本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及已知化學成分的聯(lián)合用藥，具體涉及一種治療心肌梗死的藥物組合物。

背景技術(shù)：

急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)是最嚴重的冠狀動脈疾病，在發(fā)達國家每年死亡人數(shù)的三分之一死于該疾病。在美國，超過240萬人死于心肌梗死，在歐洲和亞洲北部，超過400萬人死于心肌梗死[worldwidetrendsinbloodpressurefrom1975to2015:apooledanalysisof1479population-basedmeasurementstudieswith19·1millionparticipants,lancet.2016nov15.pii:s0140-6736(16)31919-5]。近幾十年來，臨床多通過經(jīng)皮冠狀動脈介入治療或者溶栓治療的方式來降低冠心病的死亡率，藥物多用于二級預防，目前臨床使用的藥物有抗血小板制劑(阿斯匹林)、β-受體阻滯劑、他汀類調(diào)脂藥物及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等[futuretreatmentstrategiesinst-segmentelevationmyocardialinfarction,lancet.2013aug17；382(9892):644-57]，能夠有效治療ami，但是仍有繼發(fā)性的梗死、心率衰竭等心血管事件發(fā)生，并且這些藥物或多或少都存在一些不良反應，治療ami新藥研發(fā)迫在眉睫。

心肌缺血再灌注損傷是指在心肌缺血一段時間后，再次恢復血供后發(fā)生的更為嚴重的損傷，可以導致缺血面積擴大、無復流、心肌頓抑和再灌注心律失常等。急性心肌梗死缺血再灌注會對急性心肌梗死患者的機體產(chǎn)生嚴重損傷。丹參酮是丹參中具有較強生物活性和廣泛藥理作用的一類脂溶性二萜醌類化合物，是目前國際上廣泛認可的有效治療心腦血管疾病的天然藥物之一，多項研究均表明丹參酮對心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用(丹參酮對兔急性心梗再灌注損傷的心肌保護，中國現(xiàn)代應用藥學2013年10月第30卷第10期)。

但是，丹參酮類化合物對機體也存在毒副作用。w.y.w.lee等發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮、丹參酮i、丹參酮iia、二氫丹參酮i這四種丹參酮類化合物具有明顯的體外細胞毒性[cytotoxicityofmajortanshinonesisolatedfromdanshen(salviamiltiorrhiza)onhepg2cellsinrelationtoglutathioneperturbation,foodchemtoxicol.2008jan；46(1):328-38]。發(fā)明人所在課題組也證實了這種體外細胞毒性，同時還證實了這四種丹參酮類化合物的體內(nèi)毒性，其在降低急性心肌梗死模型大鼠梗死面積的同時，也明顯導致模型大鼠的死亡率升高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于治療心肌梗死的藥物組合物，該組合物中含有丹參酮類成分，更為重要的是含有一種對丹參酮類成分具有減毒增效作用的酚酸類成分，以制備出對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用且毒副作用明顯降低的藥物。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種治療急性心肌梗死的藥物組合物，包括式(ⅰ)所示的丹參酮類化合物和含有一個或多個式(ⅱ)所示取代基的酚酸類化合物；

其中，r為-h或-ch3；r為-h時，c3-c4和c5-c6為雙鍵；r為-ch3時，c3-c4和c5-c6為單鍵；c1-c2為單鍵或雙鍵。

優(yōu)選地，所述丹參酮類化合物為丹參酮i，所述酚酸類化合物為丹參素。

優(yōu)選地，所述丹參酮類化合物為丹參酮iia，所述酚酸類化合物為丹酚酸b。

優(yōu)選地，所述丹參酮類化合物為二氫丹參酮i，所述酚酸類化合物為原兒茶醛。

優(yōu)選地，所述丹參酮類化合物為隱丹參酮，所述酚酸類化合物為丹酚酸c。

一種治療急性心肌梗死的藥物制劑，包括上述藥物組合物，還包括藥學上可以接受的載體或賦形劑，制成藥學上可以接受的劑型。

優(yōu)選地，所述藥學上可以接受的載體或賦形劑包括一種或多種固體、半固體或液體輔料。

優(yōu)選地，所述藥學上可以接受的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、丸劑、糖漿劑、散劑、膏劑、液體制劑。

酚酸類化合物在降低丹參酮類化合物對機體毒性方面的應用，所述丹參酮類化合物如式(ⅰ)所示，所述酚酸類化合物含有一個或多個式(ⅱ)所示的取代基；

r為-h或-ch3，r為-h時c3-c4、c5-c6為雙鍵，r為-ch3時c3-c4、c5-c6為單鍵。

優(yōu)選地，所述丹參酮類化合物為丹參酮i，酚酸類化合物為丹參素；或所述丹參酮類化合物為丹參酮iia，酚酸類化合物為丹酚酸b；或所述丹參酮類化合物為二氫丹參酮i，酚酸類化合物為原兒茶醛；或所述丹參酮類化合物為隱丹參酮，酚酸類化合物為丹酚酸c。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明通過將含有特定取代基的酚酸類化合物與特定結(jié)構(gòu)的丹參酮類化合物制備成藥物組合物，該藥物組合物能夠有效縮小急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面積，而且毒副作用低；該組合物中的酚酸類化合物不但可以顯著降低丹參酮類化合物的體內(nèi)外毒副作用，而且還可以增強丹參酮類化合物對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用。

