本申請(qǐng)是2011年4月7日提交的題為“3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的藥物組合物和其給藥方法”的pct/us2011/031519號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段獲得的國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?01180027960.1。

本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1)的藥物組合物、制備這種組合物的方法和給予含有該化合物的藥物組合物的方法。

背景

cftr是在各種細(xì)胞類型中表達(dá)的camp/atp介導(dǎo)的陰離子通道，包括吸收和分泌上皮細(xì)胞，在這些細(xì)胞中，它調(diào)節(jié)陰離子穿過(guò)膜的流量，以及其它離子通道和蛋白的活性。在上皮細(xì)胞中，cftr的正常功能對(duì)于保持電解質(zhì)在整個(gè)身體(包括呼吸和消化組織)中的轉(zhuǎn)移是很關(guān)鍵的。cftr由大約1480個(gè)編碼蛋白的氨基酸組成，這種蛋白由串聯(lián)重復(fù)的跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，各自包含六個(gè)跨膜螺旋和一個(gè)核苷酸結(jié)合域。兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域通過(guò)帶有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的大的極性調(diào)節(jié)(r)域連接，這種位點(diǎn)調(diào)節(jié)通道活性和細(xì)胞運(yùn)輸（trafficking）。

已經(jīng)鑒定了編碼cftr的基因，并將其排序(參見gregory,r.j.等人(1990)nature347:382-386;rich,d.p.等人(1990)nature347:358-362),(riordan,j.r.等人(1989)science245:1066-1073)。這種基因的缺陷導(dǎo)致cftr的突變，從而導(dǎo)致囊性纖維化(“cf”)，這是在人類當(dāng)中最常見的致命性遺傳疾病。在美國(guó)，在每2,500個(gè)幼兒當(dāng)中，囊性纖維化影響大約一個(gè)幼兒。在常規(guī)美國(guó)人口中，高達(dá)一千萬(wàn)人攜帶缺陷基因的單個(gè)副本，但沒有明顯的有害影響。與此相反，帶有cf相關(guān)基因的兩個(gè)副本的個(gè)體出現(xiàn)虛弱和cf的致命后果，包括慢性肺疾病。

在患有囊性纖維化的患者中，在呼吸上皮中內(nèi)源性表達(dá)的cftr的突變導(dǎo)致頂端陰離子分泌降低，從而導(dǎo)致離子和流體輸送的失調(diào)。所導(dǎo)致的陰離子輸送的降低有助于粘液在肺中的積聚增加，并且伴有微生物感染，最終導(dǎo)致cf患者死亡。除了呼吸系統(tǒng)疾病之外，cf患者典型地具有胃腸問題和胰腺機(jī)能不全，如果未經(jīng)治療，會(huì)導(dǎo)致死亡。另外，患有囊性纖維化的大部分男性不能生育，并且在患有囊性纖維化的女性當(dāng)中，生育力降低。與cf相關(guān)基因的兩個(gè)副本的嚴(yán)重后果相反，帶有cf相關(guān)基因的單個(gè)副本的個(gè)體對(duì)霍亂和脫水(起因于腹瀉)的耐受性提高，這也許可以解釋cf基因在人群中相對(duì)頻繁出現(xiàn)的原因。

cf染色體的cftr基因的序列分析展現(xiàn)了導(dǎo)致各種疾病的突變(cutting,g.r.等人(1990)nature346:366-369;dean,m.等人(1990)cell61:863:870;和kerem,b-s.等人(1989)science245:1073-1080;kerem,b-s等人(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:8447-8451)。迄今為止，按照科學(xué)和醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)的報(bào)道，在cf基因中，已經(jīng)鑒定了導(dǎo)致1000種以上疾病的突變。最流行的突變是cftr氨基酸序列的508位缺失苯丙氨酸，并且通常稱為δf508-cftr。這種突變出現(xiàn)在大約70%的囊性纖維化的病例中，并且與嚴(yán)重疾病有關(guān)。其它突變包括r117h和g551d。

在δf508-cftr中缺失殘基508妨礙了未成熟（nascent）蛋白正確地折疊。這導(dǎo)致突變蛋白不能脫離er，從而不能輸送至質(zhì)膜。結(jié)果，存在于膜上的通道數(shù)目遠(yuǎn)比在表達(dá)野生型cftr的細(xì)胞中所觀察到的數(shù)目少。除了輸送受損之外，突變導(dǎo)致通道門控出現(xiàn)缺陷。膜中的通道數(shù)減少和門控缺陷一起導(dǎo)致陰離子穿過(guò)上皮的輸送降低，從而導(dǎo)致離子和流體輸送出現(xiàn)缺陷。(quinton,p.m.(1990),fasebj.4:2709-2727)。然而，研究表明，即使少于野生型的cftr，膜中δf508-cftr的數(shù)量減少是功能性的減少。(dalemans等人(1991),naturelond.354:526-528;denning等人，supra;pasykandfoskett(1995),j.cell.biochem.270:12347-50)。除了δf508-cftr之外，導(dǎo)致疾病的cftr的其它突變(其導(dǎo)致運(yùn)輸（trafficking）、合成和/或通道門控出現(xiàn)缺陷)可以被向上或向下調(diào)節(jié)，改變陰離子分泌，改變疾病發(fā)展和/或嚴(yán)重程度。

