皮膚帶來諸多弊端，不僅對肌膚無實質(zhì)性增白，促白作用，還會因長期使用造成毛孔或皮脂腺堵塞，影響排汗和新陳代謝，導致皮膚疾病(如局部炎癥、痤瘡等)的發(fā)生，其“增白”只是一種遮蓋性暫時的增白。

第二階段：“漂白”階段。常通過天然礦物等物理磨剝成分或果酸等化學成分，磨剝或刺激表皮角質(zhì)層細胞使其快速脫落，從而達到換膚漂白的目的，如磨砂膏或煥膚霜等。長期使用可至肌膚免疫力下降，是一種典型的治標不治本的美白方式。

第三階段：“協(xié)同”美白階段。通過添加多種美白成分，多方位干擾黑色的形成或加速其分解代謝，相對前者而言，第三代無論在原料選擇和美白機理認知和應(yīng)用方面都有了質(zhì)的飛躍，能解決皮膚美白的基本問題，但它依然停留在外部干擾阻擾美白階段。

因此，美白類化妝品是人們所追求的，在市場上具有很高的占有率。美白類化妝品從物理性遮蓋美白到物理性和化學性剝離，再到干擾黑色素正常的新陳代謝，發(fā)展到“協(xié)同效應(yīng)”美白。美白產(chǎn)品從問世以來一直發(fā)展，但不恰當?shù)拿腊淄緩剑o消費者帶來了不同程度的皮膚傷害，使得皮膚衰老加快，甚至破壞了皮膚原有的防御功能，讓皮膚更加敏感，更容易受到傷害。

傳統(tǒng)的皮膚美白劑，往往采用化學性物質(zhì)，如過氧化氫，氯化氨基汞以和氫醌及衍生物。這些化合物能使黑色素組織迅速瓦解，達到快速美白之功效。但因其對皮膚腐蝕性，細胞毒性和過敏性等因素，具有極大的危險性，在許多國家的衛(wèi)生規(guī)范中，已被禁用。

因此需要開發(fā)健康的美白護膚產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的是提供一種酪氨酸酶抑制組合物。

具體的技術(shù)方案如下：

一種酪氨酸酶抑制組合物，包括β-熊果苷、鞣花酸、肌肽和抗壞血酸磷酸酯鈉。

在其中一些實施例中，所述的酪氨酸酶抑制組合物包括如下質(zhì)量份的組分：

在其中一些實施例中，所述的酪氨酸酶抑制組合物包括如下質(zhì)量份的組分：

在其中一些實施例中，所述的酪氨酸酶抑制組合物包括如下質(zhì)量份的組分：

本發(fā)明的另一目的是提供上述酪氨酸酶抑制組合物在化妝品中的應(yīng)用。

在其中一些實施例中，所述化妝品選自化妝水、乳液、膏霜、精華液或彩妝。

本發(fā)明的另一目的是提供一種化妝品，包括上述酪氨酸酶抑制組合物。

本發(fā)明的原理和優(yōu)點如下：

1皮膚黑色素生成機制

1.1影響皮膚呈色的因素

人類的皮膚顏色首先是由人種決定的，還與遺傳基因有關(guān)，同一種族的人，由于基因的個體差異，其皮膚的顏色也存在著一定的差別。同樣是中國人，有的皮膚顏色較白，有的顏色較黑，兩者差別很大。一般來說，嬰兒皮膚的顏色是人的皮膚本色，具有基因的性質(zhì)，隨著年齡的增長，人體皮膚的顏色也會發(fā)生較大變化。這與皮膚老化以及外界環(huán)境的影響關(guān)系很大。皮膚老化和皮膚內(nèi)外環(huán)境的影響，是導致皮膚發(fā)暗，色素沉著，產(chǎn)生色斑等因素。

人體皮膚的顏色主要由黑色素細胞合成黑色素的數(shù)量，類型以及在角質(zhì)形成細胞周圍分布的模式來決定的。黑色素細胞是人類的一個小細胞，它主要的功能是合成黑色素并形成和分布色素沉著。

