本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，涉及一種改善學(xué)習(xí)記憶及治療神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物，尤其是涉及一種治療和緩解阿爾茨海默病、認(rèn)知功能障礙、血管性癡呆及其前期的血管性認(rèn)知損傷的藥物組合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一種臨床以進(jìn)行性記憶力下降，認(rèn)知功能減低，多伴有情緒人格改變的疾病。隨著我國(guó)人口老齡化的進(jìn)展及醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，ad越來(lái)越多被人們認(rèn)識(shí)到。流行病學(xué)顯示各國(guó)家發(fā)病率及患病率不同，與國(guó)家發(fā)達(dá)程度人民生活水平教育水平相關(guān)。國(guó)外有數(shù)據(jù)提示全球約有3650萬(wàn)癡呆患者，并且每年有770萬(wàn)新發(fā)癡呆患者，其中ad占50％-70％。中國(guó)是一個(gè)人口眾多的國(guó)家，60歲以上人口超過(guò)13％，ad的患病率在3％-5％。ad已成為我國(guó)重要的公共健康問(wèn)題。
對(duì)ad的研究，各國(guó)學(xué)者都在進(jìn)行不同的探索，但其病因病機(jī)仍然不很明確。目前存在的多種關(guān)于ad病理機(jī)制的假說(shuō)，如炎性反應(yīng)、β淀粉樣蛋白(β-amyloidaβ)級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)、tau蛋白異常磷酸化、氧化應(yīng)激假說(shuō)等，但是沒(méi)有一種假說(shuō)可以很好闡述ad的發(fā)生發(fā)展，其治療目前集中在對(duì)癥狀的緩解，雖然大量臨床研究證實(shí)目前藥物的有效性及安全性，但其長(zhǎng)期治療效果并不理想，而且價(jià)格昂貴，導(dǎo)致患者依從性較差。中醫(yī)以整體觀念和辨證論治為核心，對(duì)癡呆的治療有一定的優(yōu)勢(shì)，且副作用較小，依從性好，眾多醫(yī)家在臨床治療上有各自的經(jīng)驗(yàn)并取得一定療效。但目前臨床應(yīng)用尚不規(guī)范，作用機(jī)制不明確，運(yùn)用中醫(yī)中藥理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中藥治療ad，為中醫(yī)中藥治療ad提供理論依據(jù)。本發(fā)明研究?jī)?nèi)容受國(guó)家科技重大專項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制“改善老年性癡呆腦能量代謝障礙的中藥新藥天芪益智顆粒的研究”(013zx09103002-002)課題資助。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究設(shè)計(jì)紅景天、紅芪在制備治療阿爾茨海默病、認(rèn)知功能障礙、血管性癡呆及其前期的血管性認(rèn)知損傷藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明藥物組合物是由以下重量比組成：紅景天5～80重量份，紅芪3～60重量份；優(yōu)選地，紅景天10～60重量份，紅芪5～50重量份；優(yōu)選地，紅景天20～50重量份，紅芪10～40重量份；優(yōu)選地，紅景天30～40重量份，紅芪20～30重量份；優(yōu)選地，紅景天40重量份，紅芪5重量份。
本發(fā)明的目的還在于提供一種制備本發(fā)明藥物組合物制備方法，它包括以下步驟：
s1：按組分及重量比稱取原料；
s2：將原料混合均勻后，加入藥學(xué)上可接受的輔料制備成藥學(xué)上常用的藥物制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)制藥領(lǐng)域的常規(guī)方法制備成任何一種藥劑學(xué)上所述的劑型；藥物組合物可以通過(guò)口服、吸入或腸外給藥等方式用于患者。
所述的藥學(xué)上常用的藥物制劑類型包括：口服給藥時(shí)使用的片劑、泡騰片、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、糖漿、口服液等；在腸外給藥時(shí)使用的凍干粉針及注射液等。
所述的藥用輔料包括：淀粉、硬脂酸鎂、糊精和微晶纖維素。
該藥物組合物用于在制備改善學(xué)習(xí)記憶能力及緩解、治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病藥物中的用途。
該藥物組合物用于在制備治療和緩解阿爾茨海默病、認(rèn)知功能障礙、血管性癡呆及其前期的血管性認(rèn)知損傷藥物中的用途。
紅景天，為景天科紅景天屬植物紅景天，味苦，平，歸肺經(jīng)。主大熱、火創(chuàng)、身熱煩，邪惡氣?；?，主女人漏下赤白，輕身、明目。久服通神不老。《本草綱目》中記載：“紅景天，本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補(bǔ)諸不足”是“已知補(bǔ)益藥中所罕見(jiàn)”。《中藥大辭典》記載：紅景天“性寒，味甘澀?；钛寡宸沃箍?。治咳血，咯血，肺炎咳嗽。”取紅景天活血化瘀之功。仲景在傷寒論《蓄血證》中提到：“其人喜忘者,必有蓄血”，選用抵當(dāng)湯活血祛瘀，治療“喜忘”，提出活血通絡(luò)祛瘀是健忘的治法。紅景天為草木之上品，《四部醫(yī)典》中記載紅景天“性涼、清熱、滋補(bǔ)元?dú)狻?，不僅有活血之效，還有益氣之功，故選用紅景天活血化瘀。
