本發(fā)明涉及癌癥用藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種治療癌癥的藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：

菊科澤蘭屬植物紫莖澤蘭eupatoriumadenophorumspreng.，俗稱“敗馬草”、“黑莖草”、“臭草”、“霸王草”等，具有強(qiáng)大的生物活性。紫莖澤蘭，有作為民間草藥使用的記載，滇南民間取其莖葉煮水洗,治香港腳和稻田濕疹,也有以葉揉擦患處,能止血、止痛、消炎。目前對(duì)紫莖澤蘭的藥理研究較少。因此為了為了充分開(kāi)發(fā)紫莖澤蘭潛在藥用價(jià)值，控制入侵物種，變害為寶，本發(fā)明對(duì)紫莖澤蘭進(jìn)行深入的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物中的活性成分來(lái)源于紫莖澤蘭，能夠用于預(yù)防或治療癌癥。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種藥物組合物在制備預(yù)防或治療癌癥的藥物中的用途，為癌癥的預(yù)防或治療提供新的治療手段和思路，同時(shí)也開(kāi)發(fā)了紫莖澤蘭新的藥用價(jià)值。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種治療癌癥的藥物組合物，其包括紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

一種藥物組合物在制備預(yù)防或治療癌癥的藥物中的用途，其包括紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果例如包括：

本發(fā)明從紫莖澤蘭中分離純化得到具有抗癌功效的活性成分:紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙酰基-3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮、克拉維醇，這三種活性成分無(wú)論是單獨(dú)使用或是聯(lián)合使用，均具有很好的抗癌活性，其通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和阻滯癌細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮功效，可用于制備臨床抗癌藥物。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制備紫莖澤蘭石油醚萃取物的流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中制備化合物a、b、c的流程圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例一中化合物a、b、c與紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)肝癌細(xì)胞hepg2與正常肝細(xì)胞lo2細(xì)胞活力的影響圖，其中，縱坐標(biāo)為腫瘤細(xì)胞的百分抑制率，橫坐標(biāo)為給藥濃度；

圖4為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例一中化合物a、b、c與紫莖澤蘭石油醚萃取物細(xì)胞毒活性ic50值，其中，縱坐標(biāo)為ic50值；

圖5為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例二中紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞形態(tài)的影響圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例三中紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞周期的影響圖，其中，流式細(xì)胞術(shù)分析圖的橫坐邊是熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)是細(xì)胞數(shù)量；直方圖的橫坐標(biāo)是給藥濃度，縱坐標(biāo)是subg1期的占比；

圖7為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例四中紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞dna的影響圖；

圖8中(a)為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例五中紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；(b)為紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞jak2/stat3信號(hào)通路的影響。

以上圖中，norma表示正常組，cddp表示順鉑陽(yáng)性藥物組，ea-pe表示紫莖澤蘭石油醚萃取物，a表示2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮，b表示克拉維醇，c表示紫莖澤蘭內(nèi)酯。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本實(shí)施方式提供一種藥物組合物，其包括：紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

其中，2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮(化合物a)的結(jié)構(gòu)式為：

其中，克拉維醇(化合物b)的結(jié)構(gòu)式為：

其中，紫莖澤蘭內(nèi)酯(化合物c)的結(jié)構(gòu)式為：

進(jìn)一步的，藥物組合物包括紫莖澤蘭石油醚萃取物，其中，紫莖澤蘭石油醚萃取物的制備方法包括：采用乙醇-水混合溶液提取紫莖澤蘭，將所得到的紫莖澤蘭提取物用石油醚萃取，即得。這種提取方法工藝簡(jiǎn)單，出膏率高，所提取的提取物抗癌活性好，適合規(guī)?；a(chǎn)。