附圖說明

圖1為不同濃度二氫丹參酮i對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(其中，橫坐標是二氫丹參酮i濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖2為4μm二氫丹參酮i輔以不同濃度原兒茶醛對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(橫坐標是原兒茶醛濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖3為不同濃度二氫丹參酮i對大鼠心肌梗死面積的影響(其中，sham代表假手術(shù)，model代表模型組，dt0.1mg/kg、dt0.5mg/kg、dt1mg/kg分別表示二氫丹參酮i的給藥劑量為0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)；

圖4為不同濃度二氫丹參酮i對大鼠心肌梗死面積的影響(其中，橫坐標是圖3所示各組別，縱坐標是梗死面積)；

圖5為0.5mg/kg二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量原兒茶醛對心肌梗死面積的影響；

圖6為二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量原兒茶醛對心肌梗死面積的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是梗死面積)；

圖7為二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量原兒茶醛對ck-mb含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ck-mb的含量)；

圖8為二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量原兒茶醛對ldh含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ldh的含量)；

圖9為二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量原兒茶醛對ctn-i含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ctn-i的含量)；

圖10為不同濃度丹參酮i對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(其中，橫坐標是丹參酮i濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖11為4μm丹參酮i輔以不同濃度丹參素對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(橫坐標是丹參素濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖12為不同濃度丹參酮i對大鼠心肌梗死面積的影響(其中，sham代表假手術(shù)，model代表模型組，ti0.1mg/kg、ti0.5mg/kg、ti1mg/kg分別表示丹參酮i的給藥劑量為0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg，縱坐標是梗死面積)；

圖13為0.5mg/kg丹參酮i聯(lián)合不同劑量丹參素對心肌梗死面積的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是梗死面積)；

圖14為丹參酮i聯(lián)合不同劑量丹參素對ck-mb含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ck-mb的含量)；

圖15為丹參酮i聯(lián)合不同劑量丹參素對ldh含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ldh的含量)；

圖16為丹參酮i聯(lián)合不同劑量丹參素對ctn-i含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ctn-i的含量)；

圖17為不同濃度丹參酮iia對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(其中，橫坐標是丹參酮iia濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖18為8μm丹參酮iia輔以不同濃度丹酚酸b對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(橫坐標是丹酚酸b濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖19為不同濃度丹參酮iia對大鼠心肌梗死面積的影響(其中，sham代表假手術(shù)，model代表模型組，tiia0.5mg/kg、tiia1mg/kg、tiia2mg/kg分別表示丹參酮iia的給藥劑量為0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，縱坐標是梗死面積)；

圖20為1mg/kg丹參酮iia聯(lián)合不同劑量丹酚酸b對心肌梗死面積的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是梗死面積)；

圖21為丹參酮iia聯(lián)合不同劑量丹酚酸b對ck-mb含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ck-mb的含量)；

圖22為丹參酮iia聯(lián)合不同劑量丹酚酸b對ldh含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ldh的含量)；

圖23為丹參酮iia聯(lián)合不同劑量丹酚酸b對ctn-i含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ctn-i的含量)；

圖24為不同濃度隱丹參酮對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(其中，橫坐標是隱丹參酮濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖25為8μm隱丹參酮輔以不同濃度丹酚酸c對乳鼠原代心肌細胞活力的影響(橫坐標是丹酚酸c濃度(mol/l)以2為底取對數(shù)變換后的值，縱坐標是細胞活力)；

圖26為不同濃度隱丹參酮對大鼠心肌梗死面積的影響(其中，sham代表假手術(shù)，model代表模型組，ct0.5mg/kg、ct1mg/kg、ct2mg/kg分別表示隱丹參酮的給藥劑量為0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，縱坐標是梗死面積)；

圖27為1mg/kg隱丹參酮聯(lián)合不同劑量丹酚酸c對心肌梗死面積的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是梗死面積)；

圖28為隱丹參酮聯(lián)合不同劑量丹酚酸c對ck-mb含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ck-mb的含量)；

圖29為隱丹參酮聯(lián)合不同劑量丹酚酸c對ldh含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ldh的含量)；

圖30為隱丹參酮聯(lián)合不同劑量丹酚酸c對ctn-i含量的影響(其中，橫坐標是各組別，縱坐標是ctn-i的含量)；

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖具體介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。

下述實施例中，丹參酮類化合物和酚酸類化合物的縮寫為：丹參酮i，ti；丹參素，dss；丹參酮iia，tiia；丹酚酸b，sab；二氫丹參酮i，dt；原兒茶醛，pca；隱丹參酮，ct；丹酚酸c，sac。

實施例1：原兒茶醛對二氫丹參酮i的減毒作用

1.實驗材料

1.1儀器與設備

超凈臺(thermoscientific1300a2型，美國)；多功能酶標儀fluostaromega(bmglabtech，德國)；電子秤(天津天馬衡基儀器有限公司)；sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)；bl-420s生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；hx-100e小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；hw-1000水浴鍋(成都泰盟科技有限公司)。

