本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域,尤其是涉及一種羊膜干細(xì)胞凝膠及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
自體富血小板血漿(platelet-richplasma,prp)是自體血經(jīng)分離產(chǎn)生的血小板濃縮物,自體prp來源于自體,安全性能好,可從根本上排除了疾病傳播和免疫排斥等問題。大量臨床研究報(bào)道,prp含有大量的各種血小板源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子,具有促進(jìn)多種組織修復(fù)的作用,能促進(jìn)骨和軟組織的修復(fù)。prp促進(jìn)骨缺損修復(fù)可能主要基于以下兩種機(jī)制:一種為prp在激活劑作用下活化為富血小板凝膠(platelet-richgel,prg),其中含有大量纖維蛋白原,能封閉創(chuàng)面,促進(jìn)組織收縮和愈合;另一種為聚合過程中血小板收縮、脫顆粒釋放多種高濃度生長(zhǎng)因子,包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(tgf-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)和表皮生長(zhǎng)因子(egf)等,這些細(xì)胞生長(zhǎng)因子中最重要的是pdgf和tgf-β,prp的作用是多種生長(zhǎng)因子通過不同途徑形成一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),激活相應(yīng)基因表達(dá)來完成的,在組織修復(fù)與重建中起著重要作用:pdgf可刺激骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的有絲分裂,增加成骨細(xì)胞數(shù)量;還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂,促進(jìn)移植區(qū)的毛細(xì)血管生長(zhǎng),并增加膠原蛋白合成的能力;tgf-β則可促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖并抑制骨吸收。prg中其他生長(zhǎng)因子也同時(shí)具有良好的促進(jìn)骨與軟骨修復(fù)和再生的作用。因而國(guó)外許多發(fā)達(dá)國(guó)家已將prp用于臨床治療退化性關(guān)節(jié)炎,通過關(guān)節(jié)腔注射自體prp,治療有效率達(dá)到80%以上。所以,自體prp在生物醫(yī)學(xué)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景
羊膜干細(xì)胞來自人的羊膜,單層排列生長(zhǎng)在面向羊水的一面,呈上皮樣結(jié)構(gòu),每張人的羊膜約有1億個(gè)這種細(xì)胞。羊膜屬于胎盤組織,由受精卵發(fā)育至第8天的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化而來。目前已知,羊膜干細(xì)胞保留胚胎干細(xì)胞特性,能向三個(gè)胚層組織分化,具有較強(qiáng)的分化能力;具有較好的免疫耐受能力,移植時(shí)無需hla或基因配型;能夠分泌多種抗炎因子,具有很好的抗炎癥功能;因缺乏端粒酶,在細(xì)胞體內(nèi)不會(huì)增殖,也就不會(huì)致癌,因而移植是安全的;人的羊膜容易取得,能夠拿到大量細(xì)胞,制備工藝簡(jiǎn)單,質(zhì)量容易得到控制。羊膜干細(xì)胞的這些特征,完全能夠滿足干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)要求,具有臨床廣泛應(yīng)用的美好前景。
羊膜干細(xì)胞直接應(yīng)用于創(chuàng)面時(shí),其活性容易丟失,不能長(zhǎng)時(shí)間維持,效果不佳。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題,本發(fā)明提供一種高活性、活性維持時(shí)間長(zhǎng)、修復(fù)效果好的羊膜干細(xì)胞凝膠。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種羊膜干細(xì)胞凝膠,以重量份計(jì),由如下組分組成:
優(yōu)選地,所述的羊膜干細(xì)胞凝膠,以重量份計(jì),由如下組分組成:
優(yōu)選地,所述富血小板血漿來自用血細(xì)胞分離機(jī)直接采集的濃縮血小板(機(jī)采血小板)、靜脈采集的全血(抗凝血)經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板濃縮液(富漿法手工血小板)或商業(yè)富血小板血漿。
本發(fā)明還提供一種羊膜干細(xì)胞凝膠的制備方法,包括以下步驟:
(a)凝膠前驅(qū)體溶液的制備
