本發(fā)明涉及男性生殖系統(tǒng)領(lǐng)域，具體涉及木犀草素在制備治療睪丸組織損傷藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

男性不育癥是男科的常見病多發(fā)病之一，據(jù)who調(diào)查，15％育齡夫婦存在不育問題，而發(fā)展中國家某些地區(qū)可高達30％，男女雙方原因各占50％。流行病調(diào)查數(shù)據(jù)表明：近50年來，男性精子密度幾乎降低了1倍，美國男性的精子數(shù)量幾乎每年下1.5％?？梢钥闯霾G丸生精功能障礙是誘發(fā)男性不育的重要原因之一。據(jù)報道：超過80％的男性不育患者精漿活性氧(ros，reactiveoxygenspecies)水平超過正常人群，高含量ros的男性不育患者其生育機率比低含量ros的男性不育患者低數(shù)倍。并且采用ros水平作為診斷由于男性因素導(dǎo)致不孕不育的指標(biāo)具有68.8％的靈敏度和93.8％的特異性。氧化應(yīng)激(oxidativestress，os)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用。睪丸組織的氧化應(yīng)激損傷是指睪丸內(nèi)產(chǎn)生的大量氧化中間產(chǎn)物(例如活性氧)會導(dǎo)致睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，致使睪丸支持細胞損傷，進一步引起精子數(shù)量下降、精子活動率、睪丸酮和促黃體生成激素降低，精子畸形率升高。因此睪丸組織的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致男性生精功能障礙的一個重要因素。

睪丸支持細胞(scs)在構(gòu)建睪丸基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，能量供應(yīng)，抵御有毒有害物質(zhì)侵入，維持精子賴以生存的內(nèi)環(huán)境，影響精子生成過程中具有不可替代的作用。只有scs細胞的功能及形態(tài)正常的前提下，精子才能順利生成。當(dāng)支持細胞受到ros攻擊時，會引起該細胞氧化損傷,必然同時影響間質(zhì)細胞，生精細胞和精子的正常生理學(xué)功能，進一步干擾精子發(fā)生,導(dǎo)致精子畸形，活力降低，無精子癥等生殖系統(tǒng)障礙，引起男性生育能力下降。保護睪丸支持細胞成為抵御氧化應(yīng)激誘發(fā)生精功能障礙的第一屏障。當(dāng)各種不良因素如：衰老，環(huán)境中的污染物(微囊藻毒素、乙基己基鄰苯二甲酸酯、二惡英、金屬鎘)，治療藥物(雷公藤、環(huán)磷酰胺、博來霉素)及疾病(糖尿病，睪丸扭轉(zhuǎn)損傷，炎癥)作用于ros生成系統(tǒng)，會導(dǎo)致ros生成過量，使得ros積聚。睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，致使睪丸支持細胞損傷，進一步引起精子發(fā)生異常。因此研發(fā)一種治療睪丸組織損傷的藥物成為目前迫切需要解決的問題。

木犀草素作為一種天然的黃酮類化合物，具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗菌、抗炎，心血管保護、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、利尿等功效。近年來發(fā)現(xiàn)木犀草素還可以通過增敏trail，激活atr-chk2-p53信號通路，抑制nf-κb的激活，激活p38通路等多種信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

目前用于治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷的藥物較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供木犀草素在制備治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供木犀草素在制備治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷的藥物組合物，其活性成分為木犀

草素。

細胞增殖實驗及annexinv-fitc/pi流式細胞儀檢測結(jié)果顯示木犀草素(2.5，5和10μmol/l)的濃度可以逆轉(zhuǎn)過氧化氫和雷公藤甲素?fù)p傷的睪丸支持細胞損傷，抑制過氧化氫誘導(dǎo)睪丸支持細胞tm4凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

ros探針染色發(fā)現(xiàn)木犀草素預(yù)處理后的小鼠睪丸支持細胞tm4細胞內(nèi)ros水平顯著下降，且呈現(xiàn)濃度依賴性，一定程度地抑制細胞內(nèi)ros累積，逆轉(zhuǎn)h2o2對細胞的損傷，且比陽性藥物抑制ros累積的效果顯著。