雖然cftr還輸送除了陰離子之外的各種分子，但很明顯，這種作用(輸送陰離子)代表了輸送離子和水穿過(guò)上皮的重要機(jī)制中的一個(gè)要素。其它要素包括：上皮na⁺通道，enac，na⁺/2cl^-/k⁺共同轉(zhuǎn)運(yùn)體，na⁺-k⁺-atp酶泵和基底外側(cè)膜k⁺通道(負(fù)責(zé)將氯吸收到細(xì)胞中)。

這些要素進(jìn)行合作，通過(guò)它們的選擇性表達(dá)，和在細(xì)胞內(nèi)定位，達(dá)到定向輸送穿過(guò)上皮。通過(guò)頂膜上存在的enac和cftr與細(xì)胞基底外側(cè)表面上表達(dá)的na⁺-k⁺-atp酶泵和cl^-通道的協(xié)調(diào)作用進(jìn)行氯吸收。氯從腔面的繼發(fā)性主動(dòng)運(yùn)輸導(dǎo)致胞內(nèi)氯的積聚，其然后通過(guò)cl^-通道被動(dòng)地脫離細(xì)胞，導(dǎo)致向量運(yùn)輸?；淄鈧?cè)表面上排列的na⁺/2cl^-/k⁺共同轉(zhuǎn)運(yùn)體、na⁺-k⁺-atp酶泵和基底外側(cè)膜k⁺通道和腔面上的cftr通過(guò)腔面上的cftr來(lái)協(xié)調(diào)氯的分泌。因?yàn)樗旧矶喟氩荒苤鲃?dòng)輸送，所以，其依賴于微小的跨上皮滲壓梯度(通過(guò)鈉和氯的總體流動(dòng)產(chǎn)生)流過(guò)上皮。

正如以上的討論，人們相信，δf508-cftr中缺失殘基508可以妨礙未成熟蛋白正確地折疊，導(dǎo)致這種突變蛋白不能脫離er，從而不能輸送至質(zhì)膜。結(jié)果，存在于質(zhì)膜中的成熟蛋白的數(shù)量不足，并且氯在上皮組織內(nèi)的輸送顯著地減少。事實(shí)上，通過(guò)er機(jī)構(gòu)加工atp結(jié)合盒(abc)轉(zhuǎn)運(yùn)體的缺陷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)的這種細(xì)胞現(xiàn)象不但表明了其是構(gòu)成cf疾病的基礎(chǔ)、而且是構(gòu)成許多其它孤立性和遺傳疾病的基礎(chǔ)。使er機(jī)構(gòu)機(jī)能失調(diào)的兩個(gè)途徑是：?jiǎn)适c蛋白的er輸出（export）進(jìn)行連接，導(dǎo)致降解，或這些有缺陷的/折疊錯(cuò)誤的蛋白的er積聚[aridorm,等人，naturemed.,5(7),pp745-751(1999);shastry,b.s.,等人，neurochem.international,43,pp1-7(2003);rutishauser,j.,等人，swissmedwkly,132,pp211-222(2002);morello,jp等人，tips,21,pp.466-469(2000);brossp.,等人，humanmut.,14,pp.186-198(1999)]。

國(guó)際pct公開wo2007056341公開了3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的鹽形式，作為cftr活性的調(diào)節(jié)劑，由此用于治療cftr介導(dǎo)的疾病，例如囊性纖維化。美國(guó)專利申請(qǐng)12/327,902(2008年12月4日申請(qǐng))公開了3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的i型(其基本上是晶體和游離鹽形式，被稱為i型化合物1)。美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/321,729(2010年4月7日申請(qǐng))公開了3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的ii型和hcl鹽形式a(分別是ii型化合物1和化合物1hcl鹽形式a)。本文以引證的方式結(jié)合所有申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容。然而，還需要容易制備并且適合于用作治療的含有i型、ii型或hcl鹽形式a的化合物1的藥物組合物。

概述

本發(fā)明涉及含有3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1)的藥物組合物、藥物制劑和固體劑型，其具有下面的結(jié)構(gòu)：

在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含：

a.化合物1；

b.填料；

c.崩解劑；

d.表面活性劑；

e.稀釋劑；

f.潤(rùn)滑劑；和

g.助流劑和粘合劑中的至少一種。

在其它實(shí)施方案中，化合物1基本上是它的結(jié)晶固體形式之一。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1基本上是結(jié)晶形式i(i型化合物1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1基本上是結(jié)晶形式ii(ii型化合物1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1基本上是晶體hcl鹽形式(化合物1hcl鹽形式a)。應(yīng)當(dāng)理解，貫穿本文使用的術(shù)語(yǔ)“化合物1”包括下列固態(tài)形式：i型化合物1、ii型化合物1和/或化合物1hcl鹽形式a，還有其它形式，包括非晶形式。