本實(shí)施方式還提供一種治療癌癥的藥物組合物的制備方法，其包括：

步驟s1:采用乙醇-水混合溶液提取紫莖澤蘭，將所得到的紫莖澤蘭提取物用石油醚萃取，得到紫莖澤蘭石油醚萃取物。

進(jìn)一步的，采用浸漬法提取?？蛇x的，用95％的乙醇溶液以料液比為1：7～9浸漬紫莖澤蘭2～4天。可選的，浸漬1～3次，每次2～4天。

步驟s2:采用硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫分離石油醚萃取物，得到紫莖澤蘭內(nèi)酯以及混合餾分。

可選的，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，得到紫莖澤蘭內(nèi)酯，和三個(gè)餾段(f1-f3)，以第一餾段為混合餾分(f1)。其中，石油醚和乙酸乙酯優(yōu)先使用60～90℃沸程規(guī)格的溶劑。

步驟s3:再次采用硅膠柱色譜，以丙酮-石油醚混合溶劑梯度洗脫分離混合餾分，得到2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮和克拉維醇。

進(jìn)一步的，以2％丙酮-石油醚為洗脫劑，采用硅膠柱色譜分離混合餾分(f1)，得到3個(gè)餾段(f1.1-f1.3)，繼續(xù)采用薄層層析法或hplc法制備得到克拉維醇和紫莖澤蘭內(nèi)酯。

本實(shí)施方式還提供一種藥物組合物在制備預(yù)防或治療癌癥的藥物中的用途，所述藥物組合物包括紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

發(fā)明人研究表明，紫莖澤蘭的石油醚提取物及上述三種活性成分具有優(yōu)良的抗癌活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡途徑和阻滯癌細(xì)胞周期的作用來(lái)起到抗癌活性的，可用于臨床抗癌用藥。

進(jìn)一步的，發(fā)明人經(jīng)細(xì)胞試驗(yàn)證實(shí)，該紫莖澤蘭的石油醚提取物及上述三種活性成分是通過(guò)影響jak-stat信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)所述癌細(xì)胞凋亡的。

jak-stat信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過(guò)程。其中，stat3的活性在細(xì)胞惡變過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。許多腫瘤來(lái)源細(xì)胞株都需要stat蛋白(特別是stat3)來(lái)保持轉(zhuǎn)變后的表現(xiàn)型，這些腫瘤來(lái)源細(xì)胞株包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌。

下面以肝細(xì)胞肝癌為例，進(jìn)行詳細(xì)論述：

許多肝細(xì)胞肝癌的危險(xiǎn)因素，包括hbv、hcv的感染、以及肝臟的脂肪變性都可以促進(jìn)stat3的活化。jak-stat信號(hào)通路的傳遞過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單。信號(hào)傳遞過(guò)程如下：細(xì)胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化，這使得與受體偶聯(lián)的jak激酶相互接近并通過(guò)交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。jak激活后催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，繼而這些磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)與周?chē)陌被嵝蛄行纬伞巴２次稽c(diǎn)”(dockingsite)，同時(shí)含有sh2結(jié)構(gòu)域的stat蛋白被招募到這個(gè)“停泊位點(diǎn)”。最后，激酶jak催化結(jié)合在受體上的stat蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的stat蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。

stat3在肝細(xì)胞肝癌經(jīng)常被持久性的激活，其在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生中是不可缺少的，它是肝細(xì)胞肝癌的主要致瘤轉(zhuǎn)錄因子。stat3的磷酸化及其下游基因bcl-2、bcl-xl、cyclind1、vegf的上調(diào)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的增殖，血管形成，侵襲轉(zhuǎn)移及免疫逃逸，而且活化的stat3對(duì)于肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的存活也是必不可少的。因此，stat3被作為肝細(xì)胞肝癌治療的一個(gè)非常重要的分子靶向目標(biāo)。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭石油醚萃取物以及三種活性成分能夠降低jak2蛋白與stat3蛋白的磷酸化水平，即通過(guò)調(diào)控jak-stat信號(hào)通路，抑制其下游腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)。