1.2黑色素的合成機理

在正常狀態(tài)下，人類皮膚的顏色取決于黑色素的含量和分布，而黑素細胞的結(jié)構(gòu)功能和數(shù)量直接影響皮膚黑素的含量，是產(chǎn)生黑素的決定因素。

在皮膚表皮基底層存在黑色素細胞，黑素細胞屬于腺細胞，具有呈樹狀突起，它起源于胚胎神經(jīng)嵴，隨胚胎發(fā)育移行至表皮基底層，并通過樹狀突起以1:36的比例與角質(zhì)形成細胞構(gòu)成一個表皮黑素單位。在表皮黑素單位中，黑素細胞與角質(zhì)形成細胞之間相互影響，尤其是角質(zhì)形成細胞可通過接觸幾分泌堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、內(nèi)皮素(et-1)、神經(jīng)細胞生長因子(ngf)、白介素1(1l-1)、白介素6(1l-6)、腫瘤壞死因子(tnf)等對黑素細胞的形態(tài)，結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生明顯影響。

黑素細胞樹狀突起實際為一管道，黑素細胞內(nèi)所產(chǎn)生的黑素由此樹枝狀管道運輸?shù)浇琴|(zhì)形成細胞內(nèi)，在角質(zhì)形成細胞溶酶體內(nèi)溶解，隨著表皮細胞脫落而排出。

皮膚中的黑素能將日光中的有害光線過濾，消除紫外線引起的自由基，防止彈力纖維變形所導致皮膚老化，能保護dna使其免受傷害因素引起的致突變效應(yīng)，從而降低皮膚癌的發(fā)病幾率。因此黑素對人體具有一定的生理保護功能，皮膚中約有400萬個黑素細胞，通過致突斑與基底膜相連。在電鏡下，黑素細胞核呈橢圓形，胞質(zhì)清亮，有形成黑素的膜性細胞器即黑素小體。

皮膚黑素合成的主要四步驟為：

(1)黑色素細胞受到紫外線，神經(jīng)因素，內(nèi)分泌、炎癥或激活黑色素細胞，啟動酪氨酸攝取與分布，酪氨酸酶合成；

(2)黑色素小體形成，黑色素在小體中合成，黑素體儲存黑素；

(3)黑色素通過細胞樹突將黑素顆粒轉(zhuǎn)運至角朊細胞；

(4)角朊細胞中的黑素顆粒隨表皮細胞移動，伴隨角質(zhì)細胞脫落而排出。

在黑素合成過程中，受到許多因素的影響，首先是酪氨酸酶的活性，此酶為含銅的氧化酶，其活性與其銅離子含量相關(guān)聯(lián)，體內(nèi)生化過程與物理環(huán)境的改變，可對酪氨酸酶產(chǎn)生影響。從酪氨酸向多巴轉(zhuǎn)化和多巴向多巴醌轉(zhuǎn)化中，都是由酪氨酸酶催化進行的。酪氨酸酶直接控制著黑素合成的起始和速度，決定了后續(xù)步驟是否進行下去。當各種因素導致酪氨酸酶活性增加時，黑色素合成增加，當酪氨酸酶活性被抑制時，黑色素合成減少。

最新研究表明，黑色素合成過程中除了酪氨酸酶起作用外，還有3種酶對黑色素的合成也發(fā)揮不可忽視的作用。即多巴色素互變酶，5-6二羥基吲哚-2羧酸氧化酶和過氧化物酶。多巴色素互變酶催化多巴向5,6二羥基吲哚-2羧酸的轉(zhuǎn)化，dhhca氧化酶催化5,6二羥基吲哚-2羧酸向5,6-二酮基吲哚酸轉(zhuǎn)化。上述四種酶可以單獨作用也可以協(xié)同作用，促進黑色素合成。

