本發(fā)明涉及甜菜堿的應(yīng)用，特別涉及甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途。

背景技術(shù)：

肺動(dòng)脈高壓(pulmonaryarterialhypertension，pah)是一組由異源性疾病和不同發(fā)病機(jī)制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加，并導(dǎo)致右心室衰竭及死亡為特征的肺血管重構(gòu)性疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率，被認(rèn)為是“假惡性腫瘤”。炎癥反應(yīng)引起的肺血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞增殖和肺血管重構(gòu)、肺動(dòng)脈閉塞被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制及病理改變的主要特征。由于肺血管阻力的增加和右心室后負(fù)荷的增高，引起右心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致右心室衰竭。隨著對(duì)肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)研究的深入，以及新型藥物的臨床應(yīng)用，肺動(dòng)脈高壓患者的預(yù)后己有所改觀，但長(zhǎng)期有效性有限，5年存活率僅為49％。因此，尋找具有抑制甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)、抑制細(xì)胞增殖、針對(duì)右心室功能且價(jià)格低廉的藥物，將有助于臨床的早期干預(yù)與治療，具有深遠(yuǎn)的研究意義。

枸杞(lyciumbarbaruml)是寧夏特色回藥材和重要的藥食兩用的名貴資源，有中國(guó)西北“紅金子”之美譽(yù)。其性味甘、微溫，歸肝、腎、肺經(jīng)，功能滋補(bǔ)肝腎、明目、潤(rùn)肺，主治肝腎虧虛，頭暈?zāi)垦?，目視不清，虛勞咳嗽、消渴引飲等證。甜菜堿(betaine)又名三甲基甘氨酸，是從枸杞中首次分離得到的一種氨基酸衍生物，安全性高，屬于實(shí)際無(wú)毒類藥物。國(guó)內(nèi)外研究表明甜菜堿能促進(jìn)脂肪代謝，降低體內(nèi)高半胱氨酸；具有抗脂肪肝、保護(hù)腎臟、降血壓、抗腫瘤、緩和應(yīng)激等藥理作用，但關(guān)于其對(duì)肺動(dòng)脈高壓抑制作用目前鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)甜菜堿的藥理作用研究，提供甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓的藥物的用途。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的：

本發(fā)明提供甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，所述甜菜堿的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

具體地，所述肺動(dòng)脈高壓為大鼠腹部皮下一次性注射野百合堿50mg/kg21天后誘導(dǎo)形成的肺動(dòng)脈高壓。

進(jìn)一步地，所述甜菜堿單次應(yīng)用劑量為100～400mg/kg.

優(yōu)選地，所述甜菜堿單次應(yīng)用劑量為200～400mg/kg。

優(yōu)選地，所述甜菜堿單次應(yīng)用劑量為300～400mg/kg。

優(yōu)選地，所述甜菜堿單次應(yīng)用劑量為400mg/kg。

具體地，所述甜菜堿單次應(yīng)用劑量為不引起中樞抑制的劑量。

具體地，所述藥物的劑型為藥劑學(xué)上允許的口服劑型或注射劑型。

本發(fā)明提供的甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途具有以下有益效果：

(1)甜菜堿能顯著降低平均肺動(dòng)脈壓和右心室收縮壓、減少右心肥厚指數(shù)和肺中小動(dòng)脈重構(gòu)；

(2)甜菜堿能抑制炎癥作用，顯著抑制了肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中nf-κb、tnf-α、il-1β蛋白的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甜菜堿具有治療肺動(dòng)脈高壓作用，可用于制備肺動(dòng)脈高壓的治療藥物。

附圖說(shuō)明

圖1：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠平均肺動(dòng)脈壓(mpap)圖；

圖2：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室收縮壓(rvsp)圖；圖3：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠右心肥厚指數(shù)(rvhi)圖；