與此同時(shí)，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，該藥物組合物是通過(guò)影響線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的。bcl-2家族的表達(dá)和調(diào)控是影響線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素之一，其主要作用位點(diǎn)在線粒體膜上。細(xì)胞受到死亡信號(hào)刺激后，bcl-2家族中的促凋亡蛋白在蛋白酶作用下發(fā)生構(gòu)像變化，從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞器膜上，尤其是線粒體外膜上，并與細(xì)胞器膜上和膜內(nèi)的抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白喪失對(duì)凋亡的抑制作用，引起細(xì)胞器功能喪失和各種促凋亡因子的釋放，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。

bcl-2和bax分別是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，并且bcl-2是stat3經(jīng)典的靶基因表達(dá)蛋白。在正常肝組織中，bcl-2通常表達(dá)陰性，而bax表達(dá)陽(yáng)性。但在如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌與膀胱癌等惡性腫瘤中，都觀察到了bcl-2的上調(diào)與bax下調(diào)，并且細(xì)胞分化程度越低，這種趨勢(shì)更加明顯。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，該組合物能夠下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)bax蛋白的表達(dá)水平，從而降低bcl-2/bax的比值。

bcl-2/bax比值的改變，最終導(dǎo)致caspase家族引起的細(xì)胞凋亡。caspase家族是一類(lèi)能特異性識(shí)別天冬氨酸位點(diǎn)的半胱氨酸蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個(gè)過(guò)程。在線粒體細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡通路中，caspase家族參與凋亡信號(hào)的放大與凋亡效應(yīng)，通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式放大凋亡信號(hào)，并催化凋亡相關(guān)效應(yīng)蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。如在bcl-2家族的調(diào)控下，線粒體釋放凋亡活化因子1(apaf1)，apaf1結(jié)合細(xì)胞色素c(cytoc)、atp，并經(jīng)過(guò)自身構(gòu)象變化及自身活化，使apaf1n端形成一種表面結(jié)構(gòu)，可活化caspase8/9，再進(jìn)一步活化caspase3/6/7，最終caspase3/6/7催化一系列凋亡相關(guān)底物，引起細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，該組合物能夠增加caspase-9與caspase-3的活化水平，從而通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式放大凋亡信號(hào)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。

進(jìn)一步的，該藥物組合物是通過(guò)阻滯癌細(xì)胞周期來(lái)預(yù)防或治療癌癥的。

細(xì)胞周期調(diào)控是機(jī)體維持細(xì)胞狀態(tài)的另一重要手段。癌變細(xì)胞除了抵抗凋亡過(guò)程，往往還表現(xiàn)異常的增殖能力。如p53、brca1、rb、p16、p15以及p53、brca1的下游調(diào)控基因如p21、gadd45是細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)的重要組成部分。但在多數(shù)腫瘤發(fā)生過(guò)程中，這些抑癌基因多有基因改變而失活，造成細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能缺陷，最終結(jié)果是細(xì)胞獲得失控性增殖能力，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭石油醚萃取物以及三種活性成分能夠阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，使其停滯在g2期、或者m期，并且能夠誘導(dǎo)這兩類(lèi)癌細(xì)胞的凋亡。

由此說(shuō)明，該藥物組合物可以用于癌癥的治療，例如肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌?？蛇x的，用于肝癌的治療。

進(jìn)一步的，為了使該藥物快速、連續(xù)并在很長(zhǎng)一段時(shí)間里釋放活性成分，本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)公開(kāi)在那些本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制造。本實(shí)施方式的藥物的給藥途徑可以為口服、鼻吸入、或腸胃外給藥。包含該組合物的制劑可以是片劑、軟膠囊、硬膠囊、口服液、丸劑、栓劑、粉末、顆粒、乳劑、糖漿、氣霧劑、滅菌注射劑、和滅菌粉等。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”指當(dāng)化合物給人類(lèi)施用時(shí)該化合物是生理上可接受的，且不會(huì)發(fā)生胃腸道紊亂、頭暈等過(guò)敏反應(yīng)或者類(lèi)似這些過(guò)敏反應(yīng)的全身過(guò)敏反應(yīng)。

