本發(fā)明涉及中藥材技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中藥組合物、其制備方法及其用途，具體而言，涉及一種從杜仲葉中提取的綠原酸有效部位，以及從梔子中提取的京尼平苷和西紅花苷有效部位所制備的組合物，及其組合物在制備減肥藥，以及減肥保健食品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

杜仲葉為杜仲科植物杜仲eucommiaulmoidesoliv的干燥葉。研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉水提物可減肥調(diào)脂，降低動(dòng)物體重，抑制甘油三酯在脂肪細(xì)胞積聚；對(duì)高脂小鼠血清膽固醇(tc)和甘油三酯(tg)降低作用明顯，且升高血清高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)；對(duì)喂食高脂飲食倉鼠具有降低血漿tg、游離脂肪酸(ffa)、tc、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)和肝臟膽固醇的水平，升高血漿hdl-c與tc的比值，以及載脂蛋白-a1(apo-a1)的水平，主要是通過改變肝臟中的脂肪生成、脂肪酸β氧化水平及膽固醇代謝來實(shí)現(xiàn)的。杜仲葉乙醇提取物具有降低血脂含量與調(diào)節(jié)機(jī)體血脂代謝的作用，杜仲葉甲醇提取物具有抗肥胖的作用，如降低體重、白色脂肪組織重量、血漿tg和tc的水平。

梔子，學(xué)名：gardeniajasminoidesellis，別名：黃梔子、山梔、白蟾，是茜草科植物梔子的果實(shí)。梔子的果實(shí)是傳統(tǒng)中藥，屬衛(wèi)生部頒布的第1批藥食兩用資源，具有護(hù)肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用。在中醫(yī)臨床常用于治療黃疸型肝炎、高血壓、糖尿病等癥。梔子有效組分主要為西紅花苷和京尼平苷等。藥理研究表明，梔子可產(chǎn)生抗氧化、抑制血小板聚集，調(diào)節(jié)血脂水平防止動(dòng)脈粥樣硬化及減肥等功效。提示梔子有效成分在減肥調(diào)脂方面具有較高的研究開發(fā)價(jià)值。

肥胖癥是一組常見的代謝癥群。當(dāng)人體進(jìn)食熱量多于消耗熱量時(shí)，多余熱量以脂肪形式儲(chǔ)存于體內(nèi)，其量超過正常生理需要量，且達(dá)一定值時(shí)遂演變?yōu)榉逝职Y。誘使肥胖的外因以飲食過多而活動(dòng)過少為主，內(nèi)因?yàn)橹敬x紊亂。肥胖癥的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，包括遺傳因素、神經(jīng)精神因素、內(nèi)分泌因素、褐色脂肪組織異常等。目前批準(zhǔn)上市的減肥藥主要以化學(xué)類為主，雖然安全性較高，但在復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)類似的受體都有一定的作用，從而引起不可避免的相應(yīng)副作用。

雖然現(xiàn)有技術(shù)披露有關(guān)于綠原酸和京尼平苷減肥作用的研究，但是，沒有揭示杜仲葉提取物與梔子提取物聯(lián)用對(duì)減肥的作用。且由于中藥成分復(fù)雜，想以傳統(tǒng)中藥來達(dá)到理想的減肥效果，仍是技術(shù)研發(fā)人員需要解決的課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)沒有披露杜仲提取物與梔子提取物組合制備減肥藥的問題，提供一種從杜仲葉中提取的綠原酸有效部位，以及從梔子中提取的京尼平苷和西紅花苷有效部位所制備的組合物。

本發(fā)明提供一種中藥組合物，包括杜仲葉提取物和梔子提取物，其中杜仲葉提取物的重量是梔子提取物重量的1/4～4倍。

進(jìn)一步的，所述杜仲葉提取物和梔子提取物的重量比為1。

作為優(yōu)選的，所述杜仲葉提取物包括綠原酸，所述梔子提取物包括京尼平苷和西紅花苷。

本發(fā)明的工作原理及有益效果，本發(fā)明選用我國藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材杜仲葉和梔子為研究對(duì)象，將杜仲葉提取物和梔子提取物按照一定比例混合，使組合物中含有綠原酸、京尼平苷和西紅花苷的有效部位。制備的中藥組合物中的有效成分相互協(xié)同，相互促進(jìn)，具有明顯的抗炎、調(diào)脂減肥作用，同時(shí)能激活膽汁酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的表達(dá)，且組方效果優(yōu)于其中的單一提取物，并且無明顯的毒副反應(yīng)和藥物耐受性。