黑色素的形成不僅是黑色素細胞的細胞內(nèi)生化結(jié)果，同時與之相鄰的角質(zhì)細胞(每個黑色素細胞周圍約有36個角質(zhì)細胞)、成纖維細胞、吞噬細胞以及角質(zhì)細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮素對黑色素形成也有較大影響。

2美白機理

皮膚美白劑就是作用于皮膚黑色素生成，代謝過程中抑制黑色素生成且符合法規(guī)的物質(zhì)。美白機理即是黑色素的抑制機理。

黑色素細胞的胞內(nèi)抑制：在黑色素形成過程中酪氨酸酶是主要限速酶，該酶活性大小決定了黑色素形成的數(shù)量，酪氨酸酶是一種多酚氧化酶，屬于氧化還原酶類，該酶主要催化兩類不同的反應(yīng)：1)一元酚羥基化，生成鄰二羥基化合物；2)鄰二酚氧化，生成鄰二苯醌。這兩類反應(yīng)中均有氧自由基參與反應(yīng)。當前化妝品市場上美白產(chǎn)品，絕大多數(shù)以酪氨酸酶抑制劑為主。

依據(jù)黑色素抑制機理的不同，可將該化合物分為兩類：1)酪氨酸酶的破壞型抑制劑，即尋找某種美白劑，使該美白劑直接對酪氨酸酶進行修飾，改性，使之失去對黑色素前體-酪氨酸作用，從而達到抑制黑色素形成的目的；2)酪氨酸酶的非破壞型抑制，即不對酪氨酸酶本身進行修飾，改性，而是通過抑制酪氨酸酶的合成或取代酪氨酸酶的作用底物，從而達到抑制黑色素形成的目的。

根據(jù)非破壞型抑制劑的美白機理，大致有以下三種：(1)酪氨酸酶合成抑制劑；(2)酪氨酸酶作用底物替代劑；(3)酪氨酸酶糖苷化作用抑制劑。

3美白劑優(yōu)選

本申請上述酪氨酸酶抑制組合物針對黑色素形成的限速酶酪氨酸酶和酪氨酸進行靶向抑制，采用熊果苷參與多巴與酪氨酸酶的競爭，優(yōu)先于酪氨酸酶起作用，生成無色的物質(zhì)，減少多巴與酪氨酸酶反應(yīng)生成黑色素的機會；采用鞣花酸直接與酪氨酸酶中的銅離子螯合反應(yīng)，進而使酶失去活性，從而起不到催化生成黑色素生成作用；采用抗壞血酸磷酸酯鈉，還原黑色素形成過程的中間體，減少黑色素生成；酪氨酸酶是一種多酚氧化酶，屬于氧化還原酶類，其催化反應(yīng)均需要氧自由基參與反應(yīng)，采用肌肽消除氧自由基，抑制酪氨酸酶催化反應(yīng)正向進行。

本專利上述酪氨酸酶抑制組合物針對黑色素合成的關(guān)鍵靶向酪氨酸酶進行直接抑制，間接競爭，還原黑色素形成過程中間體，消除酪氨酸酶催化反應(yīng)所氧自由基四個靶點抑制黑色素生成。

3.1抗壞血酸磷酸酯鈉

維生素c具有很好的美白，祛斑效果，但由于本身不穩(wěn)定，本專利采用抗壞血酸磷酸酯鈉,進入身體后，在α-葡糖甘酶作用下可慢慢分解，產(chǎn)生游離的維生素c，從而顯現(xiàn)美白效果，且在中性，酸性溶液中非常穩(wěn)定，有利于其與其他美白劑復配。

采用抗壞血酸磷酸酯鈉，其對美白機理表現(xiàn)兩個途徑，一是抑制酪氨酸酶的作用，二是使氧化性黑色素還原為無色的還原性黑色素，在表皮和真皮內(nèi)存在的α-葡糖甘酶作用下可緩慢分解維生素c，這種緩釋作用大大延長了維生素c作用時間，提高了美白效果。

