本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

核因子-κb/rel轉(zhuǎn)錄因子家族在協(xié)調(diào)參與免疫和炎癥過(guò)程的幾種基因的表達(dá)中起著中心作用，nf-κb幾乎在所有細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)，正常情況下，nf-κb通常是抑制性蛋白（iκb）與p50和p65亞基結(jié)合的異源二聚體，但在炎癥介入的疾病的相關(guān)細(xì)胞中，細(xì)胞被多種因子激活，如促炎細(xì)胞因子，細(xì)菌脂多糖（lps）和佛波酯等，nf-κb被激活，nf-κb的抑制劑iκb會(huì)被磷酸化而被降解，并釋放脫離了iκb的p50/p65復(fù)合體，p50/p65復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞，啟動(dòng)各種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。基因藥物nf-κbdecoyodns可以特異性地結(jié)合nf-κb的p50/p65復(fù)合體，與p50/p65復(fù)合體特異性結(jié)合后可阻止nf-κb進(jìn)入細(xì)胞核，抑制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，從而降低炎癥反應(yīng)。

nf-κbdecoyodns與傳統(tǒng)治療方法相比，能特異性結(jié)合核因子-κb，從根源上改善炎癥的發(fā)生，從而達(dá)到治療目的，與傳統(tǒng)藥物相比，具有高效低毒的優(yōu)勢(shì)。然而游離的nf-κbdecoyodns由于細(xì)胞膜傳遞性差，在體內(nèi)易受酶的降解，靶向性差而極大地限制了其發(fā)揮作用。dna納米自組裝體本身具有良好的穩(wěn)定性，良好的生物相容性，大小和形狀的高度可

控性等優(yōu)點(diǎn)，dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns將顯著提高nf-κbdecoyodns在體內(nèi)外的穩(wěn)定性和療效，而且nf-κbdecoyodns納米組裝體通過(guò)高效阻止炎癥反應(yīng)，可有效控制疾病發(fā)展。

血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（vascularcelladhesionmolecule-1,vcam-1），是一個(gè)90k~110k道爾頓的糖蛋白，其在炎癥滑膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥巨噬細(xì)胞和炎癥成纖維樣滑膜細(xì)胞表面均呈現(xiàn)高表達(dá),主要與存在于白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞表面的受體α4整合素家族的α4β1(又稱verylateantigen4,vla-4)結(jié)合,介導(dǎo)并增強(qiáng)白細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥成纖維樣滑膜細(xì)胞的黏附，從而增強(qiáng)白細(xì)胞向滑膜關(guān)節(jié)腔的滲入和停留；參與淋巴細(xì)胞的活化、遷移和造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,并在腫瘤、炎癥轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程中起重要作用。在dna納米自組裝體體上修飾vcam-1靶向多肽，將使納米組裝體像白細(xì)胞一樣易于向發(fā)炎滑膜聚集。由于滑模腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞表面高表達(dá)vcam-1，因此被vcam-1靶向多肽修飾的nf-κbdecoyodns納米組裝體可主動(dòng)靶向于滑模腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞，提高整體的抗炎效果，達(dá)到高效低毒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的目的。

目前，通過(guò)dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns并修飾vcam-1靶向多肽形成的藥物傳遞系統(tǒng)在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用中尚未報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決nf-κbdecoyodns在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中穩(wěn)定性差、抗炎效果不佳、副作用大的技術(shù)難題，公開(kāi)了一種靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的制備方法及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的制備方法，步驟如下：

（1）將四條單鏈直鏈dna與組成nf-κbdecoyodns的兩條鏈nf-κbc、nf-κbd在體外緩沖鹽溶液中，退火自組裝形成td-dodns溶液；

（2）ssdna-peptide：低速攪拌向ssdna中滴加交聯(lián)劑，在ph7~9條件下，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)的多肽，得到ssdna-smcc，然后加入vcam-1靶向多肽，ph6.5~7.5條件下，反應(yīng)8~12h，透析24h除去未反應(yīng)的多肽，得到ssdna-peptide；

（3）向步驟（1）中制備的td-dodns溶液中加入ssdna-peptide，以2min/℃的速度從40℃降至20℃，完成靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的制備。

