本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防收縮的人工真皮構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1987年，在華盛頓舉辦的生物工程小組會(huì)上，組織工程一詞首次被提出。后于1988年正式被定義為：應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識哺乳動(dòng)物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。

皮膚組織工程是組織工程的重要組成部分，它是將體外培養(yǎng)的皮膚種子細(xì)胞（主要是角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞），與由天然細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合或合成的可降解生物相容性材料相結(jié)合，形成的細(xì)胞-材料復(fù)合物，在體外進(jìn)行一段時(shí)間的培養(yǎng)后，用于臨床治療或藥品、化妝品等的體外替代檢測。

真皮層的構(gòu)建是構(gòu)建組織工程皮膚中的重要環(huán)節(jié)。目前，真皮組織體外構(gòu)建的方法主要是將成纖維細(xì)胞接種于天然的（膠原等細(xì)胞外基質(zhì)）或人工的（聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚羥基烷酸酯等）真皮支架中，經(jīng)過培養(yǎng)后，構(gòu)成真皮層。以膠原等細(xì)胞外基質(zhì)為支架構(gòu)成的真皮替代物的組織學(xué)表現(xiàn)更接近正常真皮，并且避免了加入合成聚合體和交聯(lián)劑可能導(dǎo)致的未知毒性，同時(shí)還具有生產(chǎn)皮膚替代物所必需的細(xì)胞數(shù)量相對較少等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床與體外替代檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

利用膠原作為支架材料構(gòu)建的人工真皮仍然存在一些技術(shù)缺陷，現(xiàn)有技術(shù)在膠原支架上接種成纖維細(xì)胞時(shí)，是一步接種，得到的真皮容易產(chǎn)生收縮，這嚴(yán)重影響了人工真皮替代物在臨床以及體外替代檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對人工真皮構(gòu)建過程中易收縮這一技術(shù)不足，本發(fā)明提供了一種防皺縮的人工真皮構(gòu)建方法，采用差異化接種的方式，使人工真皮的上層細(xì)胞密度相對較大，可以滿足檢測需要的細(xì)胞數(shù)目；下層密度相對較小，可以減少細(xì)胞生長過程中對膠原基質(zhì)的利用，從而實(shí)現(xiàn)減少下層真皮收縮的目的。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種防收縮的人工真皮構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟一：成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將已去除脂肪和結(jié)締組織的皮膚組織進(jìn)行消化培養(yǎng)，取第5~7代細(xì)胞用于真皮構(gòu)建；

步驟二：膠原支架的制備

將膠原完全溶解于酸溶液中，將膠原溶解液、新生牛血清和deme混勻，并調(diào)ph至7.2～7.4，得膠原溶液；

步驟三：真皮層的接種

取步驟一的成纖維細(xì)胞與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成密度為6×105～9×105cells/ml的細(xì)胞膠原混合液i；另取步驟一的成纖維細(xì)胞與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成密度為2×105～3×105cells/ml的細(xì)胞膠原混合液ii；將30~50μl的細(xì)胞膠原混合液ii加入到transwell小室中，待細(xì)胞膠原混合液ii凝固后，將100~150μl的細(xì)胞膠原混合液i加入到混合液ii表面；

步驟四：人工真皮的培養(yǎng)

待混合液i凝固后，將transwell小室放入培養(yǎng)皿中，在transwell小室內(nèi)外均加入培養(yǎng)液，放入含4.5%-5.5%co2、37±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到所述人工真皮。

優(yōu)選地，步驟四所述在transwell小室內(nèi)外均加入的培養(yǎng)液為，包括體積比為3:1的dmem和dmem/f12的混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液中還添加有胎牛血清、nahco3、維生素c、胰島素、氫化可的松、腺嘌呤和堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述培養(yǎng)液中胎牛血清的質(zhì)量百分比為3～10％，所述nahco3的濃度為3～5mg/ml，所述維生素c的濃度為50～100mg/l，所述胰島素的濃度為15～30ng/ml，所述氫化可的松的濃度為150～180ng/l，所述腺嘌呤的濃度為55～75μg/ml，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為8～12ng/ml。

進(jìn)一步地，所述traswell小室內(nèi)加入所述培養(yǎng)液200μl，所述traswell小室外加入所述培養(yǎng)液120ml。

優(yōu)選地，成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法為：將已去除脂肪和結(jié)締組織的皮膚組織置于培養(yǎng)液i中，放置于4℃過夜；加入與培養(yǎng)液i等體積的消化液，37℃空氣搖床180rpm20min后終止消化；1000rpm離心10min收集細(xì)胞；以每毫升2×105～4×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)液ⅱ，5％co2、37℃條件下培養(yǎng)；

