本發(fā)明涉及復(fù)合生物材料，具體為一種可塑性人工骨及其制備方法。

背景技術(shù)：

硬組織(骨、牙)替代材料是生物材料的一大類，在生物材料產(chǎn)業(yè)中，涉及硬組織修復(fù)和替代材料的約占20％。對(duì)于中國這一人口大國來講，潛在的巨大需求是顯而易見的。此外，我國正步入老年人社會(huì)，60歲以上的老年人口已達(dá)1.4億，年老引起的機(jī)體組織，特別是硬組織病變，如骨質(zhì)疏松，需要大量的骨替代材料以用于臨床治療。因此，該領(lǐng)域的研究具有深遠(yuǎn)的社會(huì)影響和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

目前骨組織工程支架材料主要有兩類；一類是生物衍生材料，由生物組織通過一系列理化方法處理而制得，包括天然骨、膠原、珊瑚骨、殼聚糖等；另一類為人工合成材料，包括羥基磷灰石、鈣磷陶瓷、生物活性玻璃、聚酯類等。生物衍生材料具有來源豐富、造價(jià)低及有天然的網(wǎng)狀空隙結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。目前國內(nèi)市場骨修復(fù)產(chǎn)品主要包括磷酸三鈣、羥基磷灰石、i型膠原蛋白/羥基磷灰石復(fù)合物等，尚無β-tcp/膠原復(fù)合骨修復(fù)材料問世。國外市場骨修復(fù)產(chǎn)品種類較為豐富，其中integra公司的ososteoconductivescaffold和stryker公司(世界上最大的骨科產(chǎn)品生產(chǎn)商)的vitossbonegraftsubstitute產(chǎn)品，為β-tcp/膠原復(fù)合骨修復(fù)材料。

人體骨中含有水、有機(jī)相和無機(jī)相等成分。其中無機(jī)相主要為磷灰石等磷酸鈣類礦物相，約占60～70％；有機(jī)相包括90～95％的膠原蛋白、1％的粘多糖及5％的其它蛋白質(zhì)。骨的基本結(jié)構(gòu)單元就是礦化的膠原纖維，天然骨可以簡單的看成是膠原和羥基磷灰石(hap)在一定微觀程度上的有序排列。hap作為人體骨組織中的主要無機(jī)成分，是骨組織修復(fù)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。hap具有良好的組織相容性、骨傳導(dǎo)性、高度的生物活性等特性。但其本身也存在脆性大、硬度低、韌性差、不易降解等不足。β-磷酸三鈣(β-tcp)物理、化學(xué)性能和生物相容性與羥基磷灰石相似，具有良好的骨結(jié)合性、降解性和骨傳導(dǎo)性，因此在骨組織修復(fù)領(lǐng)域同樣備受重視，是另一種廣泛應(yīng)用的硬組織替代材料。與hap相比，其最重要的特點(diǎn)在于β-tcp被吸收后可為人體自身組織所替代。

hap和β-tcp在體內(nèi)可以與骨組織交互作用，參與骨骼的生長，但是hap和β-tcp通常是以粉末狀進(jìn)行填充，體液或血液的流動(dòng)會(huì)將這些粉末沖離骨缺損部位，植入效果就會(huì)大大折扣?，F(xiàn)有技術(shù)中，一些研究者將hap和β-tcp制成多孔材料，燒結(jié)成各種形狀及大小的材料，解決了容易被沖離骨缺損部位的缺陷，但是機(jī)械強(qiáng)度隨著孔隙率和孔尺寸的增加而顯著下降，尤其對(duì)于孔徑大于100μm的陶瓷來說，承重是個(gè)大問題，而且多孔陶瓷的尺寸大小和形狀不可能與骨缺損區(qū)域的尺寸完全吻合，因此在手術(shù)時(shí)為了二者盡量密合，需要挖大傷口或修剪植入材料，不僅對(duì)病患傷口造成二次傷害，而且延長了手術(shù)時(shí)間，患處與植入材料間所存留的一些間隙，也會(huì)妨礙骨愈合的進(jìn)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的hap和β-tcp生物陶瓷材料臨床應(yīng)用中尺寸不能與預(yù)期的尺寸完全吻合從而造成手術(shù)時(shí)間的延長及對(duì)病患傷口的二次傷害，而且患處與植入材料間所存留的一些間隙，更會(huì)使骨愈合因此受到阻礙的缺陷，提供一種可塑性人工骨及其制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種可塑性人工骨，包括50wt％～90wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和50wt％～10wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該可塑性人工骨以多孔磷酸鈣陶瓷為基體，以膠原蛋白為增韌補(bǔ)強(qiáng)項(xiàng)。進(jìn)一步的多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為60％～95％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為100～500微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內(nèi)壁布滿毛細(xì)微孔。