1.1試劑

標準品：二氫丹參酮i，原兒茶醛，均購自成都曼思特生物科技有限公司。

試劑：dmem高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、100×青霉素和鏈霉素(thermofisher，美國)；ii型膠原酶(worthington，美國)；5-溴代脫氧尿嘧啶(sigma，美國)；pbs(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；cck8(上海東仁化學科技有限公司)；烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，上海)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，上海)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)(sigma，美國)；dmso(sigma，美國)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司，上海)。

1.2動物來源

sprage-dawley大鼠購置于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號scxk(滬)2013-0016。

2.實驗方法

2.1溶液和藥物配制

烏拉坦：生理鹽水充分溶解烏拉坦，配制成20％溶液，常溫保存。

水合氯醛：生理鹽水充分溶解水合氯醛，配制成3％溶液，常溫保存。

1％2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)：磷酸緩沖鹽溶液充分溶解ttc，配制成1％溶液，避光保存。

二氫丹參酮i、原兒茶醛藥液的配制：細胞給藥：二氫丹參酮i用dmso配制成5mm的母液，原兒茶醛用滅菌水配制成400mm的母液；動物給藥：二氫丹參酮i用dmso配成5mg/ml的母液，用0.5％cmc-na溶液混懸；原兒茶醛直接用0.5％cmc-na溶液溶解。

2.2乳鼠原代心肌細胞提取

(1)實驗準備：

a)出生1～3天的乳大鼠，進超凈臺前酒精擦拭滅菌。

b)用1×pbs(要求高壓滅菌)將ii型膠原酶溶解成0.8mg/ml濃度。先用少量pbs溶解，過濾，再稀釋。

c)高壓滅菌過的預冷1×pbs，加雙抗，倒入p100板，用于心臟取出后放置，后面清洗時也需pbs

d)將滴管，移液管，窄口錐形瓶，手術(shù)器械等高壓滅菌后放入超凈臺紫外殺菌。準備15ml離心管或者玻璃具塞離心管，鼠板紫外滅菌。打開37℃水浴鍋。

(2)解剖取材：

準備兩個培養(yǎng)皿，分別裝入5ml4℃預冷的1×pbs溶液，冰浴，并加入雙抗溶液使終濃度為青霉素100u/ml，鏈霉素100μg/ml。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科直剪沿胸骨劍突左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。左手稍頂，擠出乳鼠的心臟。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的1×pbs中。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。為了保證心肌細胞的活力，取心的操作過程盡量快。

(3)用第二套手術(shù)器械進行下列操作。把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，用眼科彎剪將心臟組織均勻剪成3～5碎塊，放在另一個預先裝好預冷的1×pbs中，將剪好的心臟組織用pbs洗3～5遍，直至血液清洗干凈。

(4)將剪碎心臟轉(zhuǎn)移至窄口錐形瓶中，加入ii型膠原酶5～8ml，37℃水浴鍋勻速搖晃消化3min，第一遍棄去。

(5)第二遍消化的細胞開始收集，一開始可以5min/次，后面可以逐漸減至3min/次，10次左右，收集的細胞放于事先加好培養(yǎng)液的離心管中終止消化，2000rpm，5min。

(6)重懸放入p100板培養(yǎng)。

(7)在培養(yǎng)皿中的細胞待貼壁3h后，下面貼壁的為心肌成纖維細胞。上清中為心肌細胞，計數(shù)種板，六孔板中每孔接種一只乳鼠心臟的細胞量。

(8)細胞貼壁后(24～48h)，可以加入0.1mm的brdu以阻止成纖維細胞增殖，大約能維持1周跳動。

(9)接種后24h，用溫的培養(yǎng)基或平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細胞一次，以除去未貼壁的細胞避免重疊生長，并更換培養(yǎng)液。按照實驗需要可在培養(yǎng)48h或72h后施加處理因素。

2.3二氫丹參酮i細胞毒性以及原兒茶醛減毒作用的體外考察

(1)將接種于六孔板中的乳鼠原代心肌細胞置于10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，于5％co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

(2)用不同濃度二氫丹參酮i(0.1，0.5，1，2，4，8μm)作用24h，而后換液培養(yǎng)1周，1周后每孔加入200μlcck8溶液，混勻后孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。用酶標儀讀取波長450nm處各孔的吸光度(od)值，按下列公式計算細胞存活率。

細胞存活率＝[(as-ab]/(ac-ab)]×100％

as：實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、cck-8、藥物)

ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、cck-8、沒有藥物)

ab：空白孔(不含細胞和藥物的培養(yǎng)基、cck-8)

(3)選取合適的二氫丹參酮i的濃度，與不同濃度原兒茶醛(5，20，40，80，160，320μm)混合作用乳鼠原代心肌細胞24h，而后換液培養(yǎng)1周，1周后每孔加入200μlcck8溶液，混勻后孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。用酶標儀讀取波長450nm處各孔的吸光度(od)值，計算細胞存活率。