在本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的載體或輔料”包括但不限于：粘合劑(如微晶纖維素、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(如淀粉、蔗糖、葡萄糖和無(wú)水乳酸)、崩解劑(如交聯(lián)pvp、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、和低取代羥丙基纖維素)、潤(rùn)滑劑(硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、滑石、聚乙二醇、苯甲酸鈉)、潤(rùn)濕劑(如甘油)、表面活性劑(如十六烷醇)以及吸收促進(jìn)劑、矯味劑、甜味劑、稀釋劑、包衣劑等。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述：

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種藥物組合物，其包括紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

其制備方法包括：

如圖1所示，取紫莖澤蘭全株干燥粉末10kg，按料液比1:8(1kg藥材對(duì)應(yīng)8l的溶劑)用體積濃度為95％的乙醇浸漬3天，過(guò)濾取濾液，對(duì)濾渣采用同樣的操作浸提兩次，過(guò)濾合并三次提取的濾液，減壓濃縮得到紫莖澤蘭浸膏806g。按體積比1:10加水混懸，用三倍體積石油醚萃取樣品，石油醚萃取液減壓濃縮，回收溶劑蒸干，得到紫莖澤蘭石油醚萃取物182g。

如圖2所示，取100g紫莖澤蘭石油醚萃取物，經(jīng)硅膠柱(200-300目)層析，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物a：2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮(3.362g)與3個(gè)餾段(f1-f3)；f1經(jīng)硅膠柱層析,2％丙酮-石油醚洗脫得3個(gè)餾段(f1.1-f1.3)；f1.2以5％丙酮-苯為展開(kāi)劑進(jìn)行制備薄層層析得6個(gè)餾段(f1.2.1-f1.2.6)，f1.2.6以3％丙酮-二氯甲烷為展開(kāi)劑進(jìn)行制備薄層層析得化合物b：克拉維醇(85mg)；f1.2.5經(jīng)硅膠柱層析，2％丙酮-苯洗脫得化合物c：紫莖澤蘭內(nèi)酯(28mg)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種藥物組合物，其包括紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

其制備方法包括：

取紫莖澤蘭全株干燥粉末10kg，按料液比1:9(1kg藥材對(duì)應(yīng)9l的溶劑)用體積濃度為90％的乙醇浸漬4天，過(guò)濾取濾液，對(duì)濾渣采用同樣的操作浸提一次，過(guò)濾合并兩次提取的濾液，減壓濃縮得到紫莖澤蘭浸膏780g。按體積比1:9加水混懸，用四倍體積石油醚萃取樣品，石油醚萃取液減壓濃縮，回收溶劑蒸干，得到紫莖澤蘭石油醚萃取物176g。

取100g紫莖澤蘭石油醚萃取物，經(jīng)硅膠柱(200-300目)層析，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物a：2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮(3.24g)與3個(gè)餾段(f1-f3)；f1經(jīng)硅膠柱層析,2％丙酮-石油醚洗脫得3個(gè)餾段(f1.1-f1.3)；f1.2以3％丙酮-苯為展開(kāi)劑進(jìn)行制備薄層層析得6個(gè)餾段(f1.2.1-f1.2.6)，f1.2.6以6％丙酮-二氯甲烷為展開(kāi)劑進(jìn)行制備薄層層析得化合物b：克拉維醇(82mg)；f1.2.5經(jīng)硅膠柱層析，2％丙酮-苯洗脫得化合物c：紫莖澤蘭內(nèi)酯(24mg)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種藥物組合物，其包括紫莖澤蘭內(nèi)酯、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮或克拉維醇中的至少一種，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