將羊膜干細(xì)胞、富血小板血漿、甘油、殼聚糖、棕櫚酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去離子水、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、α-紅沒藥醇、異壬酸異壬酯、肉豆蔻酸異丙酯、n-羥甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯壓敏膠、環(huán)聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物和丙烯酸羥乙酯-丙烯酰二甲基?;撬徕c共聚物混合形成的親水共聚物制成水溶液即凝膠前驅(qū)體;
對(duì)于易溶于水的物質(zhì),直接溶解即形成水溶液;
對(duì)于不溶于水的物質(zhì),通過改變條件溶解,具體為冷凍研磨、消化溶解或加溫溶解;
(b)浸泡
在凝膠未形成之前,將羥乙基纖維素浸泡于所述前驅(qū)體溶液中;
(c)凝膠過程
經(jīng)過化學(xué)凝膠或物理凝膠形成羊膜干細(xì)胞凝膠。
本發(fā)明所述的羊膜干細(xì)胞凝膠在制備適用于軟/硬組織缺損、皮膚/粘膜難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等修復(fù)治療的基質(zhì)膠中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明的凝膠具有很好的修復(fù)功能和保濕功能,并可實(shí)現(xiàn)富血小板血漿和羊膜干細(xì)胞活性物質(zhì)的緩釋,羊膜干細(xì)胞的增殖效果好,活性高,活性維持時(shí)間長(zhǎng),微環(huán)境下具有更好的組織修復(fù)功能,對(duì)難愈傷口、軟骨損傷都有很好的效果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明一種羊膜干細(xì)胞凝膠作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
一種羊膜干細(xì)胞凝膠,以重量份計(jì),由如下組分組成:羊膜干細(xì)胞60份,富血小板血漿50份,甘油75份,殼聚糖60份,棕櫚酸12份,苯氧乙醇7份,三乙醇胺17份,谷胱甘肽5份,右旋糖酐7份,去離子水600份,聚丙烯酸鈉10份,透明質(zhì)酸鈉15份,α-紅沒藥醇5份,羥乙基纖維素10份,異壬酸異壬酯8份,肉豆蔻酸異丙酯3份,n-羥甲基丙烯酰胺5份,聚丙烯酸酯壓敏膠28份,環(huán)聚二甲基硅氧烷6份,丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物12份,丙烯酸羥乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸鈉共聚物5份。
所述富血小板血漿來自用血細(xì)胞分離機(jī)直接采集的濃縮血小板(機(jī)采血小板)、靜脈采集的全血(抗凝血)經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板濃縮液(富漿法手工血小板)或商業(yè)富血小板血漿。
所述羊膜干細(xì)胞凝膠的制備方法,包括以下步驟:
(a)凝膠前驅(qū)體溶液的制備
將羊膜干細(xì)胞、富血小板血漿、甘油、殼聚糖、棕櫚酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去離子水、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、α-紅沒藥醇、異壬酸異壬酯、肉豆蔻酸異丙酯、n-羥甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯壓敏膠、環(huán)聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物和丙烯酸羥乙酯-丙烯酰二甲基?;撬徕c共聚物混合形成的親水共聚物制成水溶液即凝膠前驅(qū)體;
對(duì)于易溶于水的物質(zhì),直接溶解即形成水溶液;
對(duì)于不溶于水的物質(zhì),通過改變條件溶解,具體為冷凍研磨、消化溶解或加溫溶解;
(b)浸泡
在凝膠未形成之前,將羥乙基纖維素浸泡于所述前驅(qū)體溶液中;
(c)凝膠過程
經(jīng)過化學(xué)凝膠或物理凝膠形成羊膜干細(xì)胞凝膠。
所述的羊膜干細(xì)胞凝膠在制備適用于軟/硬組織缺損、皮膚/粘膜難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等修復(fù)治療的基質(zhì)膠中的應(yīng)用。
為了進(jìn)一步證明本發(fā)明所述凝膠的療效,申請(qǐng)人還分別進(jìn)行了以下臨床試驗(yàn)及分析:
1、方法與資料
兩個(gè)試驗(yàn)中心共有200例患者入選,男女患者各100例,但由于觀察過程中1例男患者5例女患者失訪,2例男患者放棄治療,退出試驗(yàn),共8例患者脫落,有192例患者完成試驗(yàn)觀察。病例采集均為糖尿病皮膚潰瘍患者,年齡最小55歲,最大78歲,平均年齡66歲。192例患者分為兩個(gè)試驗(yàn)中心進(jìn)行試驗(yàn)觀察,試驗(yàn)中心1有試驗(yàn)組與對(duì)照組各52例,試驗(yàn)中心2有試驗(yàn)組與對(duì)照組各44例,其中試驗(yàn)組采用本發(fā)明的凝膠進(jìn)行治療,試驗(yàn)中心1對(duì)照組采用普通凝膠進(jìn)行治療,試驗(yàn)中心2對(duì)照組直接應(yīng)用羊膜干細(xì)胞進(jìn)行治療。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1不同試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療前后7天內(nèi)創(chuàng)面面積變化比較
