本發(fā)明屬于中醫(yī)藥技術(shù)，具體涉及一種中藥制劑的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

術(shù)后腹腔粘連是指盆、腹腔外科術(shù)后因腹膜損傷后修復(fù)期間形成的腹腔臟器或與腹壁間的纖維帶，本發(fā)病率高，據(jù)文獻(xiàn)報道上腹部手術(shù)后的發(fā)病率為93-100％，下腹部手術(shù)后的發(fā)病率為67-93％。本病一旦形成可引起一系列并發(fā)癥如腹痛、腹脹、腸梗阻等。甚至二次手術(shù)時會延長手術(shù)時間，增加腸及其他器官的損傷機(jī)率，給患者精神和經(jīng)濟(jì)上帶來雙重負(fù)擔(dān)。

常見臨床表現(xiàn)為患者術(shù)后出現(xiàn)慢性腹痛、腹脹、便秘，甚或是腸梗阻反復(fù)發(fā)作，部分患者會出“大網(wǎng)膜粘連綜合征”：患者感到切口周圍的慢性牽址痛，尤其是腹壁活動加大時更為明顯，主耍是腸管與大網(wǎng)膜和切口處有巧連導(dǎo)致腸管的運(yùn)動功能障礙，腸內(nèi)容物的阻力増加而致更為嚴(yán)重的還可出現(xiàn)劇烈腹痛、腹脹及便血等腸壞死的癥狀。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)試圖針對每個誘發(fā)腹腔粘連形成的因素，作為防治腹腔粘連的策略。主要以抑炎劑、抗凝劑、抗氧化劑、促纖維蛋白溶解劑、物理隔離材料類制劑、分子基因靶向制劑。豐富治療手段的涌現(xiàn)，亦反映出對抗腹腔粘連的難度。單一功效的抗粘連措施局限性強(qiáng)，比如抗炎劑在動物模型和臨床實(shí)驗(yàn)中藥效不一致；纖溶力強(qiáng)的制劑易引發(fā)出血，影響創(chuàng)面愈合，某些藥物還需要凝膠作為載體才能發(fā)揮抗粘連作用；材料類制劑發(fā)創(chuàng)傷前后干預(yù)療效截然迥異，價格昂貴，難以廣泛應(yīng)用于外科臨床；盡管部分材料類制劑已被批量生產(chǎn)，但制備復(fù)雜，需要止血，柔韌性差，復(fù)雜的固定技術(shù)等諸多缺點(diǎn)難以順應(yīng)腔鏡外科臨床需要。

有研究表明在腹腔粘連過程中，其產(chǎn)生多種刺激物質(zhì)使成纖維細(xì)胞活化、增殖，同時上調(diào)cd4表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞與cd4陽性細(xì)胞如t細(xì)胞、肥大細(xì)胞等相互作用，加強(qiáng)活化。因此，成纖維細(xì)胞增殖、活化在腹腔粘連過程中起到了重要作用。同時成纖維細(xì)胞的增殖，又分泌過多的細(xì)胞因子如ifn-β等致使白細(xì)胞聚集、增殖、滯留并抑制其凋亡、遷移，導(dǎo)致白細(xì)胞的持續(xù)浸潤，組織異常增生、瘢痕化。由此可見，成纖維細(xì)胞的增殖活化及相關(guān)因子異常分泌在腹腔粘連發(fā)生、發(fā)展及病癥增生、粘連中起重要作用。因此如何有效調(diào)控成纖維細(xì)胞成為腹腔粘連亟待解決的問題之一。本專利以對成纖維細(xì)胞調(diào)控為切入點(diǎn)，通過抑制腹腔成纖維細(xì)胞增殖，為臨床提供防治腹腔粘連提供參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種已知中藥制劑的新應(yīng)用，即通過抑制腹腔成纖維細(xì)胞增殖達(dá)到防治腹腔粘連。

技術(shù)方案：本申請所述的是一種由大黃、桃仁、芒硝、紅花、延胡索和萊菔子組成的中藥制劑用于抑制腹腔成纖維細(xì)胞增殖的應(yīng)用。

一種由大黃、桃仁、芒硝、紅花、延胡索和萊菔子組成的中藥制劑用于降低成纖維細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)水平的應(yīng)用。