2.4大鼠急性心肌梗死模型復制

本實驗采用冠脈左前降支結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死再灌模型[anovelandefficientmodelofcoronaryarteryligationandmyocardialinfarctioninthemouse,circres.2010；107(12):1445-53]。方法為：取健康sd大鼠，體重250-280g，測定大鼠肢導聯(lián)ii導心電圖，取心電圖正常的大鼠進行手術(shù)。設定呼吸機參數(shù)為：呼吸頻率為80次/min，潮氣量為10ml/kg體重，呼吸比為2:1。大鼠采用3％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉后，氣管切開連呼吸機行人工呼吸，開胸并暴露心臟上左冠狀動脈前降支(leftanteriordescending，lad)的結(jié)扎點，于左心耳下緣2mm處用3/8弧3×6無菌帶線眼科縫合針(6-0絲線)穿過心肌淺層，結(jié)扎lad，以心電圖st段明顯上抬且結(jié)扎線以下心肌顏色變暗為心肌缺血標志，結(jié)扎后，關(guān)胸，逐層縫合肋骨、肌肉和皮膚；偽手術(shù)組開胸后，在造模對等位置僅穿線不結(jié)扎。

2.5二氫丹參酮i體內(nèi)給藥劑量考察

設定二氫丹參酮i0.1mg/kg為低劑量、0.5mg/kg為中劑量、1mg/kg為高劑量，于手術(shù)造模前2天灌胃給藥，每組4只，1次/天，共給藥3次，最后一次給藥為術(shù)前30min。再灌后24h測定心肌梗死面積，以確定給藥劑量。

2.6二氫丹參酮i體內(nèi)毒性試驗以及原兒茶醛減毒作用的體內(nèi)考察

分別給予不同濃度的二氫丹參酮i，于手術(shù)造模前2天開始灌胃給藥，每組20只，1次/天，手術(shù)造模后持續(xù)灌胃給藥1周，長期飼養(yǎng)觀察15天，比較其與模型組的死亡率的差異。

選定二氫丹參酮i的濃度，與不同劑量的原兒茶醛混合一起給藥，原兒茶醛的給藥劑量分別為5mg/kg、20mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，于手術(shù)造模前2天開始灌胃給藥，每組20只，1次/天，手術(shù)造模后持續(xù)灌胃給藥1周，長期飼養(yǎng)觀察15天，比較其與單獨給予二氫丹參酮i組的死亡率差異。

2.5心肌梗死面積的測定

大鼠稱重，20％烏拉坦(1g/kg)麻醉，迅速開胸摘取心臟，剪去周圍結(jié)締組織，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸干水分后快速過液氮速凍，心臟組織均勻切為1～2mm的薄片，置于1％ttc染色液中37℃水浴染色10min。經(jīng)ttc染色后，正常心肌組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。用數(shù)碼相機拍攝照片后輸入電腦，用image-proplus6圖像分析軟件計算梗死面積百分比，計算公式為：梗死部分面積/左心室面積×100％。

3.實驗結(jié)果

3.1二氫丹參酮i細胞毒性以及原兒茶醛減毒作用的體外考察

乳鼠原代心肌細胞用二氫丹參酮i處理24h，培養(yǎng)1周后測定其細胞活力，實驗結(jié)果顯示，當二氫丹參酮i的濃度高于2μm時，有一定的細胞毒作用(相比于對照組，p<0.05)，見圖1和表1。在二氫丹參酮i的給藥濃度為4μm時，給以不同濃度的原兒茶醛，當加入原兒茶醛的濃度高于40μm時，可有效逆轉(zhuǎn)二氫丹參酮i導致的細胞死亡(p<0.05)，見圖2和表2。

表1不同濃度二氫丹參酮i對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

表2二氫丹參酮i(4μm)輔以不同濃度原兒茶醛對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

3.2二氫丹參酮i體內(nèi)給藥劑量考察

急性心肌梗死模型中，心臟切片病理染色的差異往往是作為金指標來評價心肌組織的損傷程度，通常采用ttc染色的方法，用圖像處理軟件分析心肌梗死面積。結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血24h后，測定其在不同給藥濃度下的梗死面積。實驗結(jié)果顯示，結(jié)扎冠狀動脈左降支后，模型組出現(xiàn)大面積的缺血區(qū)，與模型組相比，各給藥組用藥后梗死面積均有不同程度的縮小。由圖3-4和表3可知，二氫丹參酮i為0.5mg/kg時具有顯著的藥效，且與1mg/kg的高劑量組無顯著差異。

表3不同濃度二氫丹參酮i對大鼠心肌梗死面積的影響

3.3二氫丹參酮i體內(nèi)毒性試驗以及原兒茶醛減毒作用的體內(nèi)考察

結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血后，術(shù)后一周持續(xù)給藥，長期觀察飼養(yǎng)15天，測定其死亡率。實驗結(jié)果顯示(表4)，二氫丹參酮i的劑量為0.5mg/kg時，其死亡率比模型組略高，差異不明顯；二氫丹參酮i的劑量為1mg/kg時，其死亡率明顯高于模型組和0.5mg/kg劑量組。當給予二氫丹參酮i為0.5mg/kg時，同時給予不同劑量的原兒茶醛可有效降低其死亡率，當給予原兒茶醛的劑量高于80mg/kg時，相比于單獨給予二氫丹參酮i組，其死亡率顯著降低，由此可見，二氫丹參酮i聯(lián)合原兒茶醛可有效降低二氫丹參酮i的毒性致死率。

表4二氫丹參酮i體內(nèi)毒性試驗以及原兒茶醛減毒作用(n＝20)