一種中藥組合物的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、備料：分別稱取杜仲葉和梔子，分別干燥粉碎，得到杜仲葉粉末和梔子粉末；

步驟二、浸提：采用重量比為杜仲葉粉末8～10倍的60％乙醇對(duì)杜仲葉粉末浸提2～4次，每次6-10小時(shí)后過濾得到杜仲葉浸提液，采用重量比為梔子粉末8～10倍的60％乙醇對(duì)梔子粉末浸提2～4次，每次6～10小時(shí)后過濾得到梔子浸提液；

步驟三、純化：分別將杜仲葉浸提液和梔子浸提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用大孔樹脂分別對(duì)杜仲葉浸提液和梔子浸提液分離純化，得到杜仲葉純化液和梔子純化液；

步驟四、洗脫：采用5％-60％的乙醇溶液對(duì)杜仲葉純化液和梔子純化液分別進(jìn)行梯度洗脫，將梔子中主要含京尼平苷及西紅花苷的兩部分的洗脫液進(jìn)行合并得到梔子洗脫液，將杜仲葉中綠原酸部分進(jìn)行收集合并得到杜仲葉洗脫液；

步驟五、濃縮干燥：對(duì)杜仲葉洗脫液和梔子洗脫液分別減壓濃縮至浸膏，分別冷凍干燥得到杜仲葉提取物和梔子提取物；

步驟六、混合：將杜仲葉提取物和梔子提取物按照上述比例混合得到中藥組合物。

進(jìn)一步的，所述步驟二中，浸提的次數(shù)為3次。浸提3次成分含量最高，3次以后浸提液色明顯變淺，點(diǎn)板薄層層析目標(biāo)產(chǎn)物色淺。

進(jìn)一步的，所述步驟二中，浸提的時(shí)間為8小時(shí)。8小時(shí)的浸提時(shí)間為最佳時(shí)間，浸提8小時(shí)有效成分能夠充分出來，且能夠較好的控制酒精濃度，若時(shí)間太長則酒精揮發(fā)不利于提取。

本發(fā)明的制備方法的優(yōu)點(diǎn)：本實(shí)驗(yàn)對(duì)杜仲葉及梔子通過60％乙醇溶液冷浸進(jìn)行充分提取，粗提液中主要活性成分提取率較高且雜質(zhì)少易處理。使用大孔樹脂對(duì)提取液進(jìn)行分離純化，不同濃度乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫分離，薄層色譜檢識(shí)分離度及純度發(fā)現(xiàn)兩種型號(hào)樹脂對(duì)各自藥材中不同組分吸附能力強(qiáng)、分離度高、易解吸，能得到純度較高的提取物；采用uplc(超高效液相色譜)及uv(紫外線濾光鏡)分別對(duì)分離純化樣品進(jìn)行含量測(cè)定，精確測(cè)定各自含量：ge含52.5％京尼平苷、10.5％西紅花苷總苷；ee綠原酸含量為52.3％。采用hplc-ms/ms質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立的杜仲葉及梔子提取物測(cè)定方法，初步判斷杜仲葉提取物中主要成分為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷，梔子提取物中主要成分為京尼平苷、西紅花苷-1、西紅花苷-2、京尼平龍膽二糖苷。此方法能高效、準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)其化學(xué)成分，在杜仲葉及梔子相關(guān)研究及質(zhì)量控制方面是一個(gè)可行的方法。

進(jìn)一步的，所述的組合物在制備減肥藥物或者制備減肥食品中的用途。

一種非治療目的減肥方法，包括口服中藥組合物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的中藥組合物對(duì)小鼠血清中血清膽固醇tg含量影響的曲線圖；

圖2為本發(fā)明的中藥組合物對(duì)小鼠血清中甘油三酯tc含量影響的曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方法進(jìn)行詳細(xì)介紹：

梔子提取物分離

(1)浸提部分：

取風(fēng)干后的梔子樣品粉碎，以10倍質(zhì)量55％的乙醇溶液冷浸提取3次，每次8h，過濾，合并提取液，減壓抽濾去除雜質(zhì)后，保留上清液體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，即得上樣液。

