本發(fā)明提供了一種新的抗犬新孢子蟲藥物，提供了sb203580的新用途，用于新孢子蟲病的治療，屬于抗寄生蟲藥物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

新孢子蟲?。╪eosporiasis）是由犬新孢子蟲（neosporacaninum）寄生于脊椎宿主細(xì)胞內(nèi)所引發(fā)的一種致死性原蟲病，它是一種新近發(fā)現(xiàn)的原蟲病。同頂復(fù)門的大多數(shù)成員一樣，新孢子蟲專門寄生于宿主有核細(xì)胞內(nèi)，其宿主范圍廣泛，包括絕大多數(shù)哺乳動物。主要導(dǎo)致孕畜的流產(chǎn)和仔畜的死亡及運動神經(jīng)系統(tǒng)紊亂。據(jù)統(tǒng)計，世界上12%-42%的奶牛流產(chǎn)是由新孢子蟲感染引起的，因而新孢子蟲病被認(rèn)為是世界性奶牛流產(chǎn)的主要病因，對牛是原發(fā)性重要致病原，對畜牧業(yè)尤其是養(yǎng)牛業(yè)的危害嚴(yán)重，而且目前還不能排除新孢子蟲病的人畜共患潛在性。鑒于新孢子蟲病在公共衛(wèi)生的潛在危險和畜牧、養(yǎng)殖業(yè)的重要意義，該病逐漸成為近年來獸醫(yī)學(xué)界研究的重要課題。然而，目前為止，尚無防治新孢子蟲病的特效藥物，乙胺嘧啶、磺胺類、螺旋霉素、克林霉素等藥物雖有一定療效，但耐藥性、毒副作用等缺點明顯，因此，人們迫切需要尋找新的阻斷新孢子蟲感染的有效藥物。

本發(fā)明涉及的sb203580是一種絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase，mapk）的特異性抑制劑，它是一種靶向atp結(jié)合位點的競爭性抑制劑，能夠抑制宿主細(xì)胞map激酶的磷酸化；sb203580的分子量為377.43，化學(xué)式為c21h16fn3os，結(jié)構(gòu)式：

經(jīng)檢索本發(fā)明涉及的sb203580未見在犬新孢子蟲方面的醫(yī)用用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種新的抗犬新孢子蟲藥物，用于新孢子蟲病的治療，對于犬新孢子蟲感染有明顯治療作用。

本發(fā)明抗犬新孢子蟲藥物的內(nèi)容，包括：

根據(jù)mapk蛋白的分子特征尋找特異性的化學(xué)抑制劑，用該抑制劑阻斷mapk信號通路后，通過細(xì)胞侵入、感染實驗，以及小鼠模型的動物實驗，觀察其對犬新孢子蟲侵入宿主細(xì)胞、在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖和在小鼠腦組織寄生蟲感染的阻斷效果，同時提供該抑制劑發(fā)揮阻斷作用的工作濃度以及潛在的作用途徑，為抗犬新孢子蟲感染提供新的藥物，為未來新孢子蟲病的治療提供新的候選藥物。

本發(fā)明抗犬新孢子蟲藥物的作用途徑，包括以下內(nèi)容：

首先，通過免疫印跡法對宿主細(xì)胞mapk的磷酸化蛋白和總蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析該抑制劑對宿主mapk信號通路的阻斷作用，并對阻斷宿主mapk通路后，對犬新孢子蟲侵入細(xì)胞的影響進(jìn)行證明；其次，通過顯微鏡法速殖子活力測定和免疫印跡法測定微線蛋白分泌，分析該抑制劑對犬新孢子蟲蟲體的直接抑制作用。

本發(fā)明的積極效果在于：

提供了sb203580的新的醫(yī)用用途，到了能顯著抑制犬新孢子蟲細(xì)胞感染和小鼠模型腦組織感染的化學(xué)藥物,其通過同時作用于宿主細(xì)胞和寄生蟲兩方面來發(fā)揮阻斷作用。本發(fā)明為犬新孢子蟲的治療提供了新的候選藥物和新的候選藥物作用靶標(biāo)p38mapk，為未來藥物干預(yù)新孢子蟲病奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1、本發(fā)明sb203580作用于mdbk細(xì)胞的途徑；