細胞線粒體膜電位檢測顯示木犀草素可逆轉(zhuǎn)過氧化氫造成的細胞線粒體膜電位的坍塌。

pcr及免疫熒光實驗結(jié)果證實，木犀草素可以激活nrf2的核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)下游抗氧化基因的表達，提升細胞抗氧化防御能力，保護睪丸支持細胞避免氧化應(yīng)激損傷。

采用雷公藤甲素誘導(dǎo)小鼠睪丸組織損傷病理模型，睪丸指數(shù)和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示木犀草素可以有效逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素誘導(dǎo)小鼠睪丸組織損傷，且效果好于陽性對照槲皮素。

采用transwell電阻值測定及支持細胞血睪屏障相關(guān)功能蛋白表達實驗，發(fā)現(xiàn)木犀草素可以抑制雷公藤甲素誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷所導(dǎo)致的血睪屏障通透性增加；木犀草素通過調(diào)控縫隙連接，閉合連接和緊密連接蛋白的表達，發(fā)揮對血睪屏障的保護作用。

本發(fā)明通過分別建立過氧化氫和雷公藤甲素?fù)p傷睪丸支持細胞tm4細胞模型，首次探索了木犀草素在治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷中的積極作用。實驗證明，在治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷方面，木犀草素能夠達到與陽性藥槲皮素相似甚至更好的保護效果；另外，由于木犀草素的體內(nèi)吸收效果較好，生物利用度較高，而陽性藥槲皮素生物利用度較低，因此，木犀草素可以應(yīng)用于制備治療睪丸組織氧化應(yīng)激損傷的藥物，且應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1顯示mtt法檢測不同濃度木犀草素處理不同時間對過氧化氫干預(yù)的tm4的存活率的影響，其中“*”表示與正常組相比p<0.05，“**”表示與正常組相比p<0.01)。

圖2顯示mtt法檢測不同濃度木犀草素處理不同時間對雷公藤甲素干預(yù)的tm4的存活率的影響，其中“*”表示與模型組相比p<0.05，“**”表示與模型組相比p<0.01)。

圖3顯示annexinv/pi雙染色法檢測木犀草素對過氧化氫干預(yù)的tm4細胞凋亡率的影響，其中a:正常組，b：模型組，c：陽性藥對照組，d：木犀草素低劑量組(2.5μm)，e：木犀草素中劑量組(5μm)，f：木犀草素高劑量組(10μm)。

圖4顯示木犀草素對過氧化氫干預(yù)的tm4細胞內(nèi)ros水平的影響，其中a:正常組，b：模型組，c：陽性藥對照組，d：木犀草素低劑量組(2.5μm)，e：木犀草素中劑量組(5μm)，f：木犀草素高劑量組(10μm)。

圖5顯示木犀草素對過氧化氫導(dǎo)致的睪丸支持細胞線粒體膜電位的影響，其中a:正常組，b：模型組，c：陽性藥對照組，d：木犀草素低劑量組(2.5μm)，e：木犀草素中劑量組(5μm)，f：木犀草素高劑量組(10μm)。

圖6顯示免疫熒光法觀察木犀草素對睪丸支持細胞nrf2的核轉(zhuǎn)錄的影響，其中左邊的control表示正常對照組，h2o2表示h2o2干預(yù)的實驗組，luteolin(5μm)+h2o2(300mm)表示5μm木犀草素和300mmh2o2同時干預(yù)的實驗組；上方的nrf2、dapi和merge分別表示nrf2為核轉(zhuǎn)錄因子，dapi為可與dna結(jié)合的熒光染料，merge是兩種熒光照片的疊加。

圖7顯示木犀草素誘導(dǎo)睪丸支持細胞nrf2下游抗氧化酶基因的表達(a)gstamrna表達水平；(b)gclcmrna表達水平；(c)ho-1mrna表達水平；(d)nqo1mrna表達水平，其中“#”表示與正常對照組相比p<0.05，“##”表示與正常對照組相比p<0.01；“*”表示與模型組相比p<0.05，“**”表示與模型組相比p<0.01，其中過氧化氫是指采用過氧化氫處理的模型組。