在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含25mg至400mg。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含25mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含50mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含100mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含125mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含150mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含200mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含250mg化合物1。在一些實(shí)施方案中，該藥物組合物包含400mg化合物1。

在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含下列組分：

。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了片劑形式的藥物組合物，其包含化合物1和一或多種可藥用賦形劑，例如，填料，崩解劑，表面活性劑，稀釋劑，粘合劑，助流劑和潤(rùn)滑劑和其任何組合，其中該片劑在大約30分鐘內(nèi)溶解至少大約50%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在大約30分鐘內(nèi)的溶解率至少為大約75%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在大約30分鐘內(nèi)的溶解率至少為大約90%。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其由片劑組成，片劑包含化合物1與一或多種可藥用賦形劑的粉末混合物或顆粒，其中賦形劑包括，例如，填料，崩解劑，表面活性劑，稀釋劑，粘合劑，助流劑和潤(rùn)滑劑，其中片劑具有至少大約5kp的硬度(kp=千磅；1kp=～9.8n)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片劑經(jīng)過(guò)400次旋轉(zhuǎn)之后，其目標(biāo)脆度小于1.0%。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其由片劑組成，片劑包含ii型化合物1、化合物1與一或多種可藥用賦形劑的粉末混合物或顆粒，其中賦形劑包括，例如，填料，崩解劑，表面活性劑，稀釋劑，粘合劑，助流劑和潤(rùn)滑劑，其中片劑具有至少大約5kp的硬度(kp=千磅；1kp=～9.8n)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片劑經(jīng)過(guò)400次旋轉(zhuǎn)之后，其目標(biāo)脆度小于1.0%。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了進(jìn)一步包含額外治療劑的本文所描述的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，額外治療劑是n-(5-羥基-2,4-二叔丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物的cftr介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括：給予哺乳動(dòng)物有效量的本文所描述的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，cftr介導(dǎo)的疾病是囊性纖維化，（肺）氣腫（emphysema），copd（慢性阻塞性肺?。┗蚬琴|(zhì)疏松癥。在其它實(shí)施方案中，cftr介導(dǎo)的疾病是囊性纖維化。該方法可以進(jìn)一步包括給予額外的治療劑，其中在一些實(shí)施方案中，額外治療劑是n-(5-羥基-2,4-二叔丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)碾壓方法來(lái)制備本文所描述的藥物組合物的方法，包括下列步驟：篩分和稱量化合物1與賦形劑；將化合物1和賦形劑混合適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；將該混合物碾壓成帶狀物，并將帶狀物碾壓成顆粒；將顆粒與外加的顆粒狀（extra-granular）賦形劑混合適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；將該混合物壓制成片劑；將片劑包衣；任選，在片劑的一面或兩面上印刷字母圖案（monogram）。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)高剪切造粒來(lái)制備本文所描述的藥物組合物的方法，包括下列步驟：篩分和稱量化合物1與賦形劑；將化合物1和賦形劑混合，同時(shí)加入包含表面活性劑和粘合劑的造粒用流體，在合適的混合速度混合適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，并將該混合物切割為顆粒；將顆粒干燥；將顆粒與外加的顆粒狀賦形劑混合適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；將該混合物壓制成片劑；將片劑包衣；任選，在片劑的一面或兩面上印刷字母圖案。

附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是由i型化合物1的單晶結(jié)構(gòu)計(jì)算的x射線衍射圖。