圖2、本發(fā)明sb203580對速殖子活力的抑制效果；

圖3、本發(fā)明sb203580對微線蛋白分泌的抑制效果；

圖4、本發(fā)明sb203580對犬新孢子蟲侵入細(xì)胞的阻斷效果；

圖5、本發(fā)明sb203580對犬新孢子蟲胞內(nèi)增殖的阻斷效果；

圖6、本發(fā)明sb203580對犬新孢子蟲在小鼠腦感染的阻斷效果。

具體實施方式

以下描述了本發(fā)明的具體實施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這僅僅是舉例說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實質(zhì)的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，這些變更和修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1

本發(fā)明以sb203580為例，證明其對犬新孢子蟲侵入細(xì)胞、胞內(nèi)增殖和小鼠腦感染的治療效果。

作用于mdbk細(xì)胞的途徑：

用sb203580阻斷宿主p38mapk后，觀察其對犬新孢子蟲侵入宿主細(xì)胞的影響，并用spss軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。感染前（速殖子：細(xì)胞=10：1）用sb203580（20μm）預(yù)孵育宿主細(xì)胞1h，然后用pbs清洗除去抑制劑，結(jié)果顯示：2h時，感染細(xì)胞百分比減少了32.8%（p<0.05）；而且1h時通過westernblot檢測p38mapk的磷酸化，結(jié)果表明sb203580作用細(xì)胞使犬新孢子蟲誘導(dǎo)的宿主p38mapk的活化顯著降低（p<0.05），說明sb203580能作用于宿主細(xì)胞發(fā)揮部分對犬新孢子蟲感染的抑制作用（如附圖1所示）。

作用于新孢子蟲的途徑：

用sb203580阻斷寄生蟲p38mapk信號通路后，觀察其對犬新孢子蟲速殖子活力和微線蛋白分泌的影響，并用spss軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用sb203580（20μm）孵育10⁷個nc-1速殖子2h，結(jié)果顯示：sb203580處理后，速殖子活力得到顯著抑制，活動的速殖子百分比減少了55.3%（p<0.05）（如附圖2所示）；而且sb203580能顯著抑制微線蛋白ncmic2、ncmic3和ncmic6的胞外分泌（p<0.05）（如附圖3所示），說明sb203580能直接作用于寄生蟲，抑制犬新孢子蟲的活力和微線蛋白分泌；另外，我們對犬新孢子蟲蟲體上p38mapk蛋白同系物進(jìn)行了預(yù)測，在原蟲數(shù)據(jù)庫(www.toxodb.org)上檢索與宿主p38mapk同源的激酶同系物，結(jié)果搜索到了假定的p38mapk同系物，其中得分最高（expect值最低）的前5個激酶同系物依次列在表1中。

將這些蛋白與鼠p38αmapk蛋白(np_001161980；mapk14，musmusculus)進(jìn)行序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這5個激酶同系物都屬于mapk激酶家族和細(xì)胞周期素依賴類激酶（cyclindependentlikekinases，cdk）家族，并且與鼠p38αmapk有34%–44%的序列同源性。序列分析鑒定出與哺乳類p38mapk激酶催化結(jié)構(gòu)域有高度保守性的基序：vaxk基序（亞結(jié)構(gòu)域ii）的氨基酸k53、dfglar基序（亞結(jié)構(gòu)域vii）的氨基酸d168及t180xy182txxyxape基序（亞結(jié)構(gòu)域viii）的氨基酸t(yī)180。其中txytxxyxape基序的t180和y182是p38mapk的主要磷酸化位點，在同系物蛋白ncliv_032840、ncliv_015030和ncliv_056080中都存在。這些結(jié)果表明犬新孢子蟲上存在sb203580的作用位點，sb203580可能直接作用于新孢子蟲蟲體（如附表1所示）。

表1犬新孢子蟲mapk同系物與鼠p38αmapk的序列比對結(jié)果

表1中列出與鼠p38αmapk同源性最高的前5個新孢子蟲假定p38αmapk同系物蛋白，通過序列分析，真核蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域的主要亞結(jié)構(gòu)域基序呈現(xiàn)在上表中，常見的氨基酸顯示為粗體，高頻率氨基酸顯示為斜體。