結(jié)果討論

1、二氫丹參酮i的濃度高于2_μm時，對乳鼠原代心肌細胞具有一定的細胞毒作用，細胞活力明顯降低；二氫丹參酮i的濃度在4_μm的前提下，輔以不同濃度的原兒茶醛可有效逆轉(zhuǎn)二氫丹參酮i導致的細胞死亡。

2、關(guān)于二氫丹參酮i體內(nèi)對心肌梗死大鼠的心梗改善率和毒性致死率

實驗3.2證明，二氫丹參酮i0.5mg/kg可以有效改善心肌梗死大鼠心梗，且與二氫丹參酮i1mg/kg無顯著性差異；實驗3.3表明，二氫丹參酮i1mg/kg對心梗大鼠的毒性致死率顯著高于二氫丹參酮i0.5mg/kg，二氫丹參酮i0.5mg/kg對心梗大鼠的毒性致死率高于模型組。綜合實驗3.2、3.3可知，二氫丹參酮i體內(nèi)具有明顯的致死毒性。

實驗3.3中，給予二氫丹參酮i0.5mg/kg的同時輔以給予不同劑量的原兒茶醛可以有效降低二氫丹參酮i對心梗大鼠的毒性致死率。

本實施例證明：原兒茶醛對二氫丹參酮i的體內(nèi)外毒性具有減毒作用。

實施例2：原兒茶醛與二氫丹參酮i的協(xié)同作用

1.1儀器與設備

多功能酶標儀fluostaromega(bmglabtech，德國)；80-2臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術(shù)器械廠)；5804r型臺式冷凍高速離心機(eppendorf，德國)；sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)電子秤(天津天馬衡基儀器有限公司)；sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)；bl-420s生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；hx-100e小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；hw-1000水浴鍋(成都泰盟科技有限公司)。

1.2試劑

標準品：二氫丹參酮i，原兒茶醛，均購自成都曼思特。

試劑：烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，上海)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，上海)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)(sigma，美國)；肝素鈉(阿拉丁，上海)；dmso(sigma，美國)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司，上海)；肌酸激酶同工酶(ck-mb)試劑盒、乳酸脫氫酶(ldh)試劑盒(建成生物工程研究所，南京)；肌鈣蛋白(ctn-i)elisa試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，武漢)。

1.3動物來源

sprage-dawley大鼠購置于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號scxk(滬)2013-0016。

2.實驗方法

2.1溶液配制

烏拉坦：生理鹽水充分溶解烏拉坦，配制成20％溶液，常溫保存。

水合氯醛：生理鹽水充分溶解水合氯醛，配制成3％溶液，常溫保存。

1％2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)：磷酸緩沖鹽溶液充分溶解ttc，配制成1％溶液，避光保存。

二氫丹參酮i、原兒茶醛藥液的配制：二氫丹參酮i用dmso配成5mg/ml的母液，用0.5％cmc-na溶液混懸；原兒茶醛直接用0.5％cmc-na溶液溶解。

2.2大鼠急性心肌梗死模型復制

本實驗采用冠脈左前降支結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死再灌模型(circres，2010，107(12)：1445-1453)：取健康sd大鼠，體重250-280g，測定大鼠肢導聯(lián)ii導心電圖，取心電圖正常的大鼠進行手術(shù)。設定呼吸機參數(shù)為：呼吸頻率為80次/min，潮氣量為10ml/kg體重，呼吸比為2:1。大鼠采用3％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉后，氣管切開連呼吸機行人工呼吸，開胸并暴露心臟上左冠狀動脈前降支(leftanteriordescending，lad)的結(jié)扎點，于左心耳下緣2mm處用3/8弧3×6無菌帶線眼科縫合針(6-0絲線)穿過心肌淺層，結(jié)扎lad，以心電圖st段明顯上抬且結(jié)扎線以下心肌顏色變暗為心肌缺血標志，結(jié)扎后，關(guān)胸，逐層縫合肋骨、肌肉和皮膚；偽手術(shù)組開胸后，在造模對等位置僅穿線不結(jié)扎。

2.3動物血漿的收集以及心肌梗死面積的測定

大鼠稱重，20％烏拉坦(1g/kg)麻醉，分離左頸總動脈，插管取血，3000rpm離心10min，取上清-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。迅速開胸摘取心臟，剪去周圍結(jié)締組織，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸干水分后快速過液氮速凍，心臟組織均勻切為1～2mm的薄片，置于1％ttc染色液中37℃水浴染色10min。經(jīng)ttc染色后，正常心肌組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。用數(shù)碼相機拍攝照片后輸入電腦，用image-proplus6圖像分析軟件計算梗死面積百分比，計算公式為：梗死部分面積/左心室面積×100％。