所述步驟（1）中四條單鏈直鏈dna為單鏈直鏈s1、s2-f、s3、s4或單鏈直鏈s1、s2-f、s3p、s4或單鏈直鏈s1-p、s2-f、s3-p、s4-f或單鏈直鏈s1-f、s2-f、s3-p、s4-f；四條單鏈直鏈dna與nf-κbc和nf-κbd反應(yīng)的物質(zhì)的量比為：1:1:1:1：（1~3）：（1~3）。

所述單鏈直鏈s1的序列如seqidno：1所示，單鏈直鏈s1-f的序列如seqidno：2所示，單鏈直鏈s1-p的序列如seqidno：3所示，單鏈直鏈s2的序列如seqidno：4所示，單鏈直鏈s2-f的序列如seqidno：5所示，單鏈直鏈s3的序列如seqidno：6所示，單鏈直鏈s3-p的序列如seqidno：7所示，單鏈直鏈s4的序列如seqidno：8所示，單鏈直鏈s4-f的序列如seqidno：9所示，nf-κbc序列如seqidno：10所示，nf-κbd序列如seqidno：11所示。

所述步驟（1）中體外緩沖鹽溶液為將mgcl2溶于濃度5~20mm的tris·hcl溶液中，mgcl2的終濃度為5~20mm。

所述步驟（1）中退火條件為95℃保持5min，10s內(nèi)由95℃降溫至4℃，4℃保持30s。

所述步驟（2）中，ssdna序列如seqidno：11所示，其3’端c7經(jīng)氨基修飾；交聯(lián)劑為sulfo-smcc溶液；vcam-1靶向多肽序列如seqidno：12所示；ssdna：vcam-1靶向多肽的物質(zhì)的量比為20:1。

所述步驟（3）中，ssdna-peptide：td-dodns的物質(zhì)的量比為1：（1~2）。

所述dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的平均粒徑小于10nm。

一種靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns作為抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫治療的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明采用dna納米自組裝技術(shù)合成載體，制備方法簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，nf-κbdecoyodns可與載體通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)連接，同時(shí)提高了藥物的穩(wěn)定性。選用vcam-1靶向多肽修飾dna納米自組裝體，提高nf-κbdodns納米組裝體對(duì)炎癥部位和炎癥細(xì)胞的靶向性，增強(qiáng)抗炎效果。

2.本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單、副作用小、能有效負(fù)載基因藥物nf-κbdecoyodns到達(dá)炎癥部位減少炎癥反應(yīng)，有望成為一種新的方法用于臨床抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫治療。

附圖說(shuō)明

圖1為dodns、td、td-dodns、td-1p-dodns、td-2p-2odns、td-3p-dodns、dodns的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為ssdna、ssdna-peptide的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

圖3為dna納米自組裝體的afm圖。

圖4為載體對(duì)巨噬細(xì)胞raw264.7的毒性考察。

圖5為載體對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞huvec的毒性考察。

圖6為td、dodns、tdsodns、td-dodns、td-1p-dodns對(duì)巨噬細(xì)胞raw264.7的抗炎作用。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)以合成靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns為例闡述具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1

（1）nf-κbdecoyodns的合成：

將合成nf-κbdecoyodns的兩條單鏈nf-κbd、nf-κbd’等摩爾比混合，用tm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，從80℃降溫到25℃，降溫時(shí)間為2h。nf-κbdecoyodns合成，4℃保存。

（2）dna納米自組裝體的合成:

將合成dna納米自組裝體的四條單鏈s1、s2、s3、s4等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（3）dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

將s1、s2-f、s3、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（4）ssdna-peptide的合成：

低速攪拌下向3'端c7氨基修飾的單鏈直鏈dna（ssdna）中逐滴滴加sulfo-smcc溶液，物質(zhì)的量比為ssdna：sulfo-smcc=1:400，ph7~9，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得ssdna-smcc溶液；磁力攪拌下逐滴加入vcam-1靶向多肽，物質(zhì)的量比為vcam-1靶向多肽：ssdna=1:20，ph6.5~7.5，反應(yīng)過(guò)夜，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得到ssdna-peptide溶液，4℃保存。