(2)大孔吸附樹脂分離：

1)預(yù)處理：因大孔吸附樹脂在生產(chǎn)過程中會(huì)混雜入未形成聚合物的單體、分散劑、致孔劑、惰性溶劑，故需對(duì)樹脂進(jìn)行預(yù)處理。hpd100大孔吸附樹脂經(jīng)乙醇浸泡24h，后經(jīng)乙醇洗至流出液不渾濁，再用蒸餾水洗脫除去雜質(zhì)直至流出液無醇味，用5％鹽酸溶液通過樹脂柱，浸泡2-4h，再用水洗至中性，備用。

2)裝樣：將樣品溶于純凈水中，制得上樣液，以一定的流速緩慢加注到柱的上端開始吸附。

3)洗脫：先用水清洗以除去樹脂表面或內(nèi)部殘留的非極性或水溶性大的強(qiáng)極性雜質(zhì)(如多糖及無機(jī)鹽)，后以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％的乙醇由低至高濃度以一定的流速進(jìn)行洗脫，根據(jù)流出液顏色及吸附樹脂顏色變化，適時(shí)調(diào)整洗脫速度。

4)薄層色譜分析：將硅膠薄層板置于105℃的烘箱中活化半小時(shí)，取出置于硅膠板架中待用。在摸索梔子薄層色譜的展開劑中，嘗試了不同的溶劑體系：石油醚-乙酸乙酯，甲醇-水等，并嘗試了不同類型的硅膠板，得出硅膠gf254板可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的清晰分離。實(shí)踐證明展開劑乙酸乙酯：甲醇：水＝100:20:13可以使目標(biāo)化合物基本實(shí)現(xiàn)在硅膠板上的有效分離。梔子提取液洗脫過程中以京尼平苷、西紅花苷為對(duì)照品進(jìn)行薄層分析：將硅膠板上的展開劑展開至距底部12cm時(shí)取出自然晾干后，噴20％硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，置于105℃烘箱烘烤10min，觀察薄層板位點(diǎn)并計(jì)算rf值。rf＝展開斑點(diǎn)中心至點(diǎn)樣點(diǎn)中心距離/溶劑前沿至點(diǎn)樣點(diǎn)距離。

5)洗脫液篩選及合并：梔子提取物洗脫液過程中以京尼平苷、西紅花苷為對(duì)照品進(jìn)行薄層分析，并以此為依據(jù)全程監(jiān)測(cè)大孔樹脂洗脫液的成分及含量，將梔子洗脫液中主要含京尼平苷和西紅花苷的兩部分洗脫液分類合并，減壓濃縮至浸膏，經(jīng)冷凍干燥后分別得到梔子提取物干粉a(西紅花苷總苷)、梔子提取物干粉b(京尼平苷)，混合得到梔子提取物(西紅花苷總苷、京尼平苷)。

杜仲葉提取物分離

方法同梔子的提取步驟一致，得到杜仲葉提取物(綠原酸)。

薄層色譜檢測(cè)、合并及定性檢測(cè)：同一薄板上，取各部分洗脫液，與綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，以石油醚-乙醇(1:3,v/v)作為展開劑，室溫展開，干燥后，紫外燈鑒識(shí)，5％硫酸-乙醇溶液顯色，烘烤10min。薄層色譜結(jié)果只有一個(gè)明顯斑點(diǎn)，rf相同部分，即判斷為綠原酸洗脫物。合并與標(biāo)準(zhǔn)品rf相同部分，以此真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，得杜仲葉提取物干粉。

uplc對(duì)提取物的定量分析

色譜條件的選擇

1)綠原酸含量測(cè)定的uplc色譜條件：behshieldrpc18(1.7μm，2.1μm×50mm)色譜柱；流速0.3ml/min；柱溫30℃；流動(dòng)相：v乙腈：v0.4％磷酸溶液＝13:87；檢測(cè)波長327nm；進(jìn)樣量2μl。

2)京尼平苷含量測(cè)定的uplc色譜條件:behshieldrpc18(1.7μm，2.1μm×50mm)色譜柱；流速0.3ml/min；柱溫30℃；流動(dòng)相：v甲醇：v水＝30:70；檢測(cè)波長238nm；進(jìn)樣量2μl。