2.4動物分組及給藥方法

將心電圖正常的健康雄性sd大鼠隨機分為以下11組：(1)假手術(shù)組：僅開胸，穿線不結(jié)扎，灌胃給予等量生理鹽水；(2)模型組：復制大鼠急性心肌梗死模型，手術(shù)造模前2天給予等量生理鹽水灌胃，1次/天，手術(shù)造模前30min最后一次灌胃等量的生理鹽水；(3)二氫丹參酮i組：同模型組一樣進行手術(shù)，于手術(shù)造模前2天灌胃給予二氫丹參酮i(0.5mg/kg)，1次/天，手術(shù)造模前30min最后一次灌胃；(4)原兒茶醛組：同模型組一樣進行手術(shù)，于手術(shù)造模前2天灌胃給予原兒茶醛，其劑量分別為5mg/kg、20mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，1次/天，手術(shù)造模前30min最后一次灌胃；(5)二氫丹參酮i+原兒茶醛組：同模型組一樣進行手術(shù)，于手術(shù)造模前2天灌胃給予二氫丹參酮i與原兒茶醛混合藥液，二氫丹參酮i的劑量固定為0.5mg/kg，原兒茶醛的劑量分別為5mg/kg、20mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，1次/天，手術(shù)造模前30min最后一次灌胃。

3.實驗結(jié)果

3.1二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量的原兒茶醛對心肌梗死面積的影響

為考察二氫丹參酮i聯(lián)合原兒茶醛的最優(yōu)給藥劑量，造模后24h取心臟，測定梗死面積。實驗結(jié)果顯示，二氫丹參酮i聯(lián)合原兒茶醛給藥時，高劑量的原兒茶醛與二氫丹參酮i存在協(xié)同作用，其藥效優(yōu)于單獨給于該劑量的原兒茶醛或者二氫丹參酮i，但是當原兒茶醛高于80mg/kg時，其協(xié)同的效應減弱(圖5、圖6和表5)。

3.2二氫丹參酮i聯(lián)合不同劑量的原兒茶醛對心肌損傷生化指標的影響

心肌缺血損傷使心肌細胞膜受損，細胞膜通透性升高，心肌細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)如ck-mb、ldh、ctn-i等外漏到細胞間質(zhì)，然后進入淋巴管和心肌微血管，導致它們在血液中的濃度升高。血液心肌酶和肌鈣蛋白水平是反應心肌缺血損傷的重要生化指標，是診斷心肌壞死的生化標志物。

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ck-mb、ldh、ctn-i含量顯著增加，提示造模成功。各給藥組與模型組相比，均有顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i的釋放的作用，其中，二氫丹參酮i組、原兒茶醛給藥劑量為80mg/kg和160mg/kg組以及原兒茶醛在80mg/kg和160mg/kg劑量下聯(lián)合二氫丹參酮i組均能顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i含量，具有心肌保護作用，當原兒茶醛的劑量為80mg/kg時，聯(lián)合二氫丹參酮i給藥組比單獨給予該劑量的二氫丹參酮i或者原兒茶醛降低ck-mb、ldh、ctn-i的作用存在顯著差異(圖7-9和表5)。

表5聯(lián)合給藥對心肌梗死面積(n＝4)和心肌損傷生化指標(n＝3)的影響

本實施例證明：二氫丹參酮i給藥同時輔以不同劑量的原兒茶醛可以明顯提高其對心肌梗死大鼠的治療效果，二者存在藥效協(xié)同作用。

實施例3：丹參素(dss)對丹參酮i(ti)的減毒增效作用

實驗材料和實驗方法同實施例1和實施例2，實驗結(jié)果如下。

1、丹參酮i細胞毒性以及丹參素減毒作用的體外考察

乳鼠原代心肌細胞用丹參酮i處理24h，培養(yǎng)1周后測定其細胞活力，實驗結(jié)果顯示，當?shù)⑼猧的濃度高于2μm時，有一定的細胞毒作用(相比于對照組，p<0.05)，見圖10和表6。在丹參酮i的給藥濃度為4μm時，給以不同濃度的丹參素，當加入丹參素的濃度高于37.5μm時，可有效逆轉(zhuǎn)丹參酮i導致的細胞死亡(p<0.05)，見圖11和表7。

表6不同濃度丹參酮i對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

表7丹參酮i(4μm)輔以不同濃度丹參素對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

2、丹參酮i體內(nèi)給藥劑量考察

急性心肌梗死模型中，心臟切片病理染色的差異往往是作為金指標來評價心肌組織的損傷程度，通常采用ttc染色的方法，用圖像處理軟件分析心肌梗死面積。結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血24h后，測定其在不同給藥濃度下的梗死面積。實驗結(jié)果顯示，結(jié)扎冠狀動脈左降支后，模型組出現(xiàn)大面積的缺血區(qū)，與模型組相比，各給藥組用藥后梗死面積均有不同程度的縮小。由圖12和表8可知，丹參酮i為0.5mg/kg時具有顯著的藥效，且與1mg/kg的高劑量組無顯著差異。

表8不同濃度丹參酮i對大鼠心肌梗死面積的影響

3、丹參酮i體內(nèi)毒性試驗以及丹參素減毒作用的體內(nèi)考察

結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血后，術(shù)后一周持續(xù)給藥，長期觀察飼養(yǎng)15天，測定其死亡率。實驗結(jié)果顯示(表9)，丹參酮i的劑量為0.5mg/kg時，其死亡率比模型組相同，但是1-5天死亡率較高；丹參酮i的劑量為1mg/kg時，其死亡率明顯高于模型組和0.5mg/kg劑量組。當給予丹參酮i為0.5mg/kg時，同時給予不同劑量的丹參素可有效降低其死亡率，當給予丹參素的劑量高于100mg/kg時，相比于單獨給予丹參酮i組，其死亡率顯著降低，由此可見，丹參素可有效降低丹參酮i的毒性致死率。