（5）靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成：

將s1、s2-f、s3-p、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成，4℃保存。

（6）靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

向已構(gòu)建好的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns前體中加入等摩爾量的ssdna-peptide，從40℃開(kāi)始，以2min/℃的速度降溫至20℃。靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns構(gòu)建完成，4℃保存。

實(shí)施例2

（1）nf-κbdecoyodns的合成：

將合成nf-κbdecoyodns的兩條單鏈nf-κbd、nf-κbd’等摩爾比混合，用tm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，從80℃降溫到25℃，降溫時(shí)間為2h。nf-κbdecoyodns合成，4℃保存。

（2）dna納米自組裝體的合成:

將合成dna納米自組裝體的四條單鏈s1、s2、s3、s4等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（3）dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

將s1、s2f、s3、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（4）ssdna-peptide的合成：

低速攪拌下向3'端c7氨基修飾的單鏈直鏈dna（ssdna）中逐滴滴加sulfo-smcc溶液，物質(zhì)的量比為ssdna：sulfo-smcc=1:400，ph7~9，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得ssdna-smcc溶液；磁力攪拌下逐滴加入vcam-1靶向多肽，物質(zhì)的量比為vcam-1靶向多肽：ssdna=1:20，ph6.5~7.5，反應(yīng)過(guò)夜，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得到ssdna-peptide溶液，4℃保存。

（5）靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成：

將s1p、s2f、s3p、s4f、nf-κbc、nf-κbd以1:1:1:1:2:2的摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成，4℃保存。

（6）靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

向已構(gòu)建好的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns前體中加入1:2摩爾比的ssdna-peptide，從40℃開(kāi)始，以2min/℃的速度降溫至20℃。靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns構(gòu)建完成，4℃保存。

實(shí)施例3

（1）nf-κbdecoyodns的合成：

將合成nf-κbdecoyodns的兩條單鏈nf-κbd、nf-κbd’等摩爾比混合，用tm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，從80℃降溫到25℃，降溫時(shí)間為2h。nf-κbdecoyodns合成，4℃保存。

（2）dna納米自組裝體的合成:

將合成dna納米自組裝體的四條單鏈s1、s2、s3、s4等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（3）dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

將s1、s2f、s3、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（4）ssdna-peptide的合成：

低速攪拌下向3'端c7氨基修飾的單鏈直鏈dna（ssdna）中逐滴滴加sulfo-smcc溶液，物質(zhì)的量比為ssdna：sulfo-smcc=1:400，ph7~9，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得ssdna-smcc溶液；磁力攪拌下逐滴加入vcam-1靶向多肽，物質(zhì)的量比為vcam-1靶向多肽：ssdna=1:20，ph6.5~7.5，反應(yīng)過(guò)夜，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得到ssdna-peptide溶液，4℃保存。

（5）靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成：

將s1p、s2f、s3p、s4f、nf-κbc、nf-κbd以1:1:1:1:3:3的摩爾比混合，用5mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成，4℃保存。

（6）靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

向已構(gòu)建好的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns前體中加入等摩爾比的ssdna-peptide，從40℃開(kāi)始，以2min/℃的速度降溫至20℃。靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns構(gòu)建完成，4℃保存。

實(shí)施例4

（1）nf-κbdecoyodns的合成：

將合成nf-κbdecoyodns的兩條單鏈nf-κbd、nf-κbd’等摩爾比混合，用tm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，從80℃降溫到25℃，降溫時(shí)間為2h。nf-κbdecoyodns合成，4℃保存。

（2）dna納米自組裝體的合成:

將合成dna納米自組裝體的四條單鏈s1、s2、s3、s4等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（3）dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

將s1、s2-f、s3、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（4）ssdna-peptide的合成：

低速攪拌下向3'端c7氨基修飾的單鏈直鏈dna（ssdna）中逐滴滴加sulfo-smcc溶液，物質(zhì)的量比為ssdna：sulfo-smcc=1:400，ph7~9，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得ssdna-smcc溶液；磁力攪拌下逐滴加入vcam-1靶向多肽，物質(zhì)的量比為vcam-1靶向多肽：ssdna=1:20，ph6.5~7.5，反應(yīng)過(guò)夜，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得到ssdna-peptide溶液，4℃保存。