圖8顯示木犀草素對雷公藤甲素導(dǎo)致睪丸指數(shù)降低的影響，其中“#”表示與正常對照組相比p<0.05；“*”表示與模型組相比p<0.05。

圖9顯示睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察木犀草素對雷公藤甲素導(dǎo)致睪丸組織形態(tài)損傷的保護作用，其中a:正常組，b：雷公藤模型組，c：木犀草素組，d：陽性藥對照組。

圖10顯示木犀草素對雷公藤甲素?fù)p傷支持細胞血睪屏障功能的保護作用，其中“##”表示與正常對照組相比p<0.01；“**”表示與模型組相比p<0.01；圖中treatment表示在培養(yǎng)第四天時，加入藥物干預(yù)培養(yǎng)。

圖11顯示木犀草素對支持細胞血睪屏障功能相關(guān)蛋白表達的影響，其中每個膠條左邊顯示了蛋白條帶的名稱，上方顯示了各細胞處理過程中木犀草素和雷公藤甲素的濃度。

具體實施方式

小鼠睪丸支持細胞tm4(縮寫為tm4細胞)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc細胞庫)，該細胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)方法：采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，置于37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)。基礎(chǔ)培養(yǎng)液是含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)液。

40只雄性小鼠，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，實驗動物生產(chǎn)許可證：scxk(蘇)2017-0001。

在本發(fā)明中，將木犀草素、陽性藥槲皮素和雷公藤甲素(購自上海源葉生物科技有限公司，純度98％)均溶于含有0.1％二甲基亞砜dmso的基礎(chǔ)培液中，然后加入到tm4細胞中進行干預(yù)。

實施例1木犀草素對過氧化氫誘發(fā)的睪丸支持細胞損傷的保護作用

將對數(shù)期tm4細胞接種至96孔培養(yǎng)板中(5000個/孔)，貼壁培養(yǎng)24h后，分別采用木犀草素(2.5、5和10μmol/l)或者陽性藥槲皮素(5μmol/l)干預(yù)保護12和24h后，加入h2o2(600mm)損傷2h后棄去培養(yǎng)基，模型組中不加入木犀草素、槲皮素，只加入h2o2；正常對照組中不加入木犀草素、槲皮素，也不加入h2o2。采用mtt法檢測正常對照組、模型組及有藥物干預(yù)的實驗組的細胞活力。具體操作：每孔加入0.5g/l的mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)溶液10μl，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。棄去細胞上清，加入二甲基亞砜dmso(150μl/孔)，震搖10min，多功能酶標(biāo)儀于492nm處測定每孔的吸光度，實驗重復(fù)3次。

實驗組細胞存活率計算方法：細胞存活率(％)＝實驗組吸光度/正常對照組吸光度×100％

實驗結(jié)果由圖1所示：在一定濃度范圍(2.5μmol/l～10μmol/l)內(nèi)，隨著木犀草素治療濃度的升高，過氧化氫對tm4細胞存活率的抑制作用不斷減弱；5μmol/l的木犀草素干預(yù)24h對過氧化氫誘導(dǎo)的睪丸支持細胞損傷的保護作用與陽性藥槲皮素?zé)o顯著性差異，而5μmol/l木犀草素干預(yù)12h下細胞存活率顯著地高于陽性藥對照組。結(jié)果提示，木犀草素能夠?qū)2o2誘導(dǎo)的tm4細胞損傷有顯著的抑制作用，說明木犀草素對睪丸支持細胞的氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮著顯著地保護作用，且5μmol/l的木犀草素效果要略好于陽性藥。