其制備方法包括：

取紫莖澤蘭全株干燥粉末10kg，按料液比1:7(1kg藥材對(duì)應(yīng)7l的溶劑)用體積濃度為98％的乙醇浸漬2天，過(guò)濾取濾液，對(duì)濾渣采用同樣的操作浸提兩次，過(guò)濾合并三次提取的濾液，減壓濃縮得到紫莖澤蘭浸膏812g。按體積比1:11加水混懸，用兩倍體積石油醚萃取樣品，石油醚萃取液減壓濃縮，回收溶劑蒸干，得到紫莖澤蘭石油醚萃取物186g。

取100g紫莖澤蘭石油醚萃取物，經(jīng)硅膠柱(200-300目)層析，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯梯度洗脫，得到化合物a：2-乙酰氧基-3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮(3.43g)與3個(gè)餾段(f1-f3)；f1經(jīng)硅膠柱層析,2％丙酮-石油醚洗脫得3個(gè)餾段(f1.1-f1.3)；f1.2以5％丙酮-苯為展開(kāi)劑進(jìn)行制備薄層層析得6個(gè)餾段(f1.2.1-f1.2.6)，f1.2.6以3％丙酮-二氯甲烷為展開(kāi)劑進(jìn)行制備薄層層析得化合物b：克拉維醇(87mg)；f1.2.5經(jīng)硅膠柱層析，2％丙酮-苯洗脫得化合物c：紫莖澤蘭內(nèi)酯(29mg)。

實(shí)驗(yàn)例

下面結(jié)合藥效試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1～3中提供的紫莖澤蘭石油醚萃取物(ea-pe)和三種活性成分進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)，其中三種活性成分具體為：紫莖澤蘭內(nèi)酯(化合物c)、2-乙?；?3,4,6,11-四氫杜松烷-7-酮(化合物a)、克拉維醇(化合物b)。

實(shí)驗(yàn)例一紫莖澤蘭石油醚萃取物和三種活性成分對(duì)肝癌細(xì)胞hepg2與正常肝細(xì)胞lo2細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hepg2細(xì)胞株，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/ml，每孔0.2ml接種至96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔分別添加由含10％小牛血清rpmi1640液配制成的待測(cè)樣品0.2ml，使樣品濃度分別為5、10、25、50、100、150、200μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)24h與48h；每個(gè)濃度一式3孔，同時(shí)設(shè)不加測(cè)試樣品的實(shí)驗(yàn)對(duì)照和不加樣品和細(xì)胞的空白對(duì)照孔。達(dá)到給藥時(shí)間后每孔加入5μg/ml的mtt20ml繼續(xù)孵育4h，到達(dá)孵育時(shí)間后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入0.15mldmso，振搖30min，充分溶解細(xì)胞內(nèi)生成的紫色甲臜結(jié)晶，于550nm下測(cè)定每孔吸光度a值。lo2細(xì)胞的培養(yǎng)與給藥除給藥時(shí)間為24h外，其余操作同hepg2。

hepg2與lo2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率＝[1-(實(shí)驗(yàn)組a值-空白組a值)/(對(duì)照組a值-空白組a值)]×100％。使用spss19.0計(jì)算半數(shù)抑制濃度(ic50)。

結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4，化合物a、b、c與紫莖澤蘭石油醚萃取物在5-200μg/ml的濃度范圍內(nèi)，對(duì)肝癌細(xì)胞hepg2均顯示較好的活力抑制，也顯示出明顯的量效、時(shí)效關(guān)系，但對(duì)正常肝細(xì)胞lo2影響不大(圖3)?；衔颽、b、c與紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg224h的ic50分別為44.8、31.8、27.1和25.1μg/ml，48h的ic50分別為31.4、21.4、17.8和13.4μg/ml。上述各化合物以及紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)lo2細(xì)胞幾乎不顯示活力抑制，ic10皆大于200μg/ml。