（5）靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成：

將s1、s2-f、s3-p、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成，4℃保存。

（6）靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

向已構(gòu)建好的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns前體中加入等摩爾量的ssdna-peptide，從40℃開(kāi)始，以2min/℃的速度降溫至20℃。靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns構(gòu)建完成，4℃保存。

實(shí)施例5

（1）nf-κbdecoyodns的合成：

將合成nf-κbdecoyodns的兩條單鏈nf-κbd、nf-κbd’等摩爾比混合，用tm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，從80℃降溫到25℃，降溫時(shí)間為2h。nf-κbdecoyodns合成，4℃保存。

（2）dna納米自組裝體的合成:

將合成dna納米自組裝體的四條單鏈s1、s2、s3、s4等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（3）dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

將s1、s2f、s3、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（4）ssdna-peptide的合成：

低速攪拌下向3'端c7氨基修飾的單鏈直鏈dna（ssdna）中逐滴滴加sulfo-smcc溶液，物質(zhì)的量比為ssdna：sulfo-smcc=1:400，ph7~9，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得ssdna-smcc溶液；磁力攪拌下逐滴加入vcam-1靶向多肽，物質(zhì)的量比為vcam-1靶向多肽：ssdna=1:20，ph6.5~7.5，反應(yīng)過(guò)夜，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得到ssdna-peptide溶液，4℃保存。

（5）靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成：

將s1p、s2f、s3p、s4f、nf-κbc、nf-κbd以1:1:1:1:2:2的摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成，4℃保存。

（6）靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

向已構(gòu)建好的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns前體中加入1:2摩爾比的ssdna-peptide，從40℃開(kāi)始，以2min/℃的速度降溫至20℃。靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns構(gòu)建完成，4℃保存。

實(shí)施例6

（1）nf-κbdecoyodns的合成：

將合成nf-κbdecoyodns的兩條單鏈nf-κbd、nf-κbd’等摩爾比混合，用tm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，從80℃降溫到25℃，降溫時(shí)間為2h。nf-κbdecoyodns合成，4℃保存。

（2）dna納米自組裝體的合成:

將合成dna納米自組裝體的四條單鏈s1、s2、s3、s4等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（3）dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

將s1、s2f、s3、s4、nf-κbc、nf-κbd等摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。dna納米自組裝體合成，4℃保存。

（4）ssdna-peptide的合成：

低速攪拌下向3'端c7氨基修飾的單鏈直鏈dna（ssdna）中逐滴滴加sulfo-smcc溶液，物質(zhì)的量比為ssdna：sulfo-smcc=1:400，ph7~9，室溫反應(yīng)2h，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得ssdna-smcc溶液；磁力攪拌下逐滴加入vcam-1靶向多肽，物質(zhì)的量比為vcam-1靶向多肽：ssdna=1:20，ph6.5~7.5，反應(yīng)過(guò)夜，透析24h除去未反應(yīng)多肽，得到ssdna-peptide溶液，4℃保存。

（5）靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成：

將s1p、s2f、s3p、s4f、nf-κbc、nf-κbd以1:1:1:1:3:3的摩爾比混合，用10mmtm（tris?hcl，ph8.0和mgcl2）緩沖液稀釋至終濃度為0.5μm，低速渦旋至混合均勻。在pcr儀中，95℃變性5min后，迅速降溫至4℃并保持30s。靶向四面體載nf-κbdecoyodns前體的合成，4℃保存。

（6）靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的合成：

向已構(gòu)建好的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns前體中加入等摩爾比的ssdna-peptide，從40℃開(kāi)始，以2min/℃的速度降溫至20℃。靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns構(gòu)建完成，4℃保存。

效果實(shí)施例1：實(shí)施例1-3的瓊脂糖凝膠電泳表征：

精密稱取0.60g瓊脂糖粉末，加到20ml1×tae電泳液中，置于電爐上加熱煮沸3min，待溫度冷卻至70℃左右，加入1.2μl溴化乙錠（eb）溶液，混合后將凝膠倒入模具中，室溫冷卻30-45min，即制得3%瓊脂糖凝膠。將制備好的凝膠放于裝有1×tae電泳液的電泳槽中，使電泳液液面高于凝膠2mm左右，將各樣品與6×loadingbuffer按1:0.2的比例進(jìn)行混合，混合后加到凝膠加樣孔中，冰浴條件，100v的電壓電泳50min。電泳完成后，用凝膠成像儀分析。結(jié)果見(jiàn)圖1。