其中，培養(yǎng)液i為dmem，其中還添加有膠原酶、透明質(zhì)酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述培養(yǎng)液i中各添加元素的濃度為：膠原酶200u?ml-1、透明質(zhì)酸300u?ml-1、谷氨酰胺2～10mm、孕酮10～20nm、丁二胺30～60μm、硒酸鈉15～30nm、轉(zhuǎn)鐵蛋白65～100ng/ml；

消化液為磷酸鹽緩沖液pbs，其中還含有0.25％體積的胰酶和0.02％體積的乙二胺四乙酸edta；

培養(yǎng)液ii為10％體積的胎牛血清和90％體積的dmem的混合液。

優(yōu)選地，膠原支架的制備方法為：將牛膠原置于0.1%醋酸溶液中，攪拌至膠原完全溶解后，置于4℃冰箱靜置過夜；然后以膠原溶解液：新生牛血清：10×deme=1：1：8的體積比混勻后，加入堿溶液，調(diào)ph至7.2～7.4即得。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的人工真皮以膠原為支架材料，采用差異化接種的方式分兩層接種，上層細(xì)胞密度相對較大，可以滿足檢測需要的細(xì)胞數(shù)目；下層密度相對較小，可以減少細(xì)胞生長過程中對膠原基質(zhì)的利用，從而減少下層真皮收縮。如圖2所示，這種接種方式可以有效防止由于真皮收縮造成的真皮與底膜脫離的現(xiàn)象，真皮與底膜間形成的張力可以有效的防止真皮繼續(xù)收縮。

附圖說明

圖1是由本發(fā)明實(shí)施例提供的人工真皮構(gòu)建的全層皮膚模型的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是由本發(fā)明實(shí)施例提供的人工構(gòu)建的全層皮膚模型表觀拍照圖；

圖3是由本發(fā)明實(shí)施例提供的人工真皮構(gòu)建的全層皮膚模型的he染色圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施方式。

實(shí)施例1

本實(shí)施例構(gòu)建了一種防收縮的人工真皮，具體方法如下。

步驟一：成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將已去除脂肪和結(jié)締組織的1mm3的新生兒包皮組織置于培養(yǎng)液i中，放置于4℃環(huán)境過夜；加入與培養(yǎng)液i等體積的消化液，置于空氣搖床中，在37℃下以180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩20min后終止消化；然后以1000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，收集固體細(xì)胞。

將收集到的細(xì)胞以4×105cells/ml的密度接種于培養(yǎng)液ii，在5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取第7代細(xì)胞用于真皮構(gòu)建。

其中培養(yǎng)液i為dmem（sigma公司），含有膠原酶200u?ml-1、透明質(zhì)酸300u?ml-1、谷氨酰胺10mm、孕酮10nm、丁二胺50μm、硒酸鈉30nm、轉(zhuǎn)鐵蛋白80ng/ml；培養(yǎng)液ii為體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清（fbs）+90％dmem（體積分?jǐn)?shù)）；消化液為含有0.25％胰酶（體積分?jǐn)?shù)）和0.02％（體積分?jǐn)?shù)）乙二胺四乙酸（edta）的磷酸鹽緩沖液（pbs）。

步驟二：膠原支架的制備

將冰醋酸用去離子水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%醋酸溶液，過濾除菌備用。稱量0.6g牛膠原（sigma5162）置于100ml0.1%醋酸溶液中，使用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，待膠原完全溶解后，置于4℃冰箱靜置24h。然后以膠原溶解液：新生牛血清：10×deme=1：1：8的體積比混勻后，加入1mol/lnaoh溶液，調(diào)ph至7.2~7.4，得膠原溶液。

步驟三：真皮層的接種

取p7代的成纖維細(xì)胞，以7×105cells/ml的密度與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成細(xì)胞膠原混合液i。另取p7代的成纖維細(xì)胞，以2×105cells/ml的密度與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成細(xì)胞膠原混合液ii。將30μl的細(xì)胞膠原混合液ii加入到transwell小室中，待細(xì)胞膠原混合液ii凝固后，將120μl的細(xì)胞膠原混合液i加入到混合液ii表面。

步驟四：人工真皮的培養(yǎng)

待混合液i凝固后，將transwell小室放入培養(yǎng)皿中，在transwell小室中加入200μl培養(yǎng)液iii，在培養(yǎng)皿中transwell小室外部分加入120ml培養(yǎng)液iii，培養(yǎng)液iii為75％dmem+25％f12（體積比為3：1），添加胎牛血清5％（體積分?jǐn)?shù)）、nahco35mg/ml、維生素c70mg/l，胰島素20ng/ml，氫化可的松160ng/l，腺嘌呤55μg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子8ng/ml。