3.2β-熊果苷

熊果苷，白色粉末，易溶于水，從其分子結(jié)構(gòu)看，它實際上市對苯二酚的糖類衍生物，其水解產(chǎn)物為對苯二酚和葡萄糖。其作用機理是通過與多巴競爭酪氨酸酶生成無色的物質(zhì)，從而抑制黑色素的生成。

3.3鞣花酸

鞣花酸是廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的一種天然多酚組分，鞣花酸，它是沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內(nèi)酯。它不僅能以游離的形式存在，而且更多的是以縮合形式(如鞣花單寧、苷等)存在于自然界。

鞣花酸能抑制酪氨酸酶活性，阻斷黑色素生成，具有美白及淡斑的效果。除此之外，鞣花酸可有效保護肌膚免于外界傷害。阻斷酪氨酸酶的活性，抑制黑色素的生成，并具有抗氧化作用。其美白原理是直接與酪氨酸酶中的銅離子熬合作用，讓酪氨酸酶直接失去活性。

3.4肌肽

肌肽(l-carnosine)，學名β-丙氨酰-l-組氨酸，是一種由β-丙氨酸和l-組氨酸兩種氨基酸組成的二肽，結(jié)晶狀固體。肌肉和腦部的組織含有很高濃度的肌肽。肌肽是一種跟肉堿一起由俄國化學家古列維奇發(fā)現(xiàn)。肌肽具有很強的抗氧化能力，對人體有益。肌肽已被證實可清除在氧化應(yīng)激過程中使細胞膜的脂肪酸過度氧化而形成的活性氧自由基(ros)以及α-β不飽和醛。

本專利利用肌肽的抗氧化性能，通過消除氧自由基，抑制酪氨酸酶的活性，并還原已生成的黑色素。

本發(fā)明上述酪氨酸酶抑制組合物具有如下優(yōu)點：

(1)針對黑色素形成的限速酶酪氨酸酶和酪氨酸進行靶向抑制，采用熊果苷參與多巴與酪氨酸酶的競爭，優(yōu)先于酪氨酸酶起作用，生成無色的物質(zhì)，減少多巴與酪氨酸酶反應(yīng)生成黑色素的機會。

(2)采用鞣花酸直接與酪氨酸酶中的銅離子螯合反應(yīng)，進而使酶失去活性，從而起不到催化生成黑色素生成作用。

(3)采用抗壞血酸磷酸酯鈉其對美白機理表現(xiàn)兩個途徑，一是抑制酪氨酸酶的作用，二是使氧化性黑色素還原為無色的還原性黑色素，在表皮和真皮內(nèi)存在的α-葡糖甘酶作用下可緩慢分解維生素c，這種緩釋作用大大延長了維生素c作用時間，提高了美白效果。

(4)酪氨酸酶是一種多酚氧化酶，屬于氧化還原酶類，其催化反應(yīng)均需要氧自由基參與反應(yīng)，上述酪氨酸酶抑制組合物采用肌肽消除氧自由基，抑制酪氨酸酶催化反應(yīng)正向進行。

(5)選擇熊果苷與鞣花酸組合針對黑色素合成過程的酪氨酸酶和多巴氧化酶均有很好的抑制作用，鞣花酸抑制黑色素合成的機制，鞣花酸對酪氨酸酶活性部位的銅離子具有高親和力，鞣花酸對酪氨酸酶的活性隨著銅離子減少而減弱。

(6)上述酪氨酸酶抑制組合物針對黑色素合成的關(guān)鍵靶向酪氨酸酶進行直接抑制，間接競爭，還原黑色素形成過程中間體，消除酪氨酸酶催化反應(yīng)所需氧自由基四個靶點抑制黑色素生成。