效果實(shí)施例2：本發(fā)明實(shí)施例1的ssdna-peptide的聚丙烯酰胺凝膠電泳：

安裝好電泳裝置，檢漏10min,制膠：向10mlep管中加入30%丙烯酰胺4ml、5×tbe1.6ml、10%過(guò)硫酸銨0.056ml、純化水2.344ml、混合均勻后，加入temed5.2μl,混勻后，將膠注入玻璃板間，插入梳子，聚合30min,拔出梳子，用1×tbe電泳液充滿電泳槽，將6×loadingbuffer與樣品5:1充分混合，加入樣品孔。110v電泳90min，將凝膠置于0.5%eb中染色15min，用凝膠成像儀分析。結(jié)果見(jiàn)圖2。

效果實(shí)施例3：本發(fā)明實(shí)施例1的dna納米自組裝體的原子力顯微鏡：

將合成好的dna納米自組裝體用tmbuffer稀釋至終濃度為125nm。取10μl樣品，滴加到云母片上，通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引，靜止吸附5min，使dna納米自組裝體吸附到云母表面。再滴加tmbuffer覆蓋樣品。用afm在液相模式下進(jìn)行掃描。結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)三角形框架，大小約5.8nm，由于云母片的吸附作用dna四面體高度有所下降，約3.4nm。

效果實(shí)施例4：本發(fā)明實(shí)施例1的dna納米自組裝體的細(xì)胞毒性考察：

采用兩種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞raw264.7和huvec對(duì)dna納米自組裝體的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，用cck-8法考察細(xì)胞的增殖抑制情況。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)所用的dna納米自組裝體濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率都小于10%，在lps存在的情況下，dna納米自組裝體對(duì)細(xì)胞抑制率也低于10%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用載體材料對(duì)raw264.7和huvec細(xì)胞無(wú)明顯毒性，可排除干擾。

效果實(shí)施例5：本發(fā)明實(shí)施例1的靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的體外抗炎作用：

采用兩種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞raw264.7和huvec對(duì)靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的抗炎作用進(jìn)行研究，用elisa法檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子。結(jié)果見(jiàn)圖4。藥物nf-κbdecoyodns對(duì)兩種炎癥細(xì)胞的抗炎作用隨濃度的增加而增強(qiáng)，相同濃度下，td-1p-dodns對(duì)細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的抑制作用最明顯，其次是td-dodns，游離nf-κbdecoyodns作用最弱。結(jié)果表明靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns增強(qiáng)了nf-κbdecoyodns的抗炎作用。

效果實(shí)施例6：本發(fā)明實(shí)施例1的raw264.7和huvec對(duì)靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的定量攝取：

raw264.7和huvec對(duì)靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns攝取2h和4h的熒光強(qiáng)度值見(jiàn)表1和表2，4h時(shí)細(xì)胞對(duì)藥物nf-κbdecoyodns的攝取量明顯高于2h的攝取量，td-1p-dodns明顯比td-dodns的攝取量多，兩者攝取量都高于游離nf-κbdecoyodns；4h時(shí)，raw264.7對(duì)td-1p-dodns的攝取量是td-dodns的1.05倍，是dodns的2.81倍，huvec對(duì)td-1p-dodns的攝取量是td-dodns的1.38倍，是dodns的2.63倍。

表1藥物在raw264.7細(xì)胞攝取的熒光強(qiáng)度值

表2藥物在huvec細(xì)胞攝取的熒光強(qiáng)度值

結(jié)果表明，dna納米自組裝體提高了細(xì)胞對(duì)藥物攝取，修飾vcam-1靶向多肽后，明顯增加了細(xì)胞的攝取量。

<110>鄭州大學(xué)

<120>一種靶向dna納米自組裝體載nf-κbdecoyodns的制備方法及其應(yīng)用

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<213>人工序列

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<212>prt

<213>人屬(homo)

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