圖2是i型化合物1的實(shí)際x射線粉末衍射圖。

圖3是ii型化合物1的x射線粉末衍射圖。

圖4提供了選自下列的ii型化合物1的x射線衍射圖：

1)ii型化合物1，甲醇溶劑化物；

2)ii型化合物1，乙醇溶劑化物；

3)ii型化合物1，丙酮溶劑化物；

4)ii型化合物1，2-丙醇溶劑化物；

5)ii型化合物1，乙腈溶劑化物；

6)ii型化合物1，四氫呋喃溶劑化物；

7)ii型化合物1，乙酸甲酯溶劑化物；

8)ii型化合物1，2-丁酮溶劑化物；

9)ii型化合物1，甲酸乙酯溶劑化物；和

10)ii型化合物1，2-甲基四氫呋喃溶劑化物。

圖5提供了ii型化合物1甲醇溶劑化物的x射線衍射圖。

圖6提供了ii型化合物1乙醇溶劑化物的x射線衍射圖。

圖7提供了ii型化合物1丙酮溶劑化物的x射線衍射圖。

圖8提供了ii型化合物1的2-丙醇溶劑化物的x射線衍射圖。

圖9提供了ii型化合物1的乙腈溶劑化物的x射線衍射圖。

圖10提供了ii型化合物1的四氫呋喃溶劑化物的x射線衍射圖。

圖11提供了ii型化合物1的乙酸甲酯溶劑化物的x射線衍射圖。

圖12提供了ii型化合物1的2-丁酮溶劑化物的x射線衍射圖。

圖13提供了ii型化合物1的甲酸乙酯溶劑化物的x射線衍射圖。

圖14提供了ii型化合物1的2-甲基四氫呋喃溶劑化物的x射線衍射圖。

圖15是ii型化合物1丙酮溶劑化物的差示掃描量熱(dsc),跡線（trace）圖。

圖16是ii型化合物1丙酮溶劑化物的熱重分析(tga)圖。

圖17是基于單晶x射線分析的ii型化合物1丙酮溶劑化物的構(gòu)象（conformationalimage）圖。

圖18是化合物1hcl鹽形式a的二聚體的構(gòu)象圖。

圖19是由晶體結(jié)構(gòu)計(jì)算的化合物1hcl鹽形式a的x射線衍射圖。

圖20是化合物1的¹hnmr譜。

圖21是化合物1hcl鹽的¹hnmr譜。

圖22是i型化合物1的差示掃描量熱(dsc)跡線圖。

圖23是基于單晶x射線分析的i型化合物1的構(gòu)形圖。

圖24是基于單晶x射線分析的ii型化合物1丙酮溶劑化物的構(gòu)象圖。

圖25是ii型化合物1丙酮溶劑化物的固態(tài)¹³cnmr譜(15.0khz旋轉(zhuǎn))。

圖26是ii型化合物1丙酮溶劑化物的固態(tài)¹⁹fnmr譜(12.5khz旋轉(zhuǎn))。

圖27是由晶體結(jié)構(gòu)計(jì)算的化合物1hcl鹽形式a的x射線衍射圖。

詳細(xì)說(shuō)明

定義

本文使用的術(shù)語(yǔ)“活性藥物組分”或“api”是指生物活性化合物。示范性的api包括3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1)。

術(shù)語(yǔ)“固態(tài)”、“固體形式”和相關(guān)術(shù)語(yǔ)，當(dāng)在本文中用于3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1)時(shí)，指的是固體形式，例如晶體等等，包括不是顯著地為液體或氣態(tài)的化合物1。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上為非晶體”是指其分子的位置中幾乎沒有順序或不具有長(zhǎng)程有序（longrangeorder）的固體物質(zhì)。例如，基本上非晶體的物質(zhì)的結(jié)晶度小于大約15%(例如，結(jié)晶度小于大約10%，或結(jié)晶度小于大約5%)。還應(yīng)該注意，術(shù)語(yǔ)'基本上為非晶體'包括描述詞'非晶體'，其是指沒有(0%)結(jié)晶度的物質(zhì)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上為晶體”(如在短語(yǔ)基本上是晶體i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a中)是指固體物質(zhì)，其在分子位置中具有占優(yōu)勢(shì)的長(zhǎng)程有序。例如，基本上為晶體的物質(zhì)的結(jié)晶度大于大約85%(例如，結(jié)晶度大于大約90%，或結(jié)晶度大于大約95%)。還應(yīng)該注意，術(shù)語(yǔ)'基本上為晶體'包括描述詞'晶體'，其是指具有100%結(jié)晶度的物質(zhì)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“晶體”和相關(guān)術(shù)語(yǔ)，當(dāng)用于描述物質(zhì)、組分、產(chǎn)物或形式時(shí)，是指該物質(zhì)、組分或產(chǎn)物根據(jù)x射線衍射測(cè)定基本上為晶體。(參見，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,21sted.,lippincottwilliams&wilkins,baltimore,md.(2003);theunitedstatespharmacopeia,23^rded.,1843-1844(1995))。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“組合物”泛指兩種或多種組分的組合物，通常是一或多種藥物(例如，一種藥物(例如，i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a))和一或多種藥物賦形劑的組合物。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“固體劑型”泛指藥物組合物，當(dāng)用于口服給藥模式時(shí)，包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這種固體劑型中，將活性化合物與至少一種惰性可藥用賦形劑或載體混合。

本文使用的“賦形劑”包括藥物組合物中的功能和無(wú)功能組分。

本文使用的“崩解劑”是使藥物組合物水合并有助于片劑分散的賦形劑。本文使用的“稀釋劑”或“填料”是加大藥物組合物的體容度的賦形劑。

本文使用的“表面活性劑”是使藥物組合物提高溶解性和/或浸濕性的賦形劑。

本文使用的“粘合劑”是使藥物組合物提高內(nèi)聚性或拉伸強(qiáng)度(例如，硬度)的賦形劑。

本文使用的“助流劑”是使藥物組合物提高流動(dòng)特性的賦形劑。

本文使用的“著色劑”是使藥物組合物具有目標(biāo)顏色的賦形劑。著色劑的例子包括商購(gòu)的色素，例如fd&c藍(lán)#1鋁色淀，fd&c藍(lán)#2，其它fd&c藍(lán)色，二氧化鈦，氧化鐵和/或其組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的藥物組合物是紫色的。