一種由大黃、桃仁、芒硝、紅花、延胡索和萊菔子組成的中藥制劑作為有效成分，用于制備抑制腹腔成纖維細(xì)胞增殖藥物的應(yīng)用。

一種由大黃、桃仁、芒硝、紅花、延胡索和萊菔子組成的中藥制劑作為有效成分，用于制備降低成纖維細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)水平藥物的應(yīng)用。

所述中藥制劑包含以下重量份的各個組分：大黃1-20g、桃仁2-20g、芒硝2-20g、紅花1-20g、延胡索2-30g、萊菔子2-20g。

所述中藥制劑通過以下步驟制備得到：

(1)按照1:1:1:1的重量比稱取大黃、桃仁、延胡索和萊菔子，然后加飲片總量15倍的70％乙醇分兩次回流提取，每次2h，濾過，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，濃縮至無醇味；

(2)按照紅花：步驟(1)稱取的大黃為3:5的重量比稱取紅花，加入步驟(1)所得藥渣中，然后加飲片總量20倍水分三次煎煮，每次1小時，濾過，合并水煎液，再60℃將濾液濃縮至相對密度為1.09～1.11，冷卻，加乙醇至含醇量50％，攪勻，靜置48h，濾液回收乙醇；

(3)取步驟(2)所得上清液，按照芒硝：步驟(1)稱取的大黃為1:1的重量比稱取芒硝加入上清液中，在60℃縮至相對密度1.12～1.15，然后用生理鹽水配制成濃度為0.6g/ml給藥樣品液。

有益效果：本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，對由大黃、桃仁、芒硝、紅花、延胡索和萊菔子組成的中藥制劑進(jìn)行了更深層次的研究，發(fā)現(xiàn)上述中藥制劑可以降低成纖維細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)水平，從而抑制腹腔成纖維細(xì)胞增殖，為研制防治腹腔粘連的藥物提供了新的思路和前景。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2中各組大鼠腹腔粘連示意圖，其中①假手術(shù)組、②模型組、③干預(yù)組；

圖2為實(shí)施例2中各組大鼠腸組織masson染色結(jié)果(100×)示意圖，其中①假手術(shù)組、②模型組、③干預(yù)組。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本申請作出詳細(xì)說明。

實(shí)施例1中藥制劑的制備方法

由大黃，桃仁，延胡索，萊菔子所制成，大黃：桃仁：延胡索：萊菔子＝1:1:1:1，加飲片總量15倍的70％乙醇(95％乙醇的量＝150×70％÷95％)分兩次回流提取，每次2h，濾過，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，濃縮至無醇味。上述藥渣與紅花合并(紅花：大黃＝3:5)，加飲片總量20倍水分三次煎煮，每次1小時，濾過，合并水煎液，濾液濃縮至相對密度為1.09～1.11(60℃)，冷卻，加乙醇至含醇量50％，攪勻，靜置48h，濾液回收乙醇，取上清液加芒硝(芒硝：大黃＝1:1)縮至相對密度1.12～1.15(60℃)，備用。用生理鹽水配制成濃度為0.6g/ml給藥樣品液。

實(shí)施例2水煎液防治腹腔粘連評價

動物

健康雄性sd大鼠96只，體質(zhì)量220～250g，由南京青龍山動物繁殖場提供(spf級)，合格證號scxk(蘇)2017-0001。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。大鼠實(shí)驗(yàn)前于動物房適應(yīng)環(huán)境7d，室溫18～25℃，相對濕度65％～70％，自由采食和飲水，照明晝夜明暗交替。

儀器

realtimepcr儀(美國abisteponeplus)，垂直電泳設(shè)備電泳儀(美國bio-rad)，化學(xué)發(fā)光成像儀(美國bio-radchemidocxrs+)。核酸蛋白測定儀(美國lifetechnologiesqubit2.0)。

方法

將72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，干預(yù)組3組，每組24只。造模前各組大鼠禁食12h，不禁水。用10％水合氯醛腹腔注射(0.3ml/kg)麻醉，動物麻醉后仰臥位固定，腹部剪毛、消毒后，無菌操作下取前正中切口2cm進(jìn)腹，除假手術(shù)組外，其余各組回盲部右側(cè)面用什錦銼刀反復(fù)磨擦漿膜層至表面針尖狀出血點(diǎn)，形成約5cm×4cm的受損創(chuàng)面后納入腹腔；假手術(shù)組大鼠，用無齒鑷鉗夾將回盲部腸管拉出腹腔外，充分暴露3min后復(fù)位，各組逐層關(guān)腹，分籠飼養(yǎng)。