圖4：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠管壁厚度百分比(wt％)圖；

圖5：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠管壁面積百分比(wa％)圖；

圖6：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織病理變化影響的he染色圖(×400)；

圖7：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室心尖組織病理變化影響的he染色圖(×400)；

圖8：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌細(xì)胞直徑(ad)圖；

圖9：甜菜堿顯著降低肺動(dòng)脈高壓大鼠心肌細(xì)胞核密度(mnd)圖；

圖10：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織膠原纖維變化影響的masson染色圖(×400)；

圖11：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中mcp-1表達(dá)的影響免疫組化圖(×400)；

圖12：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中et-1表達(dá)的影響免疫組化圖(×400)；

圖13：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中nf-κb蛋白表達(dá)水平的影響(與正常組比較：^##p<0.01，與模型組比較：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

圖14：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中tnf-α蛋白表達(dá)水平的影響(與正常組比較：^##p<0.01，與模型組比較：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

圖15：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中il-1β蛋白表達(dá)水平的影響(與正常組比較：^##p<0.01，與模型組比較：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，實(shí)施例中所用的甜菜堿均為前述的式(1)所示的化合物。

實(shí)施例1

甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，其中，甜菜堿單次應(yīng)用劑量為大鼠100mg/kg，藥物的劑型為溶液劑型。

實(shí)施例2

甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，其中，甜菜堿單次應(yīng)用劑量為大鼠200mg/kg，藥物的劑型為粉針劑型。

實(shí)施例3

甜菜堿作為治療肺動(dòng)脈高壓藥物的用途，其中，甜菜堿單次應(yīng)用劑量為大鼠400mg/kg，藥物的劑型為粉針劑型。

下面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明了上述實(shí)施例1至3的效果：

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物處理

成年雄性sd大鼠，260-300g，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：ncxk(寧)2016-0005。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來(lái)水，室溫保持在(24±2)℃，濕度50-60％，每日光照與黑暗時(shí)間各12h。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

甜菜堿(美國(guó)sigma公司)，以生理鹽水配制，濃度分別為100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。masson染色液(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，兔抗nf-κb、tnf-α、il-1β、mcp-1、et-1多克隆抗體(購(gòu)自abcam公司)，酶標(biāo)儀(1510，thermofisher公司)，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(powerpacbasic,美國(guó)bio-rad公司)，凝膠成像分析儀(js-860b,上海培清公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

sd大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物西地那非組、甜菜堿不同劑量組。正常對(duì)照組腹部皮下注射生理鹽水，其余各組大鼠在腹部皮下一次性注射野百合堿50mg/kg，造模后的第22天開(kāi)始按100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg劑量每天灌胃給藥。正常對(duì)照組和模型組同法給予等量的生理鹽水。在連續(xù)給藥后的第22天進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)、組織病理與形態(tài)學(xué)改變、分子生物學(xué)表達(dá)變化等藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

1.4sd大鼠肺動(dòng)脈高壓(pah)模型建立

稱取野百合堿后置于15ml離心管中，用hcl(1mol/l)溶解后在用naoh(1mol/l)調(diào)節(jié)ph值至7.0～7.2，然后用蒸餾水補(bǔ)齊體積。取280g左右的大鼠，一次性腹部皮下注射野百合堿50mg/kg，選擇腹部皮下注射方式是據(jù)文獻(xiàn)記載：腹部皮下注射可形成典型的“炎性”肺動(dòng)脈高壓。注射后正常飼養(yǎng)，飲食自由，在第三周形成肺動(dòng)脈高壓。