然后放入含4.5%-5.5%co2、37±1℃孵箱中培養(yǎng)，每天換液，9天后得到本發(fā)明的人工真皮。

實(shí)施例2

本實(shí)施例構(gòu)建了一種防收縮的人工真皮，具體方法如下。

步驟一：成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將已去除脂肪和結(jié)締組織的1mm3的新生兒包皮組織置于培養(yǎng)液i中，放置于4℃環(huán)境過夜；加入與培養(yǎng)液i等體積的消化液，置于空氣搖床中，在37℃下以180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩20min后終止消化；然后以1000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，收集固體細(xì)胞。

將收集到的細(xì)胞以2×105cells/ml的密度接種于培養(yǎng)液ii，在5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取第5代細(xì)胞用于真皮構(gòu)建。

其中培養(yǎng)液i為dmem（sigma公司），含有膠原酶200u?ml-1、透明質(zhì)酸300u?ml-1、谷氨酰胺2mm、孕酮20nm、丁二胺30μm、硒酸鈉15nm、轉(zhuǎn)鐵蛋白65ng/ml；培養(yǎng)液ii為體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清（fbs）+90％dmem（體積分?jǐn)?shù)）；消化液為含有0.25％胰酶（體積分?jǐn)?shù)）和0.02％（體積分?jǐn)?shù)）乙二胺四乙酸（edta）的磷酸鹽緩沖液（pbs）。

步驟二：膠原支架的制備

將冰醋酸用去離子水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%醋酸溶液，過濾除菌備用。稱量0.6g牛膠原（sigma5162）置于100ml0.1%醋酸溶液中，使用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，待膠原完全溶解后，置于4℃冰箱靜置24h。然后以膠原溶解液：新生牛血清：10×deme=1：1：8的體積比混勻后，加入1mol/lnaoh溶液，調(diào)ph至7.2~7.4，得膠原溶液。

步驟三：真皮層的接種

取p7代的成纖維細(xì)胞，以9×105cells/ml的密度與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成細(xì)胞膠原混合液i。另取p7代的成纖維細(xì)胞，以3×105cells/ml的密度與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成細(xì)胞膠原混合液ii。將50μl的細(xì)胞膠原混合液ii加入到transwell小室中，待細(xì)胞膠原混合液ii凝固后，將100μl的細(xì)胞膠原混合液i加入到混合液ii表面。

步驟四：人工真皮的培養(yǎng)

待混合液i凝固后，將transwell小室放入培養(yǎng)皿中，在transwell小室中加入200μl培養(yǎng)液iii，在培養(yǎng)皿中transwell小室外部分加入120ml培養(yǎng)液iii，培養(yǎng)液iii為75％dmem+25％f12（體積比為3：1），添加胎牛血清3％（體積分?jǐn)?shù)）、nahco33mg/ml、維生素c80mg/l，胰島素15ng/ml，氫化可的松180ng/l，腺嘌呤75μg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子12ng/ml。

然后放入含4.5%-5.5%co2、37±1℃孵箱中培養(yǎng)，每天換液，9天后得到本發(fā)明的人工真皮。

實(shí)施例3

本實(shí)施例構(gòu)建了一種防收縮的人工真皮，具體方法如下。

步驟一：成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將已去除脂肪和結(jié)締組織的1mm3的新生兒包皮組織置于培養(yǎng)液i中，放置于4℃環(huán)境過夜；加入與培養(yǎng)液i等體積的消化液，置于空氣搖床中，在37℃下以180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩20min后終止消化；然后以1000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，收集固體細(xì)胞。

將收集到的細(xì)胞以4×105cells/ml的密度接種于培養(yǎng)液ii，在5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取第6代細(xì)胞用于真皮構(gòu)建。

其中培養(yǎng)液i為dmem（sigma公司），含有膠原酶200u?ml-1、透明質(zhì)酸300u?ml-1、谷氨酰胺5mm、孕酮15nm、丁二胺40μm、硒酸鈉15nm、轉(zhuǎn)鐵蛋白65ng/ml；培養(yǎng)液ii為體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清（fbs）+90％dmem（體積分?jǐn)?shù)）；消化液為含有0.25％胰酶（體積分?jǐn)?shù)）和0.02％（體積分?jǐn)?shù)）乙二胺四乙酸（edta）的磷酸鹽緩沖液（pbs）。

步驟二：膠原支架的制備

將冰醋酸用去離子水稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%醋酸溶液，過濾除菌備用。稱量0.6g牛膠原（sigma5162）置于100ml0.1%醋酸溶液中，使用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，待膠原完全溶解后，置于4℃冰箱靜置24h。然后以膠原溶解液：新生牛血清：10×deme=1：1：8的體積比混勻后，加入1mol/lnaoh溶液，調(diào)ph至7.2~7.4，得膠原溶液。