每只大鼠從造模開始到關(guān)腹，時間控制在5min，術(shù)中各項生命體征平穩(wěn)。造模后6h，干預(yù)組造模大鼠按體表面積換算后，分別給予實(shí)施例1制備所得中藥制劑6.0g/kg藥液灌胃。假手術(shù)組和模型組均予等容量生理鹽水灌胃，1次/d，共14d。

腹腔粘連評分及masson染色

分別于術(shù)后1、7、14d每組隨機(jī)各取8只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，劍突下“c”型切口進(jìn)腹，分別從粘連數(shù)目、粘連范圍、粘連強(qiáng)度五分級標(biāo)準(zhǔn)觀察粘連情況，由第三方根據(jù)phillips及bhatia分級標(biāo)準(zhǔn)記錄粘連得分，見表1。masson染色實(shí)施如下，腹腔粘連組織石蠟脫水，包埋；切片脫蠟至蒸餾水；weigert鐵蘇木精液染核10min；鹽酸乙醇分化；masson符合染液5至10min；蒸餾水沖洗；磷鉬酸5min后甩干；苯胺藍(lán)10min，蒸餾水稍洗；分化液分化20s，共兩次；蒸餾水2min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，鏡下拍照。

表1肉眼腹腔粘連分級標(biāo)準(zhǔn)

數(shù)據(jù)處理

用spss18.0統(tǒng)計軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用表示，采用單因素方差分析，然后再用post-hoc進(jìn)行分析，post-hoc用多重比較的最小顯著性差異校正進(jìn)行調(diào)整。p<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一般情況觀察

術(shù)后各組大鼠未出現(xiàn)死亡，腹部切口愈合良好，無紅腫、滲出、切口疝發(fā)生。術(shù)后24h，各組大鼠一般情況均差，不活動，少量進(jìn)食、飲水。術(shù)后2d，一般狀態(tài)尚可，活動量較前增加，進(jìn)食和飲水基本恢復(fù)正常。術(shù)后第3天起，腹部創(chuàng)面縫線逐漸脫落，活動恢復(fù)正常，進(jìn)食和水量正常。

大鼠腹腔粘連分級評分及masson染色結(jié)果

術(shù)后第1天，模型組粘連最顯著，假手術(shù)組未見粘連，其余各組均見粘連形成。術(shù)后第7天，干預(yù)組見粘連數(shù)目減少，疏松，未見血管生成。模型組粘連范圍增大，韌性較前有所增加，部分粘連偶見伴生血管。術(shù)后第14天，粘連范圍和第7天相比有所擴(kuò)大，韌性無明顯差異。各治療組和模型組相比較，不同程度改善腹腔粘連程度，其中干預(yù)組腹腔粘連評分存在顯著性差異(p＜0.01)。見表2及圖1。

表2各組各1d、7d、14d腹腔粘連級別評分(n＝8)

注：與假手術(shù)組比較，*p<0.01，與模型組比較，^#p<0.01。

術(shù)后第14日，masson染色觀察膠原纖維，鏡下膠原纖維形呈現(xiàn)藍(lán)色，肌纖維呈現(xiàn)淡紅色。假手術(shù)組局部少量呈淺藍(lán)色膠原纖維組織；模型組局部藍(lán)色深且組織間隙較小，提示存在大量膠原纖維及粘連。干預(yù)組膠原纖維增生減少。具體見圖2。

實(shí)施例3對成纖維細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)的影響試驗(yàn)

細(xì)胞

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞nih/3t3購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

主要試劑及其配制

trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量pcr試劑盒均購于大連寶生物工程有限公司。pcr槍頭和離心管均為一次性無rna酶產(chǎn)品；其它試劑均為分析純，購自南京化學(xué)試劑公司；

主要溶液配制

pbs緩沖液的配制：準(zhǔn)確稱量nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o3.48g、kh2po40.2g，依次溶解于1000ml超純水中，混勻分裝，高壓滅菌后置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