實施例2木犀草素對雷公藤甲素誘發(fā)的睪丸支持細胞損傷的保護作用

將對數(shù)期tm4細胞接種至96孔培養(yǎng)板中(5000個/孔)，培養(yǎng)24h后。設(shè)置實驗組、陽性藥對照組、模型組和正常組，各組的處理方法如下：實驗組分別采用木犀草素(2.5、5和10μmol/l)干預(yù)保護12和24h后，加入雷公藤甲素(300mm)損傷24h后棄去培養(yǎng)基；陽性藥對照組采用槲皮素(5μmol/l干預(yù)保護12和24h后，加入雷公藤甲素(300mm)損傷24h后棄去培養(yǎng)基；模型組不加藥物干預(yù)保護，只加入雷公藤甲素；正常組不加入任何試劑。采用mtt法檢測正常組、模型組及有藥物干預(yù)的實驗組的細胞活力。具體操作：每孔加入0.5g/l的mtt溶液10μl，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。棄去細胞上清，加入二甲基亞砜dmso(150μl/孔)，震搖10min，多功能酶標(biāo)儀于492nm處測定每孔的吸光度，實驗重復(fù)3次。

實驗組細胞存活率計算方法：細胞存活率(％)＝實驗組吸光度/正常對照組吸光度×100％

結(jié)果由圖2所示：2.5、5和10μmol/l的木犀草素與模型組相比均存在顯著性差異，且中濃度5μmol/l的木犀草素對雷公藤甲素誘導(dǎo)睪丸支持細胞損傷的保護作用與陽性藥槲皮素相當(dāng)，無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果提示，木犀草素能夠有效地逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素誘導(dǎo)的tm4細胞損傷，提高細胞存活率。

實施例3木犀草素對過氧化氫損傷睪丸支持細胞凋亡率的影響

采用annexinv-fitc/pi細胞凋亡檢測試劑盒(中國凱基)檢測不同濃度的木犀草素對tm4細胞凋亡率的影響。該試劑盒包括bindingbuffer、annexinv-fitc和propidiμmiodide染色液。

將2ml(1×10⁵個/ml)tm4細胞接種至6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h。設(shè)置實驗組、陽性藥對照組、模型組和正常組，各組的處理方法如下：實驗組分別采用木犀草素(2.5、5和10μmol/l)干預(yù)保護24h后，加入h2o2(600mm)損傷2h；陽性藥對照組采用陽性藥槲皮素(5μmol/l)干預(yù)保護24h后,加入h2o2(600mm)損傷2h；模型組不加入藥物干預(yù)保護，只加入h2o2；正常組不加入木犀草素、槲皮素，也不加入h2o2。處理后，棄去培養(yǎng)基使用不含edta的胰酶消化并收集細胞，pbs清洗細胞2次，500μlbindingbuffer重懸細胞。加入5μlannexinv-fitc混勻后，加入5μlpropidiμmiodide染色液并于室溫避光反應(yīng)5min，立即使用流式細胞儀檢測分析。

實驗結(jié)果如圖3所示：h2o2干預(yù)tm4細胞2h后，其凋亡率(早期凋亡與晚期凋亡的總和)為41.3％，而2.5、5和10μmol/l木犀草素預(yù)處理的tm4細胞凋亡率明顯降低，分別為33.8、27.8和19.4％，呈現(xiàn)濃度依賴性；5μmol/l的木犀草素對過氧化氫誘導(dǎo)的睪丸支持細胞損傷的保護作用與陽性藥槲皮素相當(dāng)。

實施例4木犀草素對過氧化氫導(dǎo)致的睪丸支持細胞產(chǎn)生ros的影響

將2ml(1×10⁵個/ml)tm4細胞接種至6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，實驗組分別采用2.5、5和10μmol/l的木犀草素干預(yù)保護，陽性藥對照組采用陽性藥槲皮素(5μmol/l)干預(yù)保護，模型組和正常組不加入任何藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，實驗組、陽性藥對照組和模型組加入h2o2(300mm)損傷2h后棄去培養(yǎng)基，正常組中不加入h2o2。各組使用不含edta的胰酶消化并收集細胞，pbs清洗細胞2次，去除細胞培養(yǎng)液，加入1ml濃度為10μm的dcfh-da(2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽)。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌三次，并用300μl無血清培養(yǎng)液重懸細胞。采用熒光顯微鏡觀察并使用熒光分光光度計檢測分析。