紅芪是豆科植物多序巖黃芪的干燥根，與黃芪同科異屬，外皮色紅，故稱紅芪。紅芪性味甘，溫。歸肺、脾經(jīng)，有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的功效。紅芪最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》黃芪項(xiàng)下，《本草經(jīng)集注》云：“有赤色者，可作膏貼，用消癰腫，俗方多用，道家不須”，“赤色者”即指紅芪，古代常與黃芪通用。1977年版中國(guó)藥典中，紅芪收錄在黃芪項(xiàng)下，作為黃芪種類來(lái)源之一，1985年版中國(guó)藥典中，紅芪單列為一味中藥，具有和黃芪相同的功效和適用證。健忘是癡呆的首發(fā)癥狀之一，《靈樞·大惑論》曰：“上氣不足，下氣有余，腸胃實(shí)而心肺虛，虛則營(yíng)衛(wèi)留于下，久以時(shí)上，故善忘也”，張景岳認(rèn)為：心肺虛于上，營(yíng)衛(wèi)留于下，則神氣不能相周，故為善忘，陽(yáng)衰于上之兆也?！惫省吧蠚獠蛔恪笔巧仆牟C(jī)之一，紅芪為益氣之要藥，又因老年癡呆病程長(zhǎng)，久病入絡(luò)，取紅芪皮色紅入絡(luò)之意，選以紅芪補(bǔ)“上氣”。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明藥物組合物的劑量配比能提高紅景天和紅芪兩味中藥的療效而起到協(xié)同增效的作用，該劑量范圍與現(xiàn)有的劑量配比相比其療效更為優(yōu)越，且克服了常規(guī)用藥劑量的局限性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。
實(shí)施例1：
稱取原料紅景天100g，紅芪100g，加入輔料淀粉200g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例2：
稱取原料紅景天200g，紅芪100g，加入輔料淀粉300g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例3：
稱取原料紅景天100g，紅芪200g，加入輔料淀粉300g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例4：
稱取原料紅景天100g，紅芪300g，加入輔料淀粉400g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例5：稱取原料紅景天200g，紅芪300g，加入輔料淀粉500g制粒，硬脂酸鎂6g，糊精100g、微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例6：
稱取原料紅景天100g，紅芪400g，加入輔料淀粉500g制粒，硬脂酸鎂6g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例7：
稱取原料紅景天300g，紅芪400g，加入輔料淀粉600g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精150g，微晶纖維素150g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例8：
稱取原料紅景天250g，紅芪300g，加入輔料淀粉550g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精150g，微晶纖維素150g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例9：
稱取原料紅景天200g，紅芪250g，加入輔料淀粉500g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精130g，微晶纖維素130g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例10：
稱取原料紅景天100g，紅芪100g，加入輔料淀粉200g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例11：
稱取原料紅景天200g，紅芪100g，加入輔料淀粉300g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例12：
稱取原料紅景天100g，紅芪200g，加入輔料淀粉300g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例13：
稱取原料紅景天100g，紅芪300g，加入輔料淀粉400g制粒，硬脂酸鎂4g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例14：
稱取原料紅景天200g，紅芪300g，加入輔料淀粉500g制粒，硬脂酸鎂6g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例15：