表1:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后2天創(chuàng)面面積變化
表2:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后4天創(chuàng)面面積變化
表3:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后6天創(chuàng)面面積變化
表4:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后8天創(chuàng)面面積變化
表5:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后10天創(chuàng)面面積變化
表6:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后12天創(chuàng)面面積變化
表7:兩個(gè)試驗(yàn)中心治療組與對(duì)照組治療后14天創(chuàng)面面積變化
由表1至7可以看出,治療組在縮小創(chuàng)面面積方面明顯更優(yōu)于對(duì)照組。
安全性結(jié)果:未發(fā)現(xiàn)不良情況。
臨床試驗(yàn)結(jié)論:本發(fā)明所提供的一種羊膜干細(xì)胞凝膠可以有效促進(jìn)組織修復(fù),在修復(fù)糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面方面效果非常明顯,可以輔助治療糖尿病皮膚潰瘍。試驗(yàn)觀察期間未發(fā)現(xiàn)不良情況,對(duì)患者的各項(xiàng)常規(guī)檢查結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)異常,說明本組合物在臨床使用是安全的。
實(shí)施例2
一種羊膜干細(xì)胞凝膠,以重量份計(jì),由如下組分組成:羊膜干細(xì)胞52份,富血小板血漿45份,甘油72份,殼聚糖58份,棕櫚酸9份,苯氧乙醇6份,三乙醇胺15份,谷胱甘肽7份,右旋糖酐9份,去離子水630份,聚丙烯酸鈉8份,透明質(zhì)酸鈉13份,α-紅沒藥醇4份,羥乙基纖維素8份,異壬酸異壬酯9份,肉豆蔻酸異丙酯5份,n-羥甲基丙烯酰胺7份,聚丙烯酸酯壓敏膠24份,環(huán)聚二甲基硅氧烷8份,丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物11份。
所述富血小板血漿來自用血細(xì)胞分離機(jī)直接采集的濃縮血小板(機(jī)采血小板)、靜脈采集的全血(抗凝血)經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板濃縮液(富漿法手工血小板)或商業(yè)富血小板血漿。
所述羊膜干細(xì)胞凝膠的制備方法,包括以下步驟:
(a)凝膠前驅(qū)體溶液的制備
將羊膜干細(xì)胞、富血小板血漿、甘油、殼聚糖、棕櫚酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去離子水、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、α-紅沒藥醇、異壬酸異壬酯、肉豆蔻酸異丙酯、n-羥甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯壓敏膠、環(huán)聚二甲基硅氧烷和丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物混合形成的親水共聚物制成水溶液即凝膠前驅(qū)體;
對(duì)于易溶于水的物質(zhì),直接溶解即形成水溶液;
對(duì)于不溶于水的物質(zhì),通過改變條件溶解,具體為冷凍研磨、消化溶解或加溫溶解;
(b)浸泡
在凝膠未形成之前,將羥乙基纖維素浸泡于所述前驅(qū)體溶液中;
(c)凝膠過程
經(jīng)過化學(xué)凝膠或物理凝膠形成羊膜干細(xì)胞凝膠。
所述的羊膜干細(xì)胞凝膠在制備適用于軟/硬組織缺損、皮膚/粘膜難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等修復(fù)治療的基質(zhì)膠中的應(yīng)用。
實(shí)施例3
一種羊膜干細(xì)胞凝膠,以重量份計(jì),由如下組分組成:羊膜干細(xì)胞54份,富血小板血漿42份,甘油65份,殼聚糖55份,棕櫚酸8份,苯氧乙醇5份,三乙醇胺13份,谷胱甘肽6份,右旋糖酐8份,去離子水650份,聚丙烯酸鈉7份,透明質(zhì)酸鈉12份,α-紅沒藥醇3份,羥乙基纖維素5份,異壬酸異壬酯9份,肉豆蔻酸異丙酯4份,n-羥甲基丙烯酰胺6份,聚丙烯酸酯壓敏膠26份,環(huán)聚二甲基硅氧烷9份,丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物10份,丙烯酸羥乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸鈉共聚物3份。