實驗結(jié)果如圖4所示：細胞經(jīng)h2o2處理后，細胞內(nèi)的ros水平顯著升高，木犀草素預(yù)處理后，tm4細胞內(nèi)ros水平顯著下降，且呈現(xiàn)濃度依賴性。結(jié)果表明木犀草素能一定程度地抑制細胞內(nèi)ros累積，逆轉(zhuǎn)h2o2對細胞的損傷，且比陽性藥物抑制ros累積的效果顯著。

實施例5木犀草素對過氧化氫導(dǎo)致的睪丸支持細胞線粒體膜電位降低的影響

采用jc-1試劑盒(江蘇碧云天)檢測不同濃度木犀草素對過氧化氫導(dǎo)致的睪丸支持細胞線粒體膜電位的影響，試劑盒中包含jc-1和incubationbuffer試劑。

將2ml濃度為1×10⁵個/ml的tm4細胞接種至6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h使細胞貼壁后，設(shè)置實驗組、陽性藥對照組、模型組和正常組，各組處理方法同實施例3。收集各組細胞上清，pbs清洗一次，用不含edta的胰酶消化細胞，混勻，2500rpm條件下離心5min，棄上清，收集細胞，用pbs清洗2次；取出預(yù)熱至37℃的1×incubationbuffer配置jc-1工作液：每500μl1×incubationbuffer中加入1μljc-1，充分混勻溶解；每管細胞樣品中加入500μljc-1工作液，吹打混勻，于培養(yǎng)箱孵育20min；2500rpm條件下離心，收集細胞，1×incubationbuffer清洗細胞2次，并用500μl1×incubationbuffer重新懸浮細胞，立即使用流式細胞儀檢測。

實驗結(jié)果如圖5所示，h2o2造成tm4細胞線粒體膜電位坍塌，隨著木犀草素濃度的升高，可以逆轉(zhuǎn)h2o2造成tm4細胞線粒體膜電位坍塌，且在5μmol/l的濃度下，木犀草素對線粒體膜電位的恢復(fù)效果要略好于陽性對照組。

實施例6木犀草素誘導(dǎo)睪丸支持細胞nrf2的核轉(zhuǎn)錄

取對數(shù)生長期tm4細胞，用0.25％胰酶溶液消化，以5×10⁴/ml細胞均勻接種于激光共聚皿。接種細胞于激光共聚焦小皿中，實驗組采用濃度為5μm的木犀草素干預(yù)24小時后，加入h2o2(300mm)損傷30min；h2o2干預(yù)組只加入h2o2(300mm)損傷30min；正常對照組不加任何試劑。棄去培養(yǎng)基，pbs清洗兩遍，4％多聚甲醛固定20min，pbs清洗3次，每次5min，5％牛血清白蛋白(bsa)溶液封閉30min，一抗(nrf2的一抗，美國abcam公司)4度過夜，pbs清洗后，熒光二抗(dylight488-conjugatedaffini-puregoatanti-rabbitlggsecondaryantibodies，江蘇碧云天公司)37度孵育30min，pbs清洗，dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色10min，pbs清洗后，加入抗熒光淬滅劑(江蘇碧云天公司)，激光共聚焦觀察。

實驗結(jié)果如圖6所示，與正常對照組相比，h2o2干預(yù)抑制了轉(zhuǎn)錄因子nrf2(nf-e2-relatedfactor2)的核轉(zhuǎn)位,木犀草素可以增強nrf2的核轉(zhuǎn)位。提示木犀草能夠通過激活nrf2核轉(zhuǎn)錄增強tm4細胞抗氧化作用。