稱取原料紅景天100g，紅芪400g，加入輔料淀粉500g制粒，硬脂酸鎂6g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例16：
稱取原料紅景天300g，紅芪400g，加入輔料淀粉600g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精150g，微晶纖維素150g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例17：
稱取原料紅景天250g，紅芪300g，加入輔料淀粉550g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精150g，微晶纖維素150g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例18：
稱取原料紅景天200g，紅芪250g，加入輔料淀粉500g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精130g，微晶纖維素130g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例19：
稱取原料紅景天5g，紅芪3g，加入輔料淀粉10g制粒，硬脂酸鎂1g，糊精2g，微晶纖維素2g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例20：
稱取原料紅景天80g，紅芪60g，加入輔料淀粉150g制粒，硬脂酸鎂10g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例21：
稱取原料紅景天10g，紅芪5g，加入輔料淀粉15g制粒，硬脂酸鎂2g，糊精10g，微晶纖維素10g，均勻制得顆粒，壓片，得到片劑。
實(shí)施例22：
稱取原料紅景天60g，紅芪50g，加入輔料淀粉110g制粒，硬脂酸鎂2g，糊精100g，微晶纖維素100g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例23：
稱取原料紅景天50g，紅芪40g，加入輔料淀粉90g制粒，硬脂酸鎂5g，糊精50g，微晶纖維素50g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例24：
稱取原料紅景天40g，紅芪5g，加入輔料淀粉50g制粒，硬脂酸鎂3g，糊精20g，微晶纖維素20g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
實(shí)施例25：
稱取原料紅景天30g，紅芪5g，加入輔料淀粉50g制粒，硬脂酸鎂3g，糊精20g，微晶纖維素20g，均勻制得顆粒，裝入膠囊，得到膠囊劑。
下面通過(guò)具體的藥學(xué)試驗(yàn)來(lái)證明本發(fā)明的有益效果：
一、本發(fā)明藥物組合物對(duì)阿爾茲海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
1.材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
本研究采用spf級(jí)4月齡雄性sd大鼠90只，體質(zhì)量190～220g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品鑒定研究院，動(dòng)物許可證號(hào)scxk(京)2014-0013。spf級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(屏障環(huán)境，scxk(京)2014-0008)，溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度50％±10％，大鼠編號(hào)后5只一籠飼養(yǎng)，維持飼料自由飲食，晝夜明暗交替。
1.2實(shí)驗(yàn)用藥
天芪溶液制備：以水提法制備紅景天、紅芪顆粒，生藥量為6.4g原藥材/g，由北京師范大學(xué)老年腦健康研究中心提供，以紅景天苷為質(zhì)控指標(biāo)，批號(hào)：20150913。稱取64g紅景天提取物、192g紅芪提取物(紅景天：紅芪＝1:3)溶于400ml純水中備用。其中中劑量組稀釋2倍，低劑量組稀釋4倍，濃度折合分別為0.64g/ml、0.32g/ml、0.16g/ml。按成人臨床用量24g原藥材/日，大鼠用藥量分別折合為3.2g/kg、1.6g/kg、0.8g/kg。
0.004g/ml石杉?jí)A甲溶液：石杉?jí)A甲片(哈伯因)由河南太龍藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)140930a，將2片石杉?jí)A甲片(0.1mg)溶解于25ml純水中。
10％水合氯醛溶液：10g水合氯醛溶解于100ml生理鹽水，麻醉大鼠以0.5ml/100g。
4％多聚甲醛溶液：40g多聚甲醛溶于800ml純水，加入少許naoh，磁力攪拌器加熱并攪拌，待溶質(zhì)全部溶解后定容至1000ml。
aβ1-42溶液：aβ1-421mg溶于100ul無(wú)菌0.9％生理鹽水中，4℃孵育24h，終濃度為10ug/ul。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1動(dòng)物模型的建立