所述富血小板血漿來自用血細(xì)胞分離機(jī)直接采集的濃縮血小板(機(jī)采血小板)、靜脈采集的全血(抗凝血)經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板濃縮液(富漿法手工血小板)或商業(yè)富血小板血漿。
所述羊膜干細(xì)胞凝膠的制備方法,包括以下步驟:
(a)凝膠前驅(qū)體溶液的制備
將羊膜干細(xì)胞、富血小板血漿、甘油、殼聚糖、棕櫚酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去離子水、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、α-紅沒藥醇、異壬酸異壬酯、肉豆蔻酸異丙酯、n-羥甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯壓敏膠、環(huán)聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物和丙烯酸羥乙酯-丙烯酰二甲基?;撬徕c共聚物混合形成的親水共聚物制成水溶液即凝膠前驅(qū)體;
對(duì)于易溶于水的物質(zhì),直接溶解即形成水溶液;
對(duì)于不溶于水的物質(zhì),通過改變條件溶解,具體為冷凍研磨、消化溶解或加溫溶解;
(b)浸泡
在凝膠未形成之前,將羥乙基纖維素浸泡于所述前驅(qū)體溶液中;
(c)凝膠過程
經(jīng)過化學(xué)凝膠或物理凝膠形成羊膜干細(xì)胞凝膠。
所述的羊膜干細(xì)胞凝膠在制備適用于軟/硬組織缺損、皮膚/粘膜難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等修復(fù)治療的基質(zhì)膠中的應(yīng)用。
實(shí)施例4
一種羊膜干細(xì)胞凝膠,以重量份計(jì),由如下組分組成:羊膜干細(xì)胞45份,富血小板血漿35份,甘油55份,殼聚糖50份,棕櫚酸6份,苯氧乙醇4份,三乙醇胺8份,谷胱甘肽8份,右旋糖酐10份,去離子水700份,聚丙烯酸鈉5份,透明質(zhì)酸鈉10份,α-紅沒藥醇2份,羥乙基纖維素4份,異壬酸異壬酯10份,肉豆蔻酸異丙酯6份,n-羥甲基丙烯酰胺8份,聚丙烯酸酯壓敏膠15份,環(huán)聚二甲基硅氧烷12份,丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物7份。
所述富血小板血漿來自用血細(xì)胞分離機(jī)直接采集的濃縮血小板(機(jī)采血小板)、靜脈采集的全血(抗凝血)經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板濃縮液(富漿法手工血小板)或商業(yè)富血小板血漿。
所述羊膜干細(xì)胞凝膠的制備方法,包括以下步驟:
(a)凝膠前驅(qū)體溶液的制備
將羊膜干細(xì)胞、富血小板血漿、甘油、殼聚糖、棕櫚酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去離子水、聚丙烯酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、α-紅沒藥醇、異壬酸異壬酯、肉豆蔻酸異丙酯、n-羥甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯壓敏膠、環(huán)聚二甲基硅氧烷和丙烯酸酯類/c10-30烷醇丙烯酸酯交聯(lián)聚合物混合形成的親水共聚物制成水溶液即凝膠前驅(qū)體;
對(duì)于易溶于水的物質(zhì),直接溶解即形成水溶液;
對(duì)于不溶于水的物質(zhì),通過改變條件溶解,具體為冷凍研磨、消化溶解或加溫溶解;
(b)浸泡
在凝膠未形成之前,將羥乙基纖維素浸泡于所述前驅(qū)體溶液中;
(c)凝膠過程
經(jīng)過化學(xué)凝膠或物理凝膠形成羊膜干細(xì)胞凝膠。
所述的羊膜干細(xì)胞凝膠在制備適用于軟/硬組織缺損、皮膚/粘膜難愈性損傷或潰瘍、關(guān)節(jié)軟骨退行性變、缺血性組織壞死等修復(fù)治療的基質(zhì)膠中的應(yīng)用。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié),而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下,能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此,無論從哪一點(diǎn)來看,均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定,因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。
此外,應(yīng)當(dāng)理解,雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述,但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案,說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見,本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體,各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合,形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。