步驟三：真皮層的接種

取p7代的成纖維細(xì)胞，以6×105cells/ml的密度與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成細(xì)胞膠原混合液i。另取p7代的成纖維細(xì)胞，以2×105cells/ml的密度與步驟二中配置好的膠原溶液混勻，形成細(xì)胞膠原混合液ii。將40μl的細(xì)胞膠原混合液ii加入到transwell小室中，待細(xì)胞膠原混合液ii凝固后，將150μl的細(xì)胞膠原混合液i加入到混合液ii表面。

步驟四：人工真皮的培養(yǎng)

待混合液i凝固后，將transwell小室放入培養(yǎng)皿中，在transwell小室中加入200μl培養(yǎng)液iii，在培養(yǎng)皿中transwell小室外部分加入120ml培養(yǎng)液iii，培養(yǎng)液iii為75％dmem+25％f12（體積比為3：1），添加胎牛血清10％（體積分?jǐn)?shù)）、nahco35mg/ml、維生素c50mg/l，胰島素30ng/ml，氫化可的松150ng/l，腺嘌呤60μg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子10ng/ml。

然后放入含4.5%-5.5%co2、37±1℃孵箱中培養(yǎng)，每天換液，9天后得到本發(fā)明的人工真皮。

本發(fā)明的人工真皮具有一定的彈性和韌性，可用于構(gòu)建組織工程全層皮膚模型，以實(shí)施例1為例，其全層皮膚構(gòu)建方法如下。

1、接種表皮細(xì)胞

取p6代表皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，培養(yǎng)至融合率達(dá)60%左右；按照接種密度2.5e5/孔將表皮細(xì)胞接種于transwell小室中培養(yǎng)4天后的真皮層表面。然后在transwell小室中加入培養(yǎng)液sk1200μl，將培養(yǎng)皿中的基礎(chǔ)構(gòu)建培養(yǎng)液也更換為培養(yǎng)液sk1（120ml）。

其中培養(yǎng)液sk1為：體積比75％dmem+25％dmem/f12，添加nahco3為5mg/ml，孕酮50nm，丁二胺60μm，硒酸鈉20nm，胰島素30ng/ml，胎牛血清10％，氫化可的松180ng/l，腺嘌呤60μg/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子10ng/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白20ng/ml，血管生長因子10ng/ml，表皮細(xì)胞生長因子25ng/ml。

2、全層皮膚模型的培養(yǎng)

a.在含4.5%-5.5%co2、37±1℃孵箱中用培養(yǎng)液sk1對全層皮膚模型進(jìn)行液下培養(yǎng)2天，每天換液。

b.用吸棄小室中及培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)皿中加入120ml培養(yǎng)液sk2進(jìn)行氣液面培養(yǎng)2天；

其中，培養(yǎng)液sk2為sk1+維生素c50mg/l+維生素e10mg/l+氯化鈣15μg/ml+c-木糖苷50mg/l+天冬氨酸鎂1mm。

c.用培養(yǎng)液sk3對全層皮膚模型進(jìn)行氣液面培養(yǎng)2天；

其中，培養(yǎng)液sk3為sk1+維生素c50mg/l+維生素e10mg/l+氯化鈣30μg/ml+c-木糖苷50mg/l+天冬氨酸鎂1mm。

d.用培養(yǎng)液sk4對全層皮膚模型進(jìn)行氣液面培養(yǎng)3天后，用10%甲醛對皮膚模型進(jìn)行組織固定，并進(jìn)行he染色。

其中，培養(yǎng)液sk4為sk1+維生素c50mg/l+維生素e10mg/l+氯化鈣45μg/ml+c-木糖苷50mg/l+天冬氨酸鎂1mm。

此全層皮膚模型的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，真皮層分為上下兩層。為了驗(yàn)證本發(fā)明的皮膚結(jié)構(gòu)，用10%甲醛溶液對此全層皮膚模型進(jìn)行組織固定，并進(jìn)行蘇木素-伊紅染色（he染色法），得到的組織形態(tài)如圖2所示。從圖3中可以看出，本發(fā)明的人工真皮成功的用于構(gòu)建組織工程全層皮膚，同時(shí)，真皮層細(xì)胞密度不同，上層密度較大，下層密度較小。采用image-proplus軟件對所得的全層皮膚模型真皮細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，真皮上層細(xì)胞密度為937±42個(gè)/mm2，可以滿足檢測需要的細(xì)胞數(shù)目；下層細(xì)胞密度為251±23個(gè)/mm2。