二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

(一)血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定

1.1實(shí)驗(yàn)方法：

實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥24h后，烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，分離右頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在近心端傾斜45°剪一小口，將與壓力換能器相連接并充滿肝素的大鼠專用右心導(dǎo)管插入右頸外靜脈，左旋并向前推進(jìn)進(jìn)入右心室，記錄右心室收縮壓(rvsp)，轉(zhuǎn)向肺動(dòng)脈，記錄平均肺動(dòng)脈壓(mpap)。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖1,2可以看出在注射野百合堿后的第42天，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠平均肺動(dòng)脈壓和右心室收縮壓顯著上升(p＜0.01)。與模型組相比，給予甜菜堿治療的大鼠平均肺動(dòng)脈壓和右心室收縮壓顯著降低(p＜0.01，p＜0.05)。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(二)右心肥厚指數(shù)檢測(cè)

2.1實(shí)驗(yàn)方法

大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)束后，打開(kāi)胸腔，將連接灌注裝置的針頭經(jīng)右心室插入至肺動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗肺。取出心臟，分離右心室、左心室加室間隔，分別稱重，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(rvhi)＝右心室(rv)/左心室+室間隔(lv+s)。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖3可以看出在注射野百合堿后的第42天，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠右心肥厚指數(shù)顯著上升(p＜0.01)。與模型組相比，給予甜菜堿治療的大鼠右心肥厚指數(shù)顯著降低(p＜0.01，p＜0.05)，右心室重構(gòu)得到改善。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(三)肺中小動(dòng)脈重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè)

3.1實(shí)驗(yàn)方法

取右下肺，10％甲醛固定48h，常規(guī)石蠟包埋，取5um厚連續(xù)切片，伊紅-蘇木素(he)染色，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下檢查并照相。隨機(jī)選取管徑在50-100um肺小動(dòng)脈各10根，用顯微鏡進(jìn)行攝片，image-proplus圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算肺小動(dòng)脈管壁厚度(wallthickness,wt)占管徑的百分比wt％、管壁面積(wallarea,wa)占血管總面積的百分比wa％，將wt％和wa％作為肺血管重構(gòu)的指標(biāo)。

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4,5可以看出在注射野百合堿后的第42天，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠肺小動(dòng)脈管壁厚度占管徑的百分比wt％、管壁面積占血管總面積的百分比wa％顯著上升(p＜0.01)。與模型組相比，給予甜菜堿治療的大鼠肺小動(dòng)脈管壁厚度占管徑的百分比wt％、管壁面積占血管總面積的百分比wa％顯著降低(p＜0.01，p＜0.05)，肺中小動(dòng)脈重構(gòu)得到改善。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(四)肺組織病理變化he染色圖

4.1實(shí)驗(yàn)方法

取右下肺，10％甲醛固定48h，梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟2小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，取5um厚連續(xù)切片，伊紅-蘇木素(he)染色，

4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6可以看出在光鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)扁平，細(xì)胞分布較均勻，血管腔完整，肺泡腔內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落，血管平滑肌細(xì)胞明顯增生、肥大，管腔不規(guī)則增厚，管腔狹窄，甚至閉塞，血管腔內(nèi)殘留有大量紅細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組大鼠肺動(dòng)脈管腔增厚厚度介于對(duì)照組及模型組之間，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，血管平滑肌細(xì)胞亦出現(xiàn)增生，但輕于模型組，肺泡腔內(nèi)亦可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較輕。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(五)右心室病理變化he染色圖

5.1實(shí)驗(yàn)方法

取右心室心尖組織，10％甲醛固定48h，梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟2小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，取5um厚連續(xù)切片，伊紅-蘇木素(he)染色。

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7結(jié)果表明在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞連續(xù)性好且細(xì)胞間隙較?。煌瑢?duì)照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞明顯排列明顯紊亂，心肌細(xì)胞明顯肥大，心肌細(xì)胞之間間隙變窄，同解剖時(shí)與肉眼觀察右心室肥厚情況相符。而西地那非和甜菜堿治療后的大鼠心肌細(xì)胞直徑普遍減小，心肌細(xì)胞排列也稍顯整齊。反映出甜菜堿治療后出現(xiàn)明顯緩解心肌細(xì)胞肥大、右室肥厚、右室重構(gòu)的效果。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(六)甜菜堿對(duì)右心室心肌細(xì)胞的影響