表9丹參酮i體內(nèi)毒性試驗以及丹參素減毒作用(n＝20)

4、丹參素與丹參酮i的協(xié)同作用

4.1丹參酮i聯(lián)合不同劑量的丹參素對心肌梗死面積的影響

實驗結(jié)果顯示，丹參酮i聯(lián)合丹參素給藥時，丹參素與丹參酮i存在協(xié)同作用，其藥效優(yōu)于單獨給于該劑量的丹參素或者丹參酮i(圖13和表10)。

4.2丹參酮i聯(lián)合不同劑量的丹參素對心肌損傷生化指標的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ck-mb、ldh、ctn-i含量顯著增加，提示造模成功。各給藥組與模型組相比，均有顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i的釋放的作用，其中，丹參酮i組、丹參素給藥劑量為100mg/kg和200mg/kg組以及丹參素在100mg/kg和200mg/kg劑量下聯(lián)合丹參酮i組均能顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i含量，具有心肌保護作用，且聯(lián)合給藥的保護作用強于單獨給藥各自的保護作用(圖14-16和表10)。

表10聯(lián)合給藥對心肌梗死面積(n＝4)和心肌損傷生化指標(n＝3)的影響

實施例4：丹酚酸b(sab)對丹參酮iia(tiia)的減毒增效作用

實驗材料和實驗方法同實施例1和實施例2，實驗結(jié)果如下。

1、丹參酮iia細胞毒性以及丹酚酸b減毒作用的體外考察

乳鼠原代心肌細胞用丹參酮iia處理24h，培養(yǎng)1周后測定其細胞活力，實驗結(jié)果顯示，當?shù)⑼猧ia的濃度高于4μm時，有一定的細胞毒作用(相比于對照組，p<0.05)，見圖17和表11。在丹參酮iia的給藥濃度為8μm時，給以不同濃度的丹酚酸b，當加入丹酚酸b的濃度高于25μm時可有效逆轉(zhuǎn)丹參酮iia導致的細胞死亡(p<0.05)，見圖18和表12。

表11不同濃度丹參酮iia對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

表12丹參酮iia(8μm)輔以不同濃度丹酚酸b對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

2、丹參酮iia體內(nèi)給藥劑量考察

急性心肌梗死模型中，心臟切片病理染色的差異往往是作為金指標來評價心肌組織的損傷程度，通常采用ttc染色的方法，用圖像處理軟件分析心肌梗死面積。結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血24h后，測定其在不同給藥濃度下的梗死面積。實驗結(jié)果顯示，結(jié)扎冠狀動脈左降支后，模型組出現(xiàn)大面積的缺血區(qū)，與模型組相比，各給藥組用藥后梗死面積均有不同程度的縮小。由圖19和表13可知，丹參酮iia為1mg/kg時具有顯著的藥效，且與2mg/kg的高劑量組無顯著差異。

表13不同濃度丹參酮iia對大鼠心肌梗死面積的影響

3、丹參酮iia體內(nèi)毒性試驗以及丹酚酸b減毒作用的體內(nèi)考察

結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血后，術(shù)后一周持續(xù)給藥，長期觀察飼養(yǎng)15天，測定其死亡率。實驗結(jié)果顯示(表14)，丹參酮iia的劑量為1mg/kg時，其死亡率比模型組相同，但是1-5天死亡率較高；丹參酮iia的劑量為2mg/kg時，其死亡率明顯高于模型組和1mg/kg劑量組。當給予丹參酮iia為1mg/kg時，同時給予不同劑量的丹酚酸b可有效降低其死亡率，當給予丹酚酸b的劑量高于100mg/kg時，相比于單獨給予丹參酮iia組，其死亡率顯著降低，由此可見，丹酚酸b可有效降低丹參酮iia的毒性致死率。

表14丹參酮iia體內(nèi)毒性試驗以及丹酚酸b減毒作用(n＝20)

4、丹酚酸b與丹參酮iia的協(xié)同作用

4.1丹參酮iia聯(lián)合不同劑量的丹酚酸b對心肌梗死面積的影響

實驗結(jié)果顯示，丹參酮iia聯(lián)合丹酚酸b給藥時，丹酚酸b與丹參酮iia存在協(xié)同作用，其藥效優(yōu)于單獨給于該劑量的丹酚酸b或者丹參酮iia(圖20和表15)。

4.2丹參酮iia聯(lián)合不同劑量的丹酚酸b對心肌損傷生化指標的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ck-mb、ldh、ctn-i含量顯著增加，提示造模成功。各給藥組與模型組相比，均有顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i的釋放的作用，其中，丹參酮iia組、丹酚酸b給藥劑量為100mg/kg和200mg/kg組以及丹酚酸b在100mg/kg和200mg/kg劑量下聯(lián)合丹參酮iia組均能顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i含量，具有心肌保護作用，且聯(lián)合給藥的保護作用強于單獨給藥各自的保護作用(圖21-23和表15)。