高糖dmem培養(yǎng)基：按照說明書進(jìn)行。每袋dmem粉劑先溶于950ml雙蒸水，用20ml雙蒸水沖洗包裝袋并入；加入3.7gnahco3，用雙蒸水補(bǔ)充至1000ml，磁力攪拌使之充分溶解。加入100iu/ml青霉素和100iu/ml鏈霉素。0.22μm的微孔濾器正壓過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们凹尤胩ヅＱ?經(jīng)56℃水浴30min滅活)(終濃度10％)。

細(xì)胞消化液：稱取250mg胰蛋白酶，20mgedta；溶于100mlpbs緩沖液中，攪拌溶解完全，0.22μm的微孔濾器過濾除菌，分裝，-20℃凍存。

儀器設(shè)備

超聲波清洗器，kq-500e型，江蘇昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)；

電子天平以及精密電子天平，均為上海天平儀器廠產(chǎn)品；

離心機(jī)，ld4-2a型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

低速自動平衡離心機(jī)，ldz5-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

三用恒溫水箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

磁力加熱攪拌器，79-1型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

立式蒸汽滅菌器，ls-b5ol型，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；

微量振蕩器，xk96-b型，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱，hg1-1-1(1a/1ad)，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；

5％co2培養(yǎng)箱，napco，311rel﹟5，usa；

倒置顯微鏡，th4-200型，日本olympus公司產(chǎn)品；

酶標(biāo)儀，jio-ket型，power-wave340，usa。

含藥血清的制備

清潔級sd大鼠24只，雌雄各半，體重為220-250g，南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供，許可證號碼：scxk(蘇)2017-0001。將大鼠隨機(jī)分為空白組、含藥血清組，每組6只。每日上午給藥前將大鼠禁食12h，含藥血清組將實(shí)施例1制備所得制劑按600g·l-1劑量給大鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3d?？瞻捉M僅給予以等體積生理鹽水灌胃，在最后一次給藥2h后，腹主動脈取血，取血后用頸椎脫臼法處死動物。血液置于10ml離心管內(nèi)，室溫放置1h，待充分凝血后，4℃放置過夜。3000rpm離心15min，分離血清，56℃水浴上放置30min，最后超凈工作臺用0.22μm微孔濾器濾過除菌，無菌分裝，密封后-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

含藥血清對nih/3t3細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)的影響

取對數(shù)生長期nih/3t3細(xì)胞以5×10⁵的密度接種于6孔板，24小時后予以加藥處理，分組方法同實(shí)施例2。加藥處理24h后，消化、離心，收集各組細(xì)胞，用實(shí)時熒光定量pcr法檢測各組細(xì)胞中變化。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

將研缽、金屬器械、玻璃器皿置于烤箱中180℃干烤4h，去除rna酶；將異丙醇、75％乙醇(0.1％depc水配制)放入4℃冰箱預(yù)冷；配制0.1％depc水：超純水中加入depc至濃度為0.1％，在攪拌器上攪拌至完全混勻，及看不到“油珠”為止，37℃生化培養(yǎng)箱中放置過夜，高壓蒸汽滅菌器上121℃滅菌1h，直至depc完全分解以避免影響下游實(shí)驗(yàn)，4℃保存?zhèn)溆?；eppendorf管(ep管)、槍頭、無粉手套、口罩等均為市售一次性無菌無酶耗材。

培養(yǎng)細(xì)胞總rna提取

常溫10000g離心1min收集10⁵培養(yǎng)細(xì)胞，加入1mltrizol試劑，渦旋震蕩裂解，室溫放置5min；加入200ul氯仿，手動顛倒劇烈混勻30s，室溫放置3min；在低溫高速離心機(jī)上，4℃，12000g離心15min；將上層水相輕輕轉(zhuǎn)入另一潔凈1.5mlep管中；加入500ul4℃預(yù)冷的異丙醇，手動顛倒輕輕混勻，室溫放置10min；在低溫高速離心機(jī)上，4℃，12000g離心10min,離心后可見白色膠狀沉淀即為rna；加入1ml預(yù)冷的75％乙醇(無菌0.1％depc水配制)，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4℃7500g離心5min，洗滌rna，棄上清；4℃7500g離心2min，重復(fù)洗滌rna，槍頭吸棄上清；室溫干燥5min；加入20ul無菌0.1％depc水，56℃助溶5min；在-76℃保存rna備用。