實(shí)驗(yàn)例二、紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞形態(tài)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hepg2細(xì)胞，以5×10⁴個(gè)/孔的濃度接種入6孔板，培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的紫莖澤蘭石油醚萃取物(樣品濃度分別為10，30，50μg/ml)，加入空白液組(生理鹽水)作為陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h，顯微鏡明場(chǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定后吸棄，加入pbs清洗兩遍，每次3min，吸除液體，風(fēng)干。加入hoechst33258染色液覆蓋所有細(xì)胞。采用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

結(jié)果見(jiàn)圖5，兩個(gè)空白組的hepg2細(xì)胞呈現(xiàn)良好的貼壁性，總數(shù)多、界限清楚、細(xì)胞分布均勻、細(xì)胞核形態(tài)正常、呈圓形或不規(guī)則橢圓形、核質(zhì)分布均勻，細(xì)胞呈現(xiàn)均勻熒光。而hepg2細(xì)胞經(jīng)紫莖澤蘭提取物處理后，隨劑量的增加出現(xiàn)不同程度的凋亡，凋亡細(xì)胞特征逐步明顯。低劑量組細(xì)胞形態(tài)不統(tǒng)一，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，開(kāi)始出現(xiàn)凋亡小體；中劑量組貼壁細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，出現(xiàn)少量的凋亡小體，細(xì)胞核可見(jiàn)致密的顆粒性熒光；高劑量組貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核固縮，有較多的凋亡小體出現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)例三、紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二。細(xì)胞給藥培養(yǎng)24h后貼壁細(xì)胞與漂浮細(xì)胞一起收集，采用pbs洗2次，接著加入預(yù)先冷卻的75％乙醇固定制備成細(xì)胞懸浮液，放于-20℃過(guò)夜保存。固定的細(xì)胞懸液離心，采用pbs洗滌，于37℃下加入1mg/ml的rnasea共孵育1h，接著加入終濃度為50μg/ml的pi染液，過(guò)濾，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的dna，選擇氬離子激光為激發(fā)光源，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為488nm。以順鉑(cddp)為陽(yáng)性對(duì)照藥物，其操作同紫莖澤蘭石油醚萃取物。

結(jié)果見(jiàn)圖6，紫莖澤蘭石油醚萃取物給藥組(10、30、50μg/ml)各劑量下，hepg2周期均發(fā)生了明顯變化，隨劑量增加在g0/g1期不斷減少，g2/m期不斷增加，并且g1期前出現(xiàn)了程度不斷加大的凋亡峰(subg1)，表明紫莖澤蘭提取物可以阻滯肝癌細(xì)胞g2/m期，并且能誘導(dǎo)這兩種肝癌細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)例四、紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞dna的影響

細(xì)胞凋亡過(guò)程中，可發(fā)生特異性級(jí)聯(lián)生化反應(yīng)，其中最具特色的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活，此酶可作用于連接dna的核小體間區(qū)域,dna鏈被切割成180～200bp或其整倍數(shù)的片斷，抽提dna,經(jīng)瓊脂糖電泳可見(jiàn)梯狀電泳圖譜。

實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hepg2，以5×104個(gè)/孔的濃度接種入12孔板，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的樣品液于12孔板，再培養(yǎng)48h，后收集細(xì)胞，按照dna提取試劑盒的操作說(shuō)明提取樣本中dna。分別取上述的已提取dna樣品液20μl，加入4μl的loadingbuffer，5μl的marker，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，電壓設(shè)置為50v，電泳1h，凝膠成像系統(tǒng)攝像分析結(jié)果，發(fā)射波長(zhǎng)為530nm。以順鉑(cddp)為陽(yáng)性對(duì)照藥物，其操作同紫莖澤蘭石油醚萃取物。

結(jié)果見(jiàn)圖7，給藥組均出現(xiàn)了dna梯形條帶(dnaladder)，且隨著紫莖澤蘭提取物濃度的增加，條帶越來(lái)越清晰，上述結(jié)果清楚的顯示紫莖澤蘭提取物能誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞發(fā)生凋亡，使其細(xì)胞的dna雙鏈發(fā)生規(guī)律性的斷裂。