本文使用的“潤(rùn)滑劑”是加入到壓縮成為片劑的藥物組合物中的賦形劑。潤(rùn)滑劑有助于將顆粒擠壓成為片劑，并有助于片劑從壓模中排出藥物組合物的片劑。

本文使用的“立方厘米”和“cc”可互換使用，代表體積單位。注釋：1cc=1ml。

本文使用的“千磅”和“kp”可互換使用，是力的量度，其中1kp=大約9.8牛頓。

本文使用的“脆度”是指片劑在外部壓力下保持完整無(wú)損和保持其形式的性能。脆度可以使用方程式1提供的數(shù)學(xué)式來(lái)定量：

其中w0是片劑的原重量，wf是片劑通過(guò)脆度測(cè)定器之后的最后重量。脆度是使用標(biāo)準(zhǔn)usp試驗(yàn)設(shè)備測(cè)定的，這種設(shè)備使實(shí)驗(yàn)片劑滾轉(zhuǎn)100或400轉(zhuǎn)。本發(fā)明的一些片劑具有小于5.0%的脆度.在另一個(gè)實(shí)施方案中，脆度小于2.0%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，400轉(zhuǎn)之后，目標(biāo)脆度小于1.0%。

本文使用的“平均粒徑”是使用技術(shù)例如激光散射、圖像(image)分析或篩分分析測(cè)定的平均粒徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明所提供的藥物組合物的顆粒具有小于1.0mm的平均粒徑。

本文使用的“堆積密度”是物質(zhì)顆粒的質(zhì)量除以顆粒占據(jù)的總體積?？傮w積包括顆粒體積、顆粒之間空隙體積和內(nèi)空隙體積。堆積密度不是物質(zhì)的固有特性；它可以根據(jù)如何加工物質(zhì)而變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明所提供的藥物組合物的顆粒具有大約0.5-0.7g/cc的堆積密度。

本發(fā)明的藥物化合物的有效量或“治療有效量”可以根據(jù)下列因素而改變：例如，患者的疾病狀態(tài)、年齡和體重，本發(fā)明化合物引起患者目標(biāo)響應(yīng)的能力。可以調(diào)節(jié)劑量方案，以便提供最佳治療響應(yīng)。有效量也是其中本發(fā)明化合物的治療有利效果勝于任何毒性或不利影響(例如，副作用)的數(shù)量。

除非另作說(shuō)明，否則，本文使用的術(shù)語(yǔ)化合物的“治療有效量”和“有效量”是指在治療或控制疾病或病癥過(guò)程中足以提供治療益處、或使與疾病或病癥相關(guān)的一或多種癥狀得到延遲或使其減到最小的數(shù)量。化合物的“治療有效量”和“有效量”是指單獨(dú)或與一或多種其它藥劑聯(lián)用的治療劑的數(shù)量，該數(shù)量在疾病或病癥的治療或控制過(guò)程中提供治療益處。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”和“有效量”可以包括提高總體治療效果、減少或避免疾病或病癥的癥狀或病因、或提高另一治療劑的治療效能的數(shù)量。

在短語(yǔ)“基本上純的i型化合物、ii型化合物或化合物1hcl鹽形式a”中使用的“基本上純的”是指純度高于大約90%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約95%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約98%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約99%。

就化合物1(例如，i型化合物1，ii型化合物1，化合物1hcl鹽形式a)而論，術(shù)語(yǔ)“大約”和“大致”，當(dāng)與組合物或劑型的組分的劑量、數(shù)量或重量百分?jǐn)?shù)結(jié)合使用時(shí)，是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的、能夠提供藥理效果的劑量、數(shù)量或重量百分?jǐn)?shù)，這種效果相當(dāng)于由列舉的劑量、數(shù)量或重量百分?jǐn)?shù)所獲得的效果。具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“大約”或“大致”是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所測(cè)定的具體值的容許誤差，其部分地取決于如何測(cè)定或確定該值。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“大約”或“大致”是指在1、2、3或4標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“大約”或“大致”是指在給定值或范圍的30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%或0.05%以內(nèi)。

除非另作說(shuō)明，否則，術(shù)語(yǔ)“化合物1”包括但不局限于：本文描述的固體形式的化合物1，例如i型化合物1，ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a，以及其組合。

藥物組合物

本發(fā)明提供了包含化合物1的藥物組合物、藥物制劑和固體劑型，其中化合物1可以基本上是結(jié)晶形式。在一些實(shí)施方案中，化合物1是結(jié)晶形式i(i型化合物1)。在一些實(shí)施方案中，化合物1是結(jié)晶形式ii(ii型化合物1)。在一些實(shí)施方案中，化合物1是晶體hcl鹽形式(化合物1hcl鹽形式a)。在該方面的一些實(shí)施方案中，存在于藥物組合物中的化合物1的數(shù)量是25mg，50mg，75mg，100mg，125mg，150mg，200mg，250mg或400mg。在該方面的一些實(shí)施方案中，存在于藥物組合物中的化合物1的重量/重量相對(duì)百分?jǐn)?shù)是10至75%。在這些及其它實(shí)施方案中，3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸以基本上純的化合物1形式存在?！盎旧霞儭笔侵讣兌却笥?0%；優(yōu)選純度大于95%；更優(yōu)選純度大于99.5%(即，不與化合物1的其它結(jié)晶形式混合)。