實施例7木犀草素誘導(dǎo)睪丸支持細胞nrf2下游抗氧化酶基因的表達

取對數(shù)生長期tm4細胞，用0.25％胰酶溶液消化，以2×10⁵/ml細胞均勻接種于6孔培養(yǎng)板，設(shè)置實驗組、陽性藥對照組、模型組和正常組。實驗組采用濃度為2.5、5和10μmol/l的木犀草素干預(yù)24小時后，加入h2o2(300mm)損傷30min；陽性藥對照組采用陽性藥槲皮素(5μmol/l)干預(yù)保護24h后，加入h2o2(300mm)損傷30min；模型組不加藥物干預(yù)保護，只加入h2o2；正常對照組不加任何試劑。處理完畢后，棄去培養(yǎng)基，加入trizol試劑(takara公司)，反復(fù)吸吹，之后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫放置5min。加入0.1ml氯仿，振蕩混勻，室溫放置2～3min。4℃，12000r/min,離心15min。移上層水相至另一離心管中，加入250μl異丙醇，顛倒混勻后，室溫放置15min。4℃、12000r/min，離心10min。除去上清液，用75％乙醇溶液洗滌。室溫晾干5min。加入30μldepc水，充分溶解rna。提取的rna-80℃凍存?zhèn)溆?。采用abm公司的5xall-in-onertmastermix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cdna。參照abm公司的evagreen2xqpcrmastermix-icycler說明書,以gapdh為內(nèi)參，使用美國bio-rad公司cfx96touch熒光定量pcr分析儀進行pcr反應(yīng)(引物序列見表1)分析融解曲線，計算ct值。根據(jù)每個基因的ct值,使用2^-△△ct法計算出各個基因的相對表達量。

表1引物序列

結(jié)果如圖7所示，h2o2可顯著降低tm4細胞nrf2靶基因nqo1(還原型輔酶/醌氧化還原酶)、ho-1(血紅素加氧酶1)、gsta(α-谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)和gclc(谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基)的基因表達，而木犀草素預(yù)處理后上調(diào)tm4細胞內(nèi)nqo1、ho-1、gsta和gclc基因mrna水平，且顯著高于h2o2模型組，且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時在相同濃度下，對nqo1、gsta、ho-1的作用均明顯高于陽性藥對照組。這一結(jié)果進一步說明木犀草素可以激活nrf2的核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)下游抗氧化酶和二相解毒酶的表達，發(fā)揮對睪丸支持細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。

實施例8木犀草素對雷公藤甲素誘發(fā)的大鼠睪丸組織損傷的保護作用

昆明種雄性小鼠40只,體重(25±2)g,將小鼠隨機分成4組,每組10只,即正常對照組、模型組、木犀草素組和槲皮素組。各組的具體給藥方式如下：正常對照組:口服灌胃生理鹽水(0.1ml/10g)，半小時后腹腔注射生理鹽水(0.1ml/10g)；模型組:口服灌胃生理鹽水(0.1ml/10g)，半小時后腹腔注射雷公藤甲素(給藥劑量為80μg/kg，給藥劑量為為0.1ml/10g)木犀草素組:口服灌胃木犀草素(20mg/kg，0.1ml/10g)，半小時后腹腔注射雷公藤甲素(80μg/kg，0.1ml/10g)；槲皮素組:口服灌槲皮素(20mg/kg，0.1ml/10g)，半小時后腹腔注射雷公藤甲素(80μg/kg，0.1ml/10g)；治療保護14天后，取出雙側(cè)睪丸,稱重并計算臟器指數(shù)，隨后用10％中性福爾馬林溶液(4％甲醛)固定,石蠟包埋,切片，he染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察,睪丸組織形態(tài)。

其中臟器指數(shù)的計算方法：臟器指數(shù)＝睪丸的重量除以小鼠體重

實驗結(jié)果顯示：首先，雷公藤甲素誘發(fā)了睪丸組織損傷，與正常組相比，睪丸指數(shù)顯著下降，木犀草素組可以顯著地抑制雷公藤甲素導(dǎo)致的睪丸指數(shù)的下降(圖8)且作用好于陽性藥對照組。其次，光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸組織切片he染色發(fā)現(xiàn)(圖9)：正常組小鼠睪丸生精細胞層次分明,從精原細胞至成熟精子各階段發(fā)育完好,管腔內(nèi)有大量精子；模型組小鼠曲精小管萎縮，整個曲精小管內(nèi)出現(xiàn)大面積空腔，組織結(jié)構(gòu)破壞，曲精小管周圍的間質(zhì)組織變少，支持細胞損傷，大量精子脫落；木犀草素組與陽性藥對照組均對睪丸組織的損傷有一定的逆轉(zhuǎn)作用。說明木犀草素可以有效地逆轉(zhuǎn)雷公藤甲素導(dǎo)致的睪丸組織損傷。