90只sd大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分成6組，假手術(shù)對(duì)照組、ad模型組、陽(yáng)性藥(石杉?jí)A甲)組和天芪方高、中、低劑量組。
采用側(cè)腦室注射aβ1-42的方法建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型：75只sd大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于腦立體定位儀上，手術(shù)區(qū)消毒后沿正中線切開(kāi)頭皮，暴露顱骨，在前囟向右旁開(kāi)1.4mm、向后1.4mm處用顱骨鉆鉆開(kāi)顱骨，在開(kāi)孔處用微量注射器向下進(jìn)針4mm后，以1ul/min速度注射1ulaβ1-42溶液，留針3min后緩慢出針?？p合切口。15只假手術(shù)大鼠，操作方法同上，右側(cè)腦室注射1ul生理鹽水。
1.3.2給藥方法和劑量
假手術(shù)對(duì)照組、ad模型組：灌胃相同體積生理鹽水；
陽(yáng)性藥對(duì)照組：灌胃石杉?jí)A甲溶液；
天芪高劑量組：取配置好的天芪溶液24ml，灌胃該高劑量溶液。
天芪中劑量組：取天芪溶液4ml，加入去離子水20ml。灌胃該中劑量溶液。
天芪低劑量組：取天芪溶液2ml，加入去離子水22ml。灌胃該低劑量溶液。
1.3.3行為學(xué)觀察
1.3.3.1跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)
(1)訓(xùn)練階段：將大鼠頭背向洞口放入明室，置于測(cè)試箱內(nèi)自由活動(dòng)3min，待熟悉環(huán)境后接通電源5min。大鼠正常習(xí)性為向暗箱聚集，不會(huì)停留在明室內(nèi)，而暗箱內(nèi)通36v交流電，在暗箱內(nèi)大鼠受到電刺激后，會(huì)返回安全區(qū)即明室。多數(shù)動(dòng)物會(huì)再次進(jìn)入暗室，受到電刺激后會(huì)再次返回明室。紀(jì)錄5min內(nèi)大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))和首次返回明室的時(shí)間(潛伏期)為記憶成績(jī)。
(2)測(cè)試階段：訓(xùn)練結(jié)束24h后，再次將大鼠至于測(cè)試箱的明室，打開(kāi)電源，紀(jì)錄大鼠第一次離開(kāi)安全區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和錯(cuò)誤次數(shù)，即記憶測(cè)試成績(jī)。
1.3.3.2morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
試驗(yàn)進(jìn)行前將水迷宮內(nèi)注入高于平臺(tái)1cm左右的水，關(guān)閉室內(nèi)燈光并保持安靜。
(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠從非平臺(tái)所在的其他三個(gè)象限放入水池中，紀(jì)錄大鼠從入水到找到平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)，大鼠在平臺(tái)上站立5s后將大鼠取出。若大鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其放置在平臺(tái)上持續(xù)10s后取出。每只大鼠每天定時(shí)實(shí)驗(yàn)1次，連續(xù)5天。
(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：撤出平臺(tái)，將大鼠從平臺(tái)所在對(duì)角的象限放入水中，紀(jì)錄60s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)、停留在平臺(tái)所在象限和平臺(tái)對(duì)角象限的時(shí)間。
1.4統(tǒng)計(jì)分析方法
采用spss20.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用表示平均值。若方差齊，采用one-wayanova分析，兩兩比較采用one-wayanova-lsd分析；若方差不齊，采用kruskal-wallish檢驗(yàn)，兩兩比較采用one-wayanova-games-howell分析。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，p<0.05則有統(tǒng)計(jì)學(xué)異議。
2.結(jié)果
2.1.morris水迷宮試驗(yàn)
(1)定向航行試驗(yàn)
模型組逃避潛伏期在第三、四、五日，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(p<0.01)，提示其學(xué)習(xí)和記憶能力下降明顯。從第二日起，與模型組大鼠相比，陽(yáng)性藥組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短(p<0.01，p<0.05)，而從第三日起，各天芪治療組大鼠的逃避潛伏期也明顯短于模型組(p<0.01，p<0.05)，見(jiàn)表1。
表1.各組大鼠morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較