進(jìn)一步的，多孔磷酸鈣陶瓷的成分為羥基磷灰石、β-磷酸三鈣或雙相磷酸鈣陶瓷，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

一種可塑性人工骨的制備方法，包括以下步驟：

(1)、陶瓷預(yù)處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗0.5～2h，更換漂洗液，重復(fù)漂洗一次，隨后用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜后用去離子水重復(fù)漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘干后置于200～250℃下滅菌120～240min；

(2)膠原預(yù)處理a：取可溶性膠原蛋白，按15g～25g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，于100～105℃加熱1～4h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預(yù)處理膠原a；

(3)膠原預(yù)處理b：取可溶性膠原蛋白，稀釋成3-5mg/ml濃度的膠原液，取3～5l15℃以下連續(xù)攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為3:1-5:1，然后用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph至4.5～8.5，將膠原轉(zhuǎn)入烘箱，保持箱體內(nèi)部溫度在35±3℃，保溫15～36h，將膠原攪拌打散，離心8～15min，去上清液，收集沉淀，再將收集的沉淀加注射用水復(fù)溶，再離心8～15min，去上清液，收集沉淀，重復(fù)數(shù)次，將所得沉淀加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉淀溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3～5h換水一次，換水次數(shù)為4～5次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完后，收集膠原液，保持膠原濃度約為15mg/ml～25mg/ml，得預(yù)處理膠原b；

(4)陶瓷涂層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置于20～50ml預(yù)處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa涂層0.5-3h，保壓1-3h，再經(jīng)超聲波震蕩攪拌10～25min，重復(fù)抽真空負(fù)壓涂層一次，將涂層好的陶瓷冷凍干燥；

(5)將預(yù)處理膠原b稀釋至10～18mg/ml，將涂層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散于10～18mg/ml的預(yù)處理膠原b中，然后冷凍干燥；

(6)真空熱交聯(lián)或edc/nhs交聯(lián)，即得可塑性人工骨。真空熱交聯(lián)的方法為將冷凍干燥后的樣品于110℃～125℃干燥48～72h。edc/nhs交聯(lián)的方法為先配置0.5～10mm的edc/nhs交聯(lián)液，將冷凍干燥后的樣品放入交聯(lián)液中交聯(lián)12～36h，取出材料，冷凍干燥。

本發(fā)明采用50wt％～90wt％的多孔磷酸鈣陶瓷模擬骨組織的無機(jī)成分和50wt％～10wt％的可溶性膠原蛋白骨組織的有機(jī)成分，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成一種適合人類細(xì)胞生長的三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；多孔磷酸鈣溶解度大，比表面積大，易于降解，有利于新生細(xì)胞的吸附和血管的長入，從而具有良好的生物相容性，尤其是同骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有良好的相容性。多孔磷酸鈣作為骨形成的支架，同時(shí)對(duì)骨細(xì)胞亦具有引導(dǎo)作用。膠原蛋白表面富含沉積礦物的位點(diǎn)，可有效引發(fā)和控制礦化過程、促進(jìn)骨形成，使得肉芽組織長入植入物中，并向成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞提供營養(yǎng)，同時(shí)可作為生物陶瓷粉體的賦形劑，構(gòu)成植入材料的連續(xù)相，材料降解性能雙向可調(diào)，具有良好的微觀結(jié)構(gòu)與宏觀可塑性。將本發(fā)明的可塑性人骨應(yīng)用于骨缺損部位，能有效引導(dǎo)并加速骨組織的修復(fù)。