實施例9木犀草素對雷公藤甲素?fù)p傷支持細胞血睪屏障功能的保護作用

取對數(shù)生長期tm4細胞，用0.25％胰酶溶液消化，以1×10⁵/ml細胞均勻接種于覆蓋matrigel基質(zhì)膠、孔徑0.3μm的transwell培養(yǎng)小室中，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)4天。設(shè)置藥物干預(yù)實驗組，加入木犀草素(2.5，5，10μm)和雷公藤甲素100nm、模型組(雷公藤甲素100nm)和正常組(不加木犀草素和雷公藤甲素)，加藥物干預(yù)后再培養(yǎng)3天。在整個實驗期間，每隔24h采用細胞電阻儀，檢測經(jīng)上皮電阻值(ter)。

上皮電阻值的計算方法：ter(ωcm²)＝(tersample-terblank)×effectivemembranearea(cm²)。tersample：待測樣品值；terblank：空白值；effectivemembranearea：有效生長面積。

研究結(jié)果顯示(圖10)，隨著第四天雷公藤甲素的加入，模型組ter值與正常對照組相比開始出現(xiàn)差異，隨著時間的延長，模型組ter值不斷降低，說明支持細胞的屏障受到雷公藤甲素的損傷。而加入木犀草素干預(yù)培養(yǎng)后，可以抑制ter值的下降，隨著時間的延長，ter值仍呈上升趨勢，且具有濃度依賴。因此，本申請首次發(fā)現(xiàn)木犀草素具有保護血睪屏障功能的作用。

實施例10木犀草素對支持細胞血睪屏障功能相關(guān)蛋白功能的影響

1、蛋白質(zhì)提取：

取對數(shù)生長期的tm4，用0.25％胰酶溶液消化，以每孔細胞數(shù)2×10⁵個/ml接種于6孔板中。，貼壁培養(yǎng)24h后加入藥物干預(yù)，分別設(shè)置藥物干預(yù)實驗組，加入木犀草素(2.5，5或10μm)和雷公藤甲素100nm、模型組(雷公藤甲素100nm)和正常組(不加木犀草素和雷公藤甲素)培養(yǎng)24h后，按照細胞膜蛋白提取試劑盒步驟提取細胞膜蛋白。然后采用bca蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天)檢測不同劑量木犀草素干預(yù)24h后細胞中的蛋白含量。

2、westernblot實驗：

采取sds-page電泳分離上述提取到的蛋白質(zhì)：配制10％分離膠和4％濃縮膠，每孔上樣30μg蛋白，先80v電泳25min，接著在120v下電泳65min。sds-page電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到pvdf膜后，將pvdf膜用5％脫脂奶粉pbs緩沖液溶液封閉2小時，然后與1:1000稀釋的一抗(兔cx43，zo-1,occludin,claudin-11和gapdh抗體，美國cst公司)4℃孵育過夜。然后用含有0.1％tween20的pbs溶液洗膜3次，每次10min，再與1:1000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔igg，美國cst公司)室溫孵育2小時。用含有0.1％tween20的pbs溶液洗膜3次，每次10min。ecl法顯影，clinxscience化學(xué)發(fā)光成像儀成像，clinxchemiimageanalysis圖像分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。

westernblot結(jié)果顯示(圖11)：與正常組相比，雷公藤甲素的干預(yù)下調(diào)了cx43(縫隙連接蛋白cx43)、zo-1(緊密連接蛋白zo-1)、occludin(封閉蛋白occludin)及claudin-11(緊密連接蛋白claudin-11)的表達；而同時給予木犀草素干預(yù)后，cx43、zo-1、occludin及claudin-11蛋白的表達均隨著木犀草素濃度的增加而上調(diào)，說明木犀草素對這些蛋白的表達有一定逆轉(zhuǎn)作用且呈現(xiàn)出濃度依賴性，因此木犀草素能夠促進支持細胞血睪屏障功能相關(guān)蛋白的表達，具有保護血睪屏障功能的作用。