注：與假手術(shù)組比較，##p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
(2)空間探索試驗(yàn)
表2所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯減少，目標(biāo)對(duì)角象限停留時(shí)間長(zhǎng)明顯增多(p<0.01)。各組治療藥物均能減少大鼠在目標(biāo)對(duì)角象限停留時(shí)間，增多其穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間(p<0.01，p<0.05)。
表2.各組大鼠morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)比較
注：與假手術(shù)組相比，##p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
2.2避暗實(shí)驗(yàn)
與假手術(shù)組相比，模型組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)第一次被電擊時(shí)間即潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(p<0.01)。各藥物組大鼠潛伏期明顯長(zhǎng)于模型組(p<0.01)，各中藥組錯(cuò)誤次數(shù)減少，其中藥物中劑量組、高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)明顯少于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，低劑量組大鼠錯(cuò)誤次數(shù)少于模型組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
表3.各組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較
注：與假手術(shù)組比較，##p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
上述實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明藥物可明顯改善阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力。
二、本發(fā)明藥物組合物對(duì)阿爾茲海默病大鼠乙酰膽堿能系統(tǒng)的影響
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
同實(shí)驗(yàn)一。
1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥
同實(shí)驗(yàn)一。
1.2實(shí)驗(yàn)方法和步驟
1.2.1建立動(dòng)物模型
同實(shí)驗(yàn)一。
1.2.2大鼠腦組織取材
大鼠10％水合氯醛(0.45％/100g)腹腔麻醉后斷頭取腦，冰面上操作分離出腦組織，置于液氮中迅速冷凍，凍存管-80℃保存。
1.2.3蛋白提取
在1.5mlep管中加入預(yù)冷的pbs溶液1ml，稱取凍存大鼠腦組織50mg，用pbs溶液洗滌2次，3000rpm，5min離心，棄去pbs溶液，加入990ulripa裂解液和10ul蛋白酶抑制劑，在冰面上剪碎，勻漿器勻漿1min(冰面上操作)，冰浴10min，每隔5min漩渦振蕩30秒，在4℃低溫高速離心(14000rpm，10min)取上清液，0.5mlep管分裝，-80℃保存。
1.2.4蛋白濃度測(cè)定
(1)將bca試劑盒中試劑a與試劑b按50:1比例混勻制成工作液。
(2)取96孔板，在a2孔內(nèi)加入pbs溶液30μl，再加入bca標(biāo)準(zhǔn)液(4mg/μl)20μl混勻，即濃度為1600μg/μl。在b2-h2孔均加入pbs溶液25μl，在a2孔取液體25μl加入b2孔，從取b2孔液體25μl加入c2孔，繼續(xù)操作至g2孔，取g2孔液體后棄去，由此從a2-h2孔得到蛋白濃度依次為1600、800、400、200、100、50、25、0μg/ml。
(4)取蛋白樣品8μl，pbs溶液稀釋至80μl，取稀釋后樣品25ul加入到96孔板的樣品孔中，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。
(5)各孔加入200μlbca工作液，37℃孵育30min。
(6)將96孔板冷卻至室溫，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)562nm處的吸光值。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，按曲線方程計(jì)算出蛋白樣品濃度。
1.2.5乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定
(1)分別取蛋白樣品、標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液、純水0.5ml置于測(cè)定管(a)、標(biāo)準(zhǔn)管(b)、空白管(c)中。
(2)在a、b、c、對(duì)照管(d)中均加入底物緩沖液、顯色應(yīng)用液各0.5ml，充分混勻后37℃孵育6min。