實(shí)驗(yàn)例五、紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2凋亡細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡時(shí)，伴隨一系列蛋白酶學(xué)的改變。bcl-2家族與caspase家族活性變化參與線粒體凋亡通路的啟動(dòng)與執(zhí)行過(guò)程。bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9為關(guān)鍵的參與分子，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)可以反應(yīng)藥物是否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞通過(guò)線粒體途徑凋亡。

細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞，加入一定濃度的樣品作用48h后，收集細(xì)胞液，pbs洗滌，加入細(xì)胞裂解液裂解，超聲粉碎，沸水浴10min，采用bca蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備濃縮膠和分離膠，采用12％sds-page凝膠電泳分離總蛋白，按照免疫印跡方法將膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，用5％脫脂奶粉溶液封閉過(guò)夜后，分別加入一抗anti-bax、anti-bcl-2、anti-cleaved-caspase-3、anti-caspase-9、anti-β-actin室溫孵育3h，tbst洗滌三次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h，tbst洗滌3次，后按照ecl的方法依次加入發(fā)光底物、曝光、顯影及定影，采用image軟件分析條帶。

結(jié)果見(jiàn)圖8(a)，hepg2細(xì)胞內(nèi)的一些重要蛋白的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，隨著紫莖澤蘭提取物給藥濃度的增加，bax、caspase-3表達(dá)水平上升，bcl-2的表達(dá)水平下降，bcl-2/bax的比值明顯降低。這一結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物是通過(guò)影響線粒體凋亡通路的相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗肝癌的作用。

實(shí)驗(yàn)例六、紫莖澤蘭石油醚萃取物對(duì)hepg2細(xì)胞jak2/stat3信號(hào)通路的影響

jak/stat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過(guò)程。組成型stat3由磷酸化的stat3二聚化形成，是stat3的活化形式，其異?；罨饕善渖嫌卧漠惓；罨捅磉_(dá)引起。多種酪氨酸激酶均可直接或間接的激活stat3，在jak2/stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中jak2是stat3的主要上游元件，jak2的磷酸化能激活stat3活性，因此，檢測(cè)jak2與stat3的磷酸化程度可以反應(yīng)藥物是否通過(guò)抑制jak2/stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞操作與免疫印跡方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)五，其中一抗使用anti-jak2、anti-ptyr1007/1008-jak2、anti-stat3、anti-ptyr705-stat3與anti-β-actin。

結(jié)果見(jiàn)圖8(b)，hepg2細(xì)胞內(nèi)jak2與stat3磷酸化水平都隨著紫莖澤蘭提取物給藥濃度的增加而降低，說(shuō)明紫莖澤蘭提取物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡通過(guò)影響jak2/stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，并且紫莖澤蘭提取物對(duì)stat3活化的抑制作用可能是通過(guò)抑制其上游jak2活化而造成的。

綜上，紫莖澤蘭提取物在體外抗癌活性研究中，顯示出良好的效果。紫莖澤蘭石油醚提取物能有效的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株發(fā)生凋亡，阻滯細(xì)胞周期在g2/m期，并且對(duì)正常肝細(xì)胞影響較小。在對(duì)其促凋亡的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭提取物可以增加bax的表達(dá)水平，降低bcl-2的水平，從而降低bcl-2/bax的比值，另上調(diào)caspase-9、caspase-3的水平，而導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在凋亡蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)bcl-2的降低，而bcl-2是jak2/stat3信號(hào)通路中典型的響應(yīng)蛋白，因此，發(fā)明人以jak2/stat3信號(hào)通路為靶點(diǎn)，進(jìn)一步探索紫莖澤蘭提取物促凋亡的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭提取物能夠呈劑量依賴性地降低jak2與stat3磷酸化水平，其抑制stat3活性可能是通過(guò)抑制上游jak2活化而造成的。由此可見(jiàn)，紫莖澤蘭提取物極具開(kāi)發(fā)成為抗癌藥物的潛力。

盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。