由此，在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含：

a.化合物1；

b.填料；

c.崩解劑；

d.表面活性劑；

e.稀釋劑；

f.潤(rùn)滑劑；和

g.助流劑和粘合劑中的至少一種。

在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含25mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含50mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含100mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含125mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含150mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含200mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含250mg化合物1。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含400mg化合物1。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含化合物1，其中化合物1的存在數(shù)量至少是該組合物重量的15wt%(例如，至少20wt%，至少30wt%，至少40wt%，至少50wt%，或至少60wt%)。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含化合物1，填料，稀釋劑，崩解劑，表面活性劑，助流劑和潤(rùn)滑劑。在該實(shí)施方案中，該組合物包含占組合物重量的大約20wt%至大約50wt%(例如，大約25-35wt%)的化合物1，且更典型地包含該組合物重量的25wt%至大約45wt%(例如，大約28-32wt%)的化合物1。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含化合物1，填料，稀釋劑，崩解劑，表面活性劑，粘合劑和潤(rùn)滑劑。在該實(shí)施方案中，該組合物包含占組合物重量的大約30wt%至大約60wt%(例如，大約40-55wt%)的化合物1，且更典型地包含該組合物重量的35wt%至大約70wt%(例如，大約45-55wt%)的化合物1。

化合物1在組合物中的濃度取決于若干因素，例如，提供目標(biāo)數(shù)量的化合物1所需要的藥物組合物的數(shù)量和藥物組合物的目標(biāo)溶解特性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含化合物1，其中化合物1是固體形式，具有0.1微米至10微米的平均粒徑，利用光散射測(cè)定(例如，使用malvernmastersizer，得自于英格蘭的malverninstruments)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1的粒徑是1微米至5微米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1具有2.0微米的粒徑d50。

正如所指明的那樣，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，除了化合物1之外，口服制劑的藥物組合物還包含一或多種賦形劑，例如填料，崩解劑，表面活性劑，稀釋劑，粘合劑，助流劑，潤(rùn)滑劑，著色劑或芳香劑和其任何組合。

適合于本發(fā)明的填料與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的溶解性、硬度、化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性或生物活性。示范性的填料包括：纖維素，改性纖維素(例如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素羥甲基纖維素，羥丙基纖維素)，醋酸纖維素，微晶纖維素，磷酸鈣，磷酸氫鈣，淀粉(例如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉)，糖(例如，山梨糖醇)乳糖，蔗糖，等等），或其任何組合。

由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種填料，數(shù)量為組合物重量的至少5wt%(例如，至少大約20wt%，至少大約30wt%，或至少大約40wt%)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約10wt%至大約60wt%的填料(例如，大約20wt%至大約55wt%，大約25wt%至大約50wt%，或大約27wt%至大約45wt%)。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的至少大約20wt%(例如，至少30wt%或至少40wt%)的微晶纖維素，例如mccavicelph102。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約10wt%至大約60wt%的微晶纖維素(例如，大約20wt%至大約55wt%，或大約25wt%至大約45wt%)。

適合于本發(fā)明的崩解劑可提高藥物組合物的分散，并與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、硬度或生物活性。示范性的崩解劑包括交聯(lián)羧甲纖維素鈉，淀粉羥基乙酸鈉或其組合。

由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含崩解劑，數(shù)量為組合物重量的大約10wt%或更少(例如，大約7wt%或更少，大約6wt%或更少，或大約5wt%或更少)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約1wt%至大約10wt%(例如，大約1.5wt%至大約7.5wt%或大約2.5wt%至大約6wt%)的崩解劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約10wt%或更少(例如，7wt%或更少，6wt%或更少，或5wt%或更少)的交聯(lián)羧甲纖維素鈉。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約1wt%至大約10wt%(例如，大約1.5wt%至大約7.5wt%或大約2.5wt%至大約6wt%)的交聯(lián)羧甲纖維素鈉。在一些實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約0.1%至大約10wt%(例如，大約0.5wt%至大約7.5wt%或大約1.5wt%至大約6wt%)的崩解劑。在其它實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約0.5%至大約10wt%(例如，大約1.5wt%至大約7.5wt%或大約2.5wt%至大約6wt%)的崩解劑。

適合于本發(fā)明的表面活性劑可提高藥物組合物的濕潤(rùn)性，并與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、硬度或生物活性。示范性的表面活性劑包括：月桂基硫酸鈉(sls)，十八烷基富馬酸鈉(ssf)，聚氧乙烯20脫水山梨糖醇單油酸酯(例如，tween^tm)，其任何組合，等等。

由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含表面活性劑，數(shù)量為組合物重量的大約10wt%或更少(例如，大約5wt%或更少，大約2wt%或更少，大約1wt%或更少，大約0.8wt%或更少，或大約0.6wt%或更少)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約10wt%至大約0.1wt%的表面活性劑(例如，大約5wt%至大約0.2wt%或大約2wt%至大約0.3wt%)。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的10wt%或更少(例如，大約5wt%或更少，大約2wt%或更少，大約1wt%或更少，大約0.8wt%或更少，或大約0.6wt%或更少)的月桂基硫酸鈉。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約10wt%至大約0.1wt%(例如，大約5wt%至大約0.2wt%或大約2wt%至大約0.3wt%)的月桂基硫酸鈉。