本發(fā)明通過膠原預(yù)處理a減弱基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp-2和mmp-9)和基質(zhì)溶素(stromelysins和matrilysin)對(duì)于創(chuàng)傷的負(fù)面影響，通過膠原預(yù)處理b增強(qiáng)可塑性人骨的機(jī)械強(qiáng)度；然后通過先涂層后凍干交聯(lián)的方式，使得可塑性人骨具備了均一的三維結(jié)構(gòu)，能更好的引導(dǎo)并加速骨組織的修復(fù)。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種可塑性人工骨，包括50wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和50wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為95％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為100微米左右，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內(nèi)壁布滿毛細(xì)微孔。

多孔磷酸鈣陶瓷的成分為羥基磷灰石，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

一種可塑性人工骨的制備方法，包括以下步驟：

(1)、陶瓷預(yù)處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗0.5h，更換漂洗液，重復(fù)漂洗一次，隨后用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜后用去離子水重復(fù)漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘干后置于200℃下滅菌240min；

(2)膠原預(yù)處理a：取可溶性膠原蛋白，按15g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，于100℃加熱1h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預(yù)處理膠原a；

(3)膠原預(yù)處理b：取可溶性膠原蛋白，溶解為3mg/ml濃度的膠原液，取3l15℃以下連續(xù)攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為3:1，然后用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph至4.5，將膠原轉(zhuǎn)入烘箱，保持箱體內(nèi)部溫度在32℃，保溫36h，將膠原攪拌打散，以5500r/min轉(zhuǎn)速離心8min，去上清液，收集沉淀，再將收集的沉淀加注射用水復(fù)溶，再以5500r/min轉(zhuǎn)速離心15min，去上清液，收集沉淀，重復(fù)數(shù)次，將所得沉淀加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉淀溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3h換水一次，換水次數(shù)為4次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完后，收集膠原液，保持膠原濃度約為15mg/ml，得預(yù)處理膠原b；

(4)陶瓷涂層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置于20ml預(yù)處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa涂層0.5h，保壓1h，再經(jīng)超聲波震蕩攪拌10min，重復(fù)抽真空負(fù)壓涂層一次，將涂層好的陶瓷冷凍干燥；

(5)將預(yù)處理膠原b稀釋至10mg/ml，將涂層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散于10mg/ml的預(yù)處理膠原b中，然后冷凍干燥；

(6)配置0.5mm的edc/nhs交聯(lián)液，將冷凍干燥后的樣品放入交聯(lián)液中交聯(lián)24h，取出材料，冷凍干燥。

實(shí)施例2

一種可塑性人工骨，包括90％wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和10wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為60％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為500微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內(nèi)壁布滿毛細(xì)微孔。

多孔磷酸鈣陶瓷的成分為β-磷酸三鈣，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

一種可塑性人工骨的制備方法，包括以下步驟：

(1)、陶瓷預(yù)處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗2h，更換漂洗液，重復(fù)漂洗一次，隨后用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜后用去離子水重復(fù)漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘干后置于250℃下滅菌120min；

(2)膠原預(yù)處理a：取可溶性膠原蛋白，按25g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，于105℃加熱4h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預(yù)處理膠原a；

(3)膠原預(yù)處理b：取可溶性膠原蛋白，溶解為5mg/ml濃度的膠原液，取5l15℃以下連續(xù)攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為5:1，然后用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph至8.5，將膠原轉(zhuǎn)入烘箱，保持箱體內(nèi)部溫度在38℃，保溫20h，將膠原攪拌打散，以5500r/min轉(zhuǎn)速離心15min，去上清液，收集沉淀，再將收集的沉淀加注射用水復(fù)溶，再以5500r/min轉(zhuǎn)速離心8min，去上清液，收集沉淀，重復(fù)數(shù)次，將所得沉淀加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉淀溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3h換水一次，換水次數(shù)為5次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完后，收集膠原液，保持膠原濃度約為25mg/ml，得預(yù)處理膠原b；