西紅花苷總苷含量選擇紫外可見分光光度計(jì)在最大吸收峰440nm進(jìn)行測(cè)定。

京尼平苷、綠原酸、西紅花苷對(duì)照品的配制：

精密稱取京尼平苷、綠原酸、西紅花苷-1標(biāo)準(zhǔn)品適量，加50％甲醇分別配制成100μg/ml的京尼平苷、綠原酸和西紅花苷-1對(duì)照品母液。

分別檢測(cè)儀器及樣品的精密性、穩(wěn)定性、回收率、重復(fù)性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及樣品含量的測(cè)定：

1)京尼平苷、綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml的京尼平苷或綠原酸母液，置10ml量瓶中加50％甲醇稀釋至刻度超聲混勻，0.22μm微孔濾膜過濾后，精確吸取2μl注入uplc，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，分別以京尼平苷、綠原酸濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)西紅花苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml西紅花苷母液置10ml量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度超聲混勻，吸取2ml于石英比色杯中440nm下測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定5次，以西紅花苷濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)提取物溶液的配制及含量測(cè)定：精密稱取杜仲葉提取物或梔子提取物適量，均配制成20μg/ml，使用uplc法分別測(cè)定杜仲葉提取物中綠原酸的含量、梔子提取物中京尼平苷的含量；同法配制80μg/ml的梔子提取物使用uv法測(cè)定梔子提取物中西紅花苷的含量。并分別根據(jù)各自對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

杜仲葉提取物中綠原酸含量約為52.5％，梔子提取物中京尼平苷含量約為52.8％，西紅花總苷含量約為10.8％。

lc-ms對(duì)提取物成分的定性分析

杜仲葉提取物lc-ms分析條件的選擇：

色譜條件：extend-c18色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動(dòng)相：0.1％甲酸(a)一乙腈(b)(其中梯度洗脫程序?yàn)椋?.01min：a—b(90：10)；3min：a—b(60∶40)；7min：a—b(30：70)；9min：a—b(10：90)；11min：a—b(90：10)；記錄時(shí)間：13min)；流速：0.3ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：327nm；進(jìn)樣量：2μl。

質(zhì)譜條件：esi(一)；干燥氣流速：12l/min；霧化室壓：20psi；毛細(xì)管電壓：4500ev；加熱毛細(xì)管溫度350℃；掃描范圍：50～1000m/z；吹掃氣壓力275.6kp。

梔子提取物lc-ms分析條件的選擇：

色譜條件：extend-c18色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動(dòng)相：水(a)一甲醇(b)(其中梯度洗脫程序?yàn)?.01min：a—b(70：30)；4min：a—b(40：60)；8min：a—b(20：80)；10min：a—b(70：30)；記錄時(shí)間：12min)；流速：0.3ml/min；柱溫：30℃；二極管陣列檢測(cè)器記錄190～700nm紫外-可見光譜，檢測(cè)波長設(shè)定為440nm及238nm；進(jìn)樣量：2μl。

質(zhì)譜條件：esi(+)；干燥氣流速：12l/rain；霧化室壓：20psi；毛細(xì)管電壓：4500ev；加熱毛細(xì)管溫度350℃；掃描范圍：50～1000m/z；吹掃氣壓力275.6kp。

二種提取物主要成分的結(jié)果分析：

在lc-ms對(duì)供試品溶液進(jìn)行全掃描獲得一級(jí)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上，利用離子阱質(zhì)譜的步進(jìn)式碰撞功能，通過改變電場(chǎng)梯度和能量梯度，獲得了總離子流圖中的各個(gè)主峰的分子離子流圖及質(zhì)譜圖，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料對(duì)總離子流圖中較大離子流峰進(jìn)行歸屬，定性分析提取物中未明確化合物。