結(jié)論：本發(fā)明所述的sb203580通過同時作用于宿主細(xì)胞和寄生蟲兩方面來發(fā)揮阻斷作用。

實施例2

抗犬新孢子蟲藥物的用途

1、mapk抑制劑對犬新孢子蟲侵入細(xì)胞的阻斷效果

本發(fā)明以sb203580為例，觀察其對犬新孢子蟲侵入mdbk細(xì)胞的阻斷效果。

mdbk細(xì)胞與sb203580共孵育，然后接種nc-1速殖子（速殖子：細(xì)胞=10：1）,通過細(xì)胞侵入實驗，觀察抑制劑對犬新孢子蟲侵入細(xì)胞的阻斷效果，并用spss軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示：sb203580對犬新孢子蟲侵入細(xì)胞的阻斷呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)sb203580的作用濃度為5μm、10um和20um時，在感染2h時每100個細(xì)胞的速殖子數(shù)分別減少了21.7%、39.8%和63.5%（均p<0.05）；在感染1h和2h時，sb203580（20μm）均能顯著抑制犬新孢子蟲侵入細(xì)胞，感染細(xì)胞百分比分別減少了54.8%和57.3%（p<0.05）（如附圖4所示）。

mapk抑制劑對犬新孢子蟲胞內(nèi)增殖的阻斷效果

本發(fā)明以p38mapk抑制劑sb203580為例，觀察其對犬新孢子蟲在mdbk細(xì)胞內(nèi)增殖的阻斷效果。

mdbk細(xì)胞用p38mapk抑制劑sb203580孵育1h，然后接種nc-1速殖子（速殖子：細(xì)胞=10：1）,通過細(xì)胞感染實驗，觀察抑制劑對犬新孢子蟲細(xì)胞內(nèi)增殖的阻斷效果，并用spss軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示：sb203580對犬新孢子蟲胞內(nèi)增殖的阻斷呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)sb203580為5μm、10um和20um時，在感染24h時每100個細(xì)胞的速殖子數(shù)分別減少了12.1%（p>0.05）、25.6%（p<0.05）和43.5%（p<0.05）；sb203580為20μm時，感染細(xì)胞百分比減少了42.5%（p<0.05）。說明sb203580的作用濃度為10μm和20μm時均能顯著抑制犬新孢子蟲的胞內(nèi)增殖（如附圖5所示）。

sb203580對小鼠模型犬新孢子蟲感染的治療效果

本發(fā)明以sb203580為例，觀察其對犬新孢子蟲小鼠感染模型治療效果。

給小鼠腹腔接種10⁷個nc-1速殖子，隨后每天靜脈注射sb203580，連續(xù)給藥一星期，分別設(shè)立pbs組、溶劑dmso組，以及給藥5μm、10μm、20組，30天后處死小鼠，采取腦組織，通過熒光定量pcr檢測每20ng腦組織dna的速殖子數(shù)量，使用nc-5特異性引物：

引物序列為上游引物：5′-tccctcggttcacccgttcacacac-3′；

下游引物：5′-cacgtatcccacctctcaccgctacca-3′；

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：給藥后，腦組織寄生蟲感染數(shù)量的減少呈現(xiàn)藥物濃度依賴性，給藥5μm、10um和20μm組，速殖子數(shù)/20ngdna分別減少了9.4%（p>0.05）、21.5%（p<0.05）和38.3%（p<0.05）。說明sb203580的作用濃度為10μm和20μm時均能顯著降低犬新孢子蟲在小鼠模型的腦組織感染量（如附圖6所示）。

綜合上述實驗結(jié)果，本發(fā)明的抗犬新孢子蟲藥物通過同時作用于宿主細(xì)胞和寄生蟲的方式，抑制新孢子蟲侵入宿主細(xì)胞、蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖和腦組織內(nèi)的新孢子蟲感染數(shù)量，發(fā)揮抗犬新孢子蟲感染的效果，可用于動物犬新孢子蟲感染的治療。