rna濃度、純度及完整性測定

吸取2μlrna，在微量核酸蛋白測定儀上進(jìn)行rna濃度、純度檢測，測得的a260/a280在1.8～2.0之間，表示rna純度高，rna經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，28s與18s區(qū)帶清晰集中，28s與18s比值大于2，則表明rna樣品未降解。

cdna合成

采用superquickrtcdna試劑盒合成cdna，反應(yīng)體系如下：總體系40μl；rna模板，2ul；primer，4ul；無菌0.1％depc水，16ul；5×buffer，8ul；dntp，8ul；rt，2ul。反應(yīng)條件如下：37℃，15min；85℃，5s；-76℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計與合成

根據(jù)ncbigenebank中目的基因序列，采用primer5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物公司合成，具體序列如下：

引物稀釋：將引物干粉在臺式小型高速離心機(jī)上短暫離心，加入滅菌ddh2o將引物稀釋成10um，渦旋震蕩混勻，短暫離心，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

real-timepcr

本實(shí)驗(yàn)所用儀器為stratagene公司mx3000p型號的real-timepcr擴(kuò)增儀。以模型組為對照，gapdh為參比基因，采用2^-δδct法進(jìn)行相對熒光定量pcr。

相對定量pcr(2^-δδct法)

real-timepcr反應(yīng)體系配制：取兩支潔凈1.5mlep管，根據(jù)反應(yīng)所需樣品孔數(shù)將real-timepcr各組分進(jìn)行預(yù)混，目的基因和參比基因各一支，分裝至八聯(lián)排pcr管中，每孔48μl，再加入cdna模板2μl，每個樣本每個基因平行做3孔。相對表達(dá)量計算公式：

f＝2^{-((待測樣本目的基因的平均ct值-待測樣本參比基因的平均ct值)-(待測樣本目的基因的平均ct值-待測樣本參比基因的平均ct值))}

上機(jī)檢測

打開熒光pcr儀，打開mxpro軟件，選擇相對定量實(shí)驗(yàn)類型“comparativequantitation(calibrator)”，先進(jìn)行板子設(shè)置：選中處理組設(shè)置孔的類型“unknown”和熒光通道sybr、rox→設(shè)置參比染料“rox”→選中對照組設(shè)置孔的類型“calibrator”和熒光通道sybr、rox→設(shè)置參比染料“rox”→選中設(shè)置孔的信息按鈕“assignassayname”定義基因顏色和名字→定義看家基因“normalizingassay”→設(shè)置復(fù)孔“replicatesymbol”，相同復(fù)孔設(shè)置為同一編號，即1、2、3等→最后設(shè)置關(guān)聯(lián)“assoc.symbol”,即把同一樣本來源設(shè)置為相同類型，如a、b、c等→設(shè)置反應(yīng)條件；再進(jìn)行反應(yīng)條件設(shè)置：95℃，10min；95℃，15s，62℃，60s，40個循環(huán)；溶解曲線部分：95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s；運(yùn)行程序。

數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)，用spssforwindows16.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以p<0.05認(rèn)為有顯著性差異，p<0.01為差異性非常顯著。

結(jié)果

采用比較2^-△△ct法分析細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna的表達(dá)量：即以管家基因β-actin作為內(nèi)參基因相對定量，以空白組細(xì)胞作為對照組，計算各組ⅲ型膠原蛋白mrna的△△ct值?！鳌鱟t＝實(shí)驗(yàn)組(ct目的基因－ct管家基因)－對照組(ct目的基因－ct管家基因)，以△△ct值為定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，則目的基因的量＝2^-△△ct。參照基因表達(dá)譜芯片分析，當(dāng)目的基因表達(dá)≥2倍，認(rèn)為該基因表達(dá)增高，若≤0.5倍認(rèn)為基因表達(dá)降低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，干預(yù)組ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)有降低趨勢。

表3不同組方對nih/3t3細(xì)胞ⅲ型膠原蛋白mrna表達(dá)的影響

注：*與空白組比較，有顯著性差異(p<0.01)。