適合于本發(fā)明的粘合劑可提高藥物組合物的片劑強(qiáng)度，并與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性或生物活性。示范性的粘合劑包括：聚乙烯吡咯烷酮，磷酸氫鈣，蔗糖，玉米(包谷)淀粉，改性纖維素(例如，羥甲基纖維素)，或其任何組合。

由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含粘合劑，數(shù)量為組合物重量的至少大約0.1wt%(例如，至少大約1wt%，至少大約3wt%，至少大約4wt%，或至少大約5wt%)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約0.1wt%至大約10wt%(例如，大約1wt%至大約10wt%或大約2wt%至大約7wt%)的粘合劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的至少大約0.1wt%(例如，至少大約1wt%，至少大約2wt%，至少大約3wt%，或至少大約4wt%)的聚乙烯吡咯烷酮。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含以組合物重量計(jì)大約0.1wt%至大約10wt%(例如，大約1wt%至大約8wt%或大約2wt%至大約5wt%)的聚乙烯吡咯烷酮助流劑。

為了制備目標(biāo)大小的片劑，可以向制劑中加入需要體積的適合于本發(fā)明的稀釋劑，并通常與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的溶解性、硬度、化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性或生物活性。示范性的稀釋劑包括：糖，例如，糖果劑的糖，可壓縮的糖，葡萄糖粘合劑（dextrates），糊精(dextrin)，葡萄糖(dextrose)，乳糖，甘露糖醇，山梨糖醇，纖維素和改性纖維素，例如，粉末纖維素，滑石粉，磷酸鈣，淀粉，或其任何組合。

由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含稀釋劑，數(shù)量為組合物重量的40wt%或更少(例如，35wt%或更少，30wt%或更少，或25wt%或更少，或20wt%或更少，或15wt%或更少，或10wt%或更少)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約40wt%至大約1wt%(例如，大約35wt%至大約5wt%或大約30wt%至大約7wt%，大約25wt%至大約10wt%，大約20wt%至大約15wt%)的稀釋劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的40wt%或更少(例如，35wt%或更少，25wt%或更少，或15wt%或更少)的甘露糖醇。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約35wt%至大約1wt%(例如，大約30wt%至大約5wt%或大約25wt%至大約10wt%)的甘露糖醇。

適合于本發(fā)明的助流劑可提高藥物組合物的流動(dòng)特性，并與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的溶解性、硬度、化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性或生物活性。示范性的助流劑包括膠體二氧化硅，滑石粉，或其組合。

由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含助流劑，數(shù)量為組合物重量的2wt%或更少(例如，1.75wt%，1.25wt%或更少，或1.00wt%或更少)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約2wt%至大約0.05wt%(例如，大約1.5wt%至大約0.07wt%或大約1.0wt%至大約0.09wt%)的助流劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的2wt%或更少(例如，1.75wt%，1.25wt%或更少，或1.00wt%或更少)的膠體二氧化硅。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約2wt%至大約0.05wt%(例如，大約1.5wt%至大約0.07wt%或大約1.0wt%至大約0.09wt%)的膠體二氧化硅。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包括口服固體藥物劑型，該劑型可以包含潤(rùn)滑劑，潤(rùn)滑劑可以防止顆?；旌衔锱c表面(例如，攪拌斗、擠壓模和/或沖頭的表面)粘附。潤(rùn)滑劑還可以降低顆粒-珠的粒間摩擦，并且提高壓制的藥物組合物的擠壓和從壓模中排出。潤(rùn)滑劑還應(yīng)該與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的溶解性、硬度或生物活性。示范性的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，硬脂酸鋅，硬脂酸鈉，硬脂酸，硬脂酸鋁，亮氨酸，山崳酸甘油酯，氫化植物油或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含潤(rùn)滑劑，數(shù)量為組合物重量的5wt%或更少(例如，4.75wt%，4.0wt%或更少，或3.00wt%或更少，或2.0wt%或更少)。例如，藥物組合物包含占組合物重量的大約5wt%至大約0.10wt%(例如，大約4.5wt%至大約0.5wt%或大約3wt%至大約1wt%)的潤(rùn)滑劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的5wt%或更少(例如，4.0wt%或更少，3.0wt%或更少，或2.0wt%或更少，或1.0wt%或更少)的硬脂酸鎂。在又一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物包含占組合物重量的大約5wt%至大約0.10wt%(例如，大約4.5wt%至大約0.15wt%或大約3.0wt%至大約0.50wt%)的硬脂酸鎂。