附圖說明

圖1為實例樣和對照樣酪氨酸酶活性的抑制效果比較圖；

圖2為實例樣和對照樣黑色素量比較圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。

實例樣和對照樣配比如下：

以實例樣3為例，加入質(zhì)量比1:1的卡波20(0.1-0.6質(zhì)量份)和精氨酸(0.1-0.6質(zhì)量份)，添加phl1％作為防腐劑，加入去離子水至100份制備工藝如下：

(1)按照配方配比稱取甘油，丙二醇，丁二醇，甜菜堿，尿囊素，海藻糖，透明質(zhì)酸鈉(寡聚)，加入工藝水加熱至75-80℃，以250-300r/min,攪拌20min,直至溶解透明；

(2)按照配方配比稱取β-熊果苷，鞣花酸溫度控制為65-75℃，以300r/min，攪拌15min,直至所有添加物全部溶解；

(3)按照配比稱取肌肽，aa2g，溫度控制在50-60℃，以200r/min攪拌15min,直至全部溶解；

(4)按照配比稱取卡波20、精氨酸，phl,溫度控制45℃以下，以100r/min，攪拌15min,靜置恢復到室溫即可。

美白功效評測

1、酪氨酸酶活性抑制效果測試

試劑：0.175mol/lpbs(ph6.8),1.5mmol/l酪氨酸,2000unit/ml酪氨酸酶。

實驗樣品準備：利用pbs對料體進行稀釋，稀釋后的濃度分別為5％，10％，50％。

測試方法：

(1)96wellplate上選取4個空，按照下圖表格中各個物質(zhì)的添加量進行添加

(2)震蕩充分混合后放置于37℃的培養(yǎng)箱中反應(yīng)

(3)25分鐘后利用酶標儀在490nm波長處測試吸光度(ab，absorbance)

(4)利用以下的公式計算酪氨酸酶活性的抑制效果：

實驗結(jié)果(如圖1和下表)：

2、細胞產(chǎn)生的黑色素量測試

實驗材料：b16f10，dmem培養(yǎng)基，胰蛋白酶，dpbs，70％酒精，naoh，dmso

實驗方法：

(1)將b16f10細胞消化后，利用dmem培基分散細胞，利用hemacytometer來計數(shù)細胞，然后利用dmem來稀釋細胞，稀釋到濃度為5×10⁴cells/ml。

(2)稀釋后的細胞溶液分別接種到6well中，每一孔為2ml，即1×10⁵cells/well。

(3)在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

(4)待測樣品準備：待測樣品用dmem培基稀釋，稀釋后的濃度分別為：50％(該濃度通過前面的mtt測試，結(jié)果為無毒)

(5)細胞培養(yǎng)24小時后，觀察細胞是否完全貼壁生長，如果細胞完全貼壁生長的話，將原培基移除，用dpbs洗滌。

(6)將dpbs移除之后，分別加入前面準備好的樣品。樣品的溶度根據(jù)毒性測試的結(jié)果選擇安全濃度100ppm(2ml/well)。

(7)樣品加入之后，放入37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。

(8)分別收集培基和細胞，分別測試細胞外與細胞內(nèi)的黑色素的含量

(9)培基部分：13500rpmx10mins離心后，取上層清液在波長415nm處測量吸光光度。

(10)細胞部分：將b16f10細胞消化后收集起來，13500rpmx10mins離心后，移除上層清液。底部的b16f10細胞中加入0.3ml的10％dmso，1nnaoh溶液，80℃水浴中裂解1小時。

(11)1小時后裂解液冷卻至室溫，13500rpmx10mins離心后收集上層清液

(12)利用酶標儀在波長415nm處測量上層清液的吸光光度od。

(13)配置黑色素標樣，濃度為1.0到100.0ppm，分別測試標樣的吸光光度，繪制出濃度與吸光光度的線性關(guān)系圖

(14)利用上述的線性關(guān)系圖可以得出細胞內(nèi)與細胞外黑色素的含量。

實驗結(jié)果(如圖2和下表)：

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。