(4)陶瓷涂層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置于50ml預(yù)處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa涂層3h，保壓3h，再經(jīng)超聲波震蕩攪拌25min，重復(fù)抽真空負(fù)壓涂層一次，將涂層好的陶瓷冷凍干燥；

(5)將預(yù)處理膠原b稀釋至18mg/ml，將涂層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散于18mg/ml的預(yù)處理膠原b中，然后冷凍干燥；

(6)配置0.5mm的edc/nhs交聯(lián)液，將冷凍干燥后的樣品放入交聯(lián)液中交聯(lián)24h，取出材料，冷凍干燥。

實(shí)施例3

一種可塑性人工骨，包括70wt％的多孔磷酸鈣陶瓷和30wt％的可溶性膠原蛋白，可溶性膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該可塑性人工骨以多孔磷酸鈣陶瓷為基體，以膠原蛋白為增韌補(bǔ)強(qiáng)項(xiàng)。多孔磷酸鈣陶瓷的總體孔隙率為75％。多孔磷酸鈣陶瓷的大孔孔徑為300微米，大孔之間有微孔相互貫通，大孔內(nèi)壁布滿毛細(xì)微孔。

進(jìn)一步的，多孔磷酸鈣陶瓷的成分為羥基磷灰石、β-磷酸三鈣或雙相磷酸鈣陶瓷，膠原蛋白為i型膠原蛋白；膠原蛋白在多孔磷酸鈣陶瓷的空隙中形成三維膠原蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

一種可塑性人工骨的制備方法，包括以下步驟：

(1)、陶瓷預(yù)處理：將多孔磷酸鈣陶瓷浸入75％乙醇溶液中超聲漂洗1h，更換漂洗液，重復(fù)漂洗一次，隨后用去離子水超聲漂洗，浸泡過夜后用去離子水重復(fù)漂洗，將充分漂洗的多孔磷酸鈣陶充分烘干后置于200℃下滅菌240min；

(2)膠原預(yù)處理a：取可溶性膠原蛋白，按22g溶解至1kg的比例用注射用水溶解均勻，于102℃加熱1.5h，直至膠原蛋白完全液化成流體狀，得預(yù)處理膠原a；

(3)膠原預(yù)處理b：取可溶性膠原蛋白，溶解為4mg/ml濃度的膠原液，取4l15℃以下連續(xù)攪拌30min以上。邊攪拌邊加入1l0.1mpbs溶液，膠原液和pbs溶液的體積比為4:1，然后用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph至7，將膠原轉(zhuǎn)入烘箱，保持箱體內(nèi)部溫度在35℃，保溫22h，將膠原攪拌打散，以5500r/min轉(zhuǎn)速離心12min，去上清液，收集沉淀，再將收集的沉淀加注射用水復(fù)溶，再以5500r/min轉(zhuǎn)速離心10min，去上清液，收集沉淀，重復(fù)數(shù)次，將所得沉淀加注射水至總重0.15kg，攪拌使得沉淀溶解均勻，裝入透析袋中，用注射水透析，每隔3h換水一次，換水次數(shù)為4次，保持透析液的溫度在15℃以下，透析完后，收集膠原液，保持膠原濃度約為22mg/ml，得預(yù)處理膠原b；

(4)陶瓷涂層：將30g多孔磷酸鈣陶瓷置于35ml預(yù)處理膠原a中浸潤，常溫下抽真空至-0.1mpa涂層1h，保壓2h，再經(jīng)超聲波震蕩攪拌15min，重復(fù)抽真空負(fù)壓涂層一次，將涂層好的陶瓷冷凍干燥；

(5)將預(yù)處理膠原b稀釋至14mg/ml，將涂層好的多孔磷酸鈣陶分散成均勻顆粒，均勻分散于14mg/ml的預(yù)處理膠原b中，然后冷凍干燥；

(6)配置5mm的edc/nhs交聯(lián)液，將冷凍干燥后的樣品放入交聯(lián)液中交聯(lián)12h，取出材料，冷凍干燥。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。