實(shí)施例1：

試驗(yàn)方法

皮下注射谷氨酸鈉(4g/kg/d)干預(yù)乳鼠生長，正常對(duì)照組皮下注射相應(yīng)劑量的生理鹽水(10μl/g/d)，4周后將實(shí)驗(yàn)小鼠分為9組：正常對(duì)照組(normal)、模型組(model)、陽性對(duì)照藥白藜蘆醇組(res)、杜仲葉提取物高劑量組(eeh：400mg/kg)、杜仲葉低劑量組(eel：100mg/kg)、梔子提取物高劑量組(geh：400mg/kg)、梔子提取物低劑量組(gel：100mg/kg)、聯(lián)用高劑量組(eeh+geh：400mg/kg+400mg/kg)、聯(lián)用低劑量組(eel+gel：100mg/kg+100mg/kg)，每組10只小鼠。

灌胃期間正常組給予普通飼料，其余各實(shí)驗(yàn)組給予高脂飼料，灌胃給藥8周后，測(cè)定各組小鼠體重和附睪脂肪濕重，試劑盒測(cè)定血清中甘油三酯(tg)和膽固醇(tc)水平，elisa法測(cè)定血清中腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白介素–6(il-6)、一氧化氮合酶(inos)含量。westernblot法檢測(cè)各組小鼠肝臟和回腸中膽汁酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體atp結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白g5/8(abcg5/8)、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體膽汁酸輸出泵(bsep)、法尼醇x受體(fxr)、牛磺膽酸共運(yùn)蛋白(ntcp)、小異二聚體伴侶(shp)、g-蛋白偶聯(lián)受體(tgr5)蛋白含量的變化，內(nèi)參基因?yàn)間apdh。

測(cè)定結(jié)果如下表1～表3所示：

上述數(shù)據(jù)結(jié)果表明，杜仲葉提取物和梔子提取物可有效降低谷氨酸鈉誘導(dǎo)的高脂飲食肥胖小鼠的體重，降低血清的的甘油三酯(tg)和膽固醇(tc)水平，降低血清中的腫瘤壞死因子α(tnf-α)、白介素–6(il-6)、一氧化氮合酶(inos)含量。激活肝臟和回腸中膽汁酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白表達(dá)，降低膽汁酸抑制基因的蛋白表達(dá)水平。

如圖1、圖2所示，a表示與空白組相比，p<0.05；b表示與模型組相比，各給藥組p<0.05，c表示與杜仲高劑量相比p<0.05，d表示與杜仲低劑量相比p<0.05，e表示與梔子高劑量相比p<0.05，f表示與梔子低劑量組相比p<0.05。與normal組相比，model組小鼠血清中的甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；與model組比較，各給藥組均能不同程度降低tg、tc。其中eeh+geh組降低tg和tc的作用最強(qiáng)。

實(shí)用性

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所提供的組合物可應(yīng)用于中藥領(lǐng)域或是保健食品領(lǐng)域，尤其適用于肥胖人群，能夠有效減輕肥胖人群的體重，達(dá)到減肥的效果。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會(huì)影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利。

急性毒性試驗(yàn)

以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)梔子提取物(主要成分京尼平苷和西紅花苷，ge)，杜仲葉提取物(主要成分綠原酸,ee)進(jìn)行急性毒性研究，測(cè)定其半數(shù)致死量。方法：采用60％乙醇提取杜仲葉，梔子，經(jīng)大孔吸附樹脂分離后得到提取物為試藥，經(jīng)口給小鼠進(jìn)行灌胃，觀察不同劑量下小鼠的死亡情況及毒性情況，觀察病理切片he染色結(jié)果。結(jié)果：梔子提取物的ld50大于5000mg/kg；杜仲葉提取物的ld50為大于5000mg/kg；兩者混合物的ld50為大于5000mg/kg。顯示當(dāng)用量為5000mg/kg時(shí)，心臟顯示充血，心肌纖維斷裂，再加大劑量可能導(dǎo)致心力衰竭；脾臟顯示淋巴小結(jié)界限模糊不清，大量炎癥因子聚集；肺顯示充血，炎癥因子聚集；腎顯示腎小球囊腔大小不等，腎小球擴(kuò)張充血，腎小球內(nèi)炎癥聚集；肝臟表現(xiàn)為中央靜脈紅細(xì)胞聚集增多，肝索排列不整齊，炎癥細(xì)胞聚集。結(jié)論：根據(jù)急性毒性試驗(yàn)分級(jí)，顯示當(dāng)梔子提取物，杜仲葉提取物及其混合物在5000mg/kg以下時(shí)，為低毒性，為其用藥提供依據(jù)。