6.1實(shí)驗(yàn)方法

取右心室心尖組織，10％甲醛固定48h，梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟2小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，取5um厚連續(xù)切片，伊紅-蘇木素(he)染色。image-proplus圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算心肌細(xì)胞直徑(ad)、心肌細(xì)胞核密度(mnd)，將ad和mnd作為肺血管重構(gòu)的指標(biāo)。

6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖8,9.甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室心肌細(xì)胞直徑和心肌細(xì)胞核密度的影響。

通過(guò)測(cè)量比較發(fā)現(xiàn)，mct組大鼠心肌細(xì)胞平均直徑(ad)和心肌細(xì)胞核密度(mnd)明顯高于對(duì)照組大鼠，而tet組大鼠也表現(xiàn)出也肌細(xì)胞直徑(ad)變小，也肌細(xì)胞核密度(mnd)降低，反映出甜菜堿治療后能明顯緩解心肌細(xì)胞肥大、右室肥厚、右室重構(gòu)的效果，而測(cè)量結(jié)果同樣說(shuō)明其產(chǎn)生的效果類似于西地那非治療。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(七)肺組織masson染色圖

7.1實(shí)驗(yàn)方法

取右下肺組織，10％甲醛固定48h，梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟2小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，取5um厚連續(xù)切片，行masson染色。

7.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖10：甜菜堿對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織膠原纖維變化影響的masson染色圖(×400)。

對(duì)照組大鼠肺組織切片masson染色可見(jiàn)中小動(dòng)脈血管壁膠原纖維結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，模型組大鼠中小動(dòng)脈血管壁及周圍組織則見(jiàn)到大量膠原纖維增殖，結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡明顯萎縮甚至堵塞，甜菜堿治療組大鼠肺組織情況較模型組有明顯改善，膠原纖維增生減少，肺泡結(jié)構(gòu)也較清晰，同西地那非組大鼠情況相近。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(八)肺組織免疫組化實(shí)驗(yàn)

8.1實(shí)驗(yàn)方法

取右下肺組織，10％甲醛固定48h，梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟2小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，取5um厚連續(xù)切片，按步驟進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，一抗?jié)舛葹閙cp-1(1:200)，et-1(1:1000)。

8.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖11,12可以看出，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中mcp-1，et-1表達(dá)顯著增加，而給予甜菜堿治療以后大鼠肺組織中mcp-1，et-1表達(dá)降低，結(jié)果與西地那非組相似。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

(九)肺組織westernblot實(shí)驗(yàn)

9.1實(shí)驗(yàn)方法

取適量?jī)龃娣谓M織，經(jīng)液氮研磨后，加入全組織蛋白抽提液提取組織蛋白，測(cè)定蛋白含量，并統(tǒng)一稀釋后在沸水中煮10min，室溫冷卻后，-82℃冰箱保存?zhèn)溆?；根?jù)待測(cè)蛋白分子的大小制備適宜濃度的sds凝膠，加入蛋白樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)志物，電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)印蛋白于硝酸纖維素膜。

載有蛋白的硝酸纖維素膜經(jīng)5％脫脂牛奶封閉后，加入nf-κb，tnf-α，il-1β及內(nèi)參照β-actin等一抗4℃過(guò)夜，經(jīng)pbs換洗后，加相應(yīng)二抗孵育，再經(jīng)pbs換洗后曝光，測(cè)定各蛋白條帶光密度值并計(jì)算相應(yīng)的光密度比值。

9.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖13,14,15可以看出，與正常對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠肺組織中nf-κb，tnf-α，il-1β的蛋白表達(dá)量顯著上升(p＜0.01)，而進(jìn)行甜菜堿治療組大鼠肺組織中nf-κb，tnf-α，il-1β的蛋白表達(dá)量顯著降低(p＜0.01)。提示甜菜堿(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。