表15聯(lián)合給藥對心肌梗死面積(n＝4)和心肌損傷生化指標(n＝3)的影響

實施例5：丹酚酸c對隱丹參酮的減毒增效作用

實驗材料和實驗方法同實施例1和實施例2，實驗結(jié)果如下。

1、隱丹參酮細胞毒性以及丹酚酸c減毒作用的體外考察

乳鼠原代心肌細胞用隱丹參酮處理24h，培養(yǎng)1周后測定其細胞活力，實驗結(jié)果顯示，當隱丹參酮的濃度高于4μm時，有一定的細胞毒作用(相比于對照組，p<0.05)，見圖24和表16。在隱丹參酮的給藥濃度為8μm時，給以不同濃度的丹酚酸c，當加入丹酚酸c的濃度高于45μm時，可有效逆轉(zhuǎn)隱丹參酮導致的細胞死亡(p<0.05)，見圖25和表17。

表16不同濃度隱丹參酮對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

表17隱丹參酮(8μm)輔以不同濃度丹酚酸c對乳鼠原代心肌細胞活力的影響

2、隱丹參酮體內(nèi)給藥劑量考察

急性心肌梗死模型中，心臟切片病理染色的差異往往是作為金指標來評價心肌組織的損傷程度，通常采用ttc染色的方法，用圖像處理軟件分析心肌梗死面積。結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血24h后，測定其在不同給藥濃度下的梗死面積。實驗結(jié)果顯示，結(jié)扎冠狀動脈左降支后，模型組出現(xiàn)大面積的缺血區(qū)，與模型組相比，各給藥組用藥后梗死面積均有不同程度的縮小。由圖26和表18可知，隱丹參酮為1mg/kg時具有顯著的藥效，且與2mg/kg的高劑量組無顯著差異。

表18不同濃度隱丹參酮對大鼠心肌梗死面積的影響

3、隱丹參酮體內(nèi)毒性試驗以及丹酚酸c減毒作用的體內(nèi)考察

結(jié)扎大鼠冠脈左前降支造成心肌缺血后，術(shù)后一周持續(xù)給藥，長期觀察飼養(yǎng)15天，測定其死亡率。實驗結(jié)果顯示(表4)，隱丹參酮的劑量為1mg/kg時，其死亡率比模型組略高，但差異不明顯；隱丹參酮的劑量為2mg/kg時，其死亡率明顯高于模型組和1mg/kg劑量組。當給予隱丹參酮為1mg/kg時，同時給予不同劑量的丹酚酸c可有效降低其死亡率，當給予丹酚酸c的劑量高于100mg/kg時，相比于單獨給予隱丹參酮組，其死亡率顯著降低，由此可見，丹酚酸c可有效降低隱丹參酮的毒性致死率。

表19隱丹參酮體內(nèi)毒性試驗以及丹酚酸c減毒作用(n＝20)

4、丹酚酸c與隱丹參酮的協(xié)同作用

4.1隱丹參酮聯(lián)合不同劑量的丹酚酸c對心肌梗死面積的影響

實驗結(jié)果顯示，隱丹參酮聯(lián)合丹酚酸c給藥時，丹酚酸c與隱丹參酮存在協(xié)同作用，其藥效優(yōu)于單獨給于該劑量的丹酚酸c或者隱丹參酮(圖27和表20)。

4.2隱丹參酮聯(lián)合不同劑量的丹酚酸c對心肌損傷生化指標的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ck-mb、ldh、ctn-i含量顯著增加，提示造模成功。各給藥組與模型組相比，均有顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i的釋放的作用，其中，隱丹參酮組、丹酚酸c給藥劑量為100mg/kg和200mg/kg組以及丹酚酸c在100mg/kg和200mg/kg劑量下聯(lián)合隱丹參酮組均能顯著降低ck-mb、ldh、ctn-i含量，具有心肌保護作用，且聯(lián)合給藥的保護作用強于單獨給藥各自的保護作用(圖28-30和表20)。

表20聯(lián)合給藥對心肌梗死面積(n＝4)和心肌損傷生化指標(n＝3)的影響

上述試驗證明，聯(lián)合使用丹參酮i和丹參素或丹參酮iia和丹酚酸b或二氫丹參酮i和原兒茶醛或隱丹參酮和丹酚酸c治療急性心肌梗死具有意料不到的技術(shù)效果，這種技術(shù)效果是本領域技術(shù)人員預料不到的，可以以丹參酮i和丹參素或丹參酮iia和丹酚酸b或二氫丹參酮i和原兒茶醛或隱丹參酮和丹酚酸c為活性成分制備用于治療急性心肌梗死的藥物，藥效優(yōu)異且毒性低。本領域技術(shù)人員可以制成治療急性心肌梗死的藥物制劑，包括上述活性成分，還包括藥學上可以接受的載體或賦形劑，制成藥學上可以接受的劑型。丹參酮類化合物水溶性較差，而酚酸類化合物水溶性較好，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在制備上述組合物時添加適量的枸櫞酸可以顯著增加丹參酮類化合物的水溶性，使其在水中易溶(上述丹參酮和丹酚酸類化合物在質(zhì)量體積濃度0.2-5％的枸櫞酸水溶液中可以達到易溶)，降低水性制劑的制備難度。藥學上可以接受的載體或賦形劑包括一種或多種固體、半固體或液體輔料，藥學上可以接受的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、丸劑、糖漿劑、散劑、膏劑、液體制劑。