(3)四管分別加入0.03ml抑制劑和0.1ml透明劑，在d管中加入蛋白樣品0.5ml。
(4)充分混勻后反應(yīng)15min，可見(jiàn)分光光度計(jì)412nm，0.5cm光徑(純水調(diào)零)測(cè)定各管吸光度值。
(5)按照以下公式計(jì)算乙酰膽堿酯酶樣品活性：
1.2.6乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定
(1)測(cè)定管、對(duì)照管均依次加入試劑一105ul、試劑二5ul、試劑三、試劑四、試劑五、試劑六各10ul。各管充分混勻后37℃孵育5min。
(2)測(cè)定管加入各組組織勻漿(5％)25ul，對(duì)照管加入煮沸處理的組織上清液25ul。充分混勻后37℃反應(yīng)20min后，置于100℃水域2min終止反應(yīng)。
(3)離心機(jī)4000rd/min離心10min后，每管取上清液500ul，均加入試劑七10ul，混勻靜置15min。
(4)用1cm光徑、2mm內(nèi)徑石英比色皿、可見(jiàn)分光光度計(jì)324nm(純水調(diào)零)測(cè)定各管吸光度值。
(5)按照以下公式計(jì)算乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶酶活性：
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用spss20.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用
2.結(jié)果
見(jiàn)表4
表4.各組大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性比較
注：與假手術(shù)組比較，##p＜0.01；與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射aβ后，大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶含量明顯降低，而乙酰膽堿脂酶活性升高(p<0.01)，間接反映了ad大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿的含量的變化。陽(yáng)性對(duì)照藥物石杉?jí)A甲是一種可逆性膽堿酯酶抑制劑，對(duì)乙酰膽堿酯酶有良好對(duì)親和力，能顯著降低ad大鼠ache活性，而對(duì)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性無(wú)影響。而本發(fā)明藥物同樣能降低乙酰膽堿酯酶的活性，提高大鼠ach含量，通過(guò)調(diào)控膽堿能系統(tǒng)改善大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。
三、本發(fā)明藥物不同劑量配伍對(duì)阿爾茲海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
基于實(shí)驗(yàn)一紅景天與紅芪的劑量比例1:3，進(jìn)行劑量篩選。
1.材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
同實(shí)驗(yàn)一。
1.2實(shí)驗(yàn)用藥
藥物制備：以水提法制備紅芪、紅景天顆粒，分別按紅景天：紅芪1:1，1:3，1：5，1:8，1:12，3:1，5:1，8:1，12：1配伍，給藥濃度均為0.32g/ml，給藥劑量1.6g/kg。
0.004g/ml石杉?jí)A甲溶液：石杉?jí)A甲片(哈伯因)由河南太龍藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)140930a，將2片石杉?jí)A甲片(0.1mg)溶解于25ml純水中。
10％水合氯醛溶液：10g水合氯醛溶解于100ml生理鹽水，麻醉大鼠以0.5ml/100g。
4％多聚甲醛溶液：40g多聚甲醛溶于800ml純水，加入少許naoh，磁力攪拌器加熱并攪拌，待溶質(zhì)全部溶解后定容至1000ml。
aβ1-42溶液：aβ1-421mg溶于100ul無(wú)菌0.9％生理鹽水中，4℃孵育24h，終濃度為10ug/ul。1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1動(dòng)物模型的建立
150只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分成150組，即正常組、模型組、假手術(shù)組、藥物紅芪顆粒、紅景天顆粒、紅景天與紅芪1:1，1:3，1：5，1:8，1:12，3:1，5:1，8:1，12:1組和陽(yáng)性藥(石杉?jí)A甲)組，造模方法同實(shí)驗(yàn)一。
1.3.2給藥方法和劑量
假手術(shù)對(duì)照組、ad模型組：灌胃生理鹽水；陽(yáng)性藥組：灌胃石杉?jí)A甲溶液；其余各組均按給藥濃度均為0.32g/ml，給藥劑量1.6g/kg。
1.3.3行為學(xué)觀察
1.3.3.1跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)
(1)訓(xùn)練階段：將大鼠頭背向洞口放入明室，置于測(cè)試箱內(nèi)自由活動(dòng)3min，待熟悉環(huán)境后接通電源5min。大鼠正常習(xí)性為向暗箱聚集，不會(huì)停留在明室內(nèi)，而暗箱內(nèi)通36v交流電，在暗箱內(nèi)大鼠受到電刺激后，會(huì)返回安全區(qū)即明室。多數(shù)動(dòng)物會(huì)再次進(jìn)入暗室，受到電刺激后會(huì)再次返回明室。紀(jì)錄5min內(nèi)大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))和首次返回明室的
時(shí)間(潛伏期)為記憶成績(jī)。
(2)測(cè)試階段：訓(xùn)練結(jié)束24h后，再次將大鼠至于測(cè)試箱的明室，打開(kāi)電源，紀(jì)錄大鼠第一次離開(kāi)安全區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和錯(cuò)誤次數(shù)，即記憶測(cè)試成績(jī)。
1.3.3.2morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
試驗(yàn)進(jìn)行前將水迷宮內(nèi)注入高于平臺(tái)1cm左右的水，關(guān)閉室內(nèi)燈光并保持安靜。
(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：將大鼠從非平臺(tái)所在的其他三個(gè)象限放入水池中，紀(jì)錄大鼠從入水到
找到平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)，大鼠在平臺(tái)上站立5s后將大鼠取出。若大鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其放置在平臺(tái)上持續(xù)10s后取出。每只大鼠每天定時(shí)實(shí)驗(yàn)1次，持續(xù)5天。
(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：撤出平臺(tái)，將大鼠從平臺(tái)所在對(duì)角的象限放入水中，紀(jì)錄60s內(nèi)大鼠
穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)、停留在平臺(tái)所在象限和平臺(tái)對(duì)角象限的時(shí)間。
1.4統(tǒng)計(jì)分析方法
同實(shí)驗(yàn)一。
2.結(jié)果
2.1.morris水迷宮試驗(yàn)
(1)定向航行試驗(yàn)：模型組逃避潛伏期在第三、四、五日，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(p<0.01)，提示其學(xué)習(xí)和記憶能力下降明顯。從第二日起，與模型組大鼠相比，陽(yáng)性藥組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短(p<0.01，p<0.05)，而從第三日起，各中藥治療組大鼠的潛伏期也明顯小于模型組(p<0.01，p<0.05)，見(jiàn)表5。
表5.各組大鼠morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較
注：與假手術(shù)組比較,##p＜0.01；與ad模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅芪顆粒、紅景天顆粒單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力改善不明顯。本發(fā)明藥物組合物后則能明顯提高大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)表明在相同給藥劑量，給藥濃度的條件下，均按給藥濃度均為0.32g/ml，給藥劑量1.6g/kg，紅景天與紅芪按劑量8:1配伍，具有顯著的協(xié)同增效作用。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出紅芪和紅景天組合后的技術(shù)效果比單獨(dú)使用紅芪或單獨(dú)使用紅景天的效果的總和更優(yōu)越。
在另一實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)觀察本發(fā)明藥物組合物不同劑量配比對(duì)阿爾茲海默病大鼠乙酰膽堿能系統(tǒng)的影響(實(shí)驗(yàn)材料、方法、步驟、測(cè)定方法及統(tǒng)計(jì)方法均同實(shí)驗(yàn)二)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天芪8:1組能明顯降低乙酰膽堿酯酶的活性，提高大鼠ach含量。該劑量配比效果明顯優(yōu)于其它劑量配比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示紅景天與紅芪按劑量按8:1配伍，具有顯著的協(xié)同增效作用。另外，在抗高脂血癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的5:1、8:1劑量配比具有一定程度的改善大鼠血清tc、tg、hdl-c和ldl-c的含量，具有一定程度的降血脂作用。
另外，本發(fā)明藥物的劑量配比對(duì)血管性癡呆或認(rèn)知功能障礙均具有較好的治療作用。