為了提高組合物的視覺吸引力、味道和/或香味，本發(fā)明的藥物組合物可以任選包含一或多種著色劑、調(diào)味劑和/或芳香劑。合適的著色劑、調(diào)味劑或芳香劑與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的溶解性、化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、硬度或生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含著色劑、調(diào)味劑和/或芳香劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的藥物組合物是紫色的。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包括片劑或可以制成片劑，片劑可以涂有著色劑，并且任選使用合適的墨汁來(lái)標(biāo)明標(biāo)志、其它圖像(image)和/或文字。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物包括片劑或可以制成片劑，片劑可以涂有著色劑、涂蠟，并且任選使用合適的墨汁來(lái)標(biāo)明標(biāo)志、其它圖像(image)和/或文字。合適的著色劑和墨汁與藥物組合物的組分相容，即，它們基本上不會(huì)降低藥物組合物的溶解性、化學(xué)穩(wěn)定性、物理穩(wěn)定性、硬度或生物活性。合適的著色劑和墨汁可以是任何顏色，并且是水基或溶劑基著色劑和墨汁。在一個(gè)實(shí)施方案中，用藥物組合物制備的片劑涂有著色劑，而后使用合適的墨汁來(lái)標(biāo)明標(biāo)志、其它圖像(image)和/或文字。例如，包含本文所描述的藥物組合物的片劑可以涂有大約3wt%(例如，小于大約6wt%或小于大約4wt%)的薄膜包衣，其中薄膜包衣包含著色劑。染色的片劑可以使用合適的墨汁來(lái)標(biāo)明標(biāo)志和文字，指明片劑中活性組分的強(qiáng)度。在另一個(gè)實(shí)施例中，包含本文所描述藥物組合物的片劑可以涂有大約3wt%(例如，小于大約6wt%或小于大約4wt%)的薄膜包衣，其中薄膜包衣包含著色劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，用藥物組合物制備的片劑涂有著色劑、涂蠟，而后使用合適的墨汁來(lái)標(biāo)明標(biāo)志、其它圖像(image)和/或文字。例如，包含本文所描述的藥物組合物的片劑可以涂有大約3wt%(例如，小于大約6wt%或小于大約4wt%)的薄膜包衣，其中薄膜包衣包含著色劑。染色的片劑可以用加洛巴蠟粉末(稱出起始片劑核重量的大約0.01%w/w重量)來(lái)進(jìn)行涂蠟。涂蠟的片劑可以使用合適的墨汁來(lái)標(biāo)明標(biāo)志和文字，這種標(biāo)志和文字指明片劑中活性組分的強(qiáng)度。在另一個(gè)實(shí)施例中，包含本文所描述藥物組合物的片劑可以涂有大約3wt%(例如，小于大約6wt%或小于大約4wt%)的薄膜包衣，其中薄膜包衣包含著色劑。染色的片劑可以用加洛巴蠟粉末(稱出起始片劑核重量的大約0.01%w/w重量)來(lái)進(jìn)行涂蠟。涂蠟的片劑可以使用藥物等級(jí)墨汁(例如黑色墨汁(例如，opacode?s-1-17823，基于溶劑的墨汁，從colorcon，inc.ofwestpoint，pa.商購(gòu)))來(lái)標(biāo)明標(biāo)志和文字，這種標(biāo)志和文字指明片劑中的活性組分的強(qiáng)度。

一種示范性的藥物組合物包含占組合物重量的大約15wt%至大約70wt%(例如，大約15wt%至大約60wt%，大約15wt%至大約50wt%，或大約15wt%至大約40wt%，或大約20wt%至大約70wt%，或大約30wt%至大約70wt%，或大約40wt%至大約70wt%，或大約50wt%至大約70wt%)的化合物1。上述組合物還可以包含一或多種可藥用賦形劑，例如，大約20wt%至大約50wt%的填料；大約1wt%至大約5wt%的崩解劑；大約2wt%至大約0.3wt%的表面活性劑；大約0.1wt%至大約5wt%的粘合劑；大約1wt%至大約30wt%的稀釋劑；大約2wt%至大約0.05wt%的助流劑；和大約5wt%至大約0.1wt%的潤(rùn)滑劑?；蛘?，藥物組合物包含組合物，該組合物包含占組合物重量的大約15wt%至大約70wt%(例如，大約20wt%至大約40wt%，大約25wt%至大約60wt%，或大約30wt%至大約55wt%)的化合物1；和一或多種賦形劑，例如，大約20wt%至大約50wt%的填料；大約1wt%至大約5wt%的崩解劑；大約2wt%至大約0.3wt%的表面活性劑；大約0.1wt%至大約5wt%的粘合劑；大約1wt%至大約30wt%的稀釋劑；大約2wt%至大約0.05wt%的助流劑；和大約5wt%至大約0.1wt%的潤(rùn)滑劑。

另一個(gè)示范性的藥物組合物包含占組合物重量的大約15wt%至大約70wt%(例如，大約15wt%至大約60wt%，大約15wt%至大約50wt%，或大約15wt%至大約40wt%或大約20wt%至大約70wt%，或大約30wt%至大約70wt%，或大約40wt%至大約70wt%，或大約50wt%至大約70wt%)的化合物1，和一或多種賦形劑，例如，大約20wt%至大約50wt%的填料；大約1wt%至大約5wt%的崩解劑；大約2wt%至大約0.3wt%的表面活性劑；大約0.1wt%至大約5wt%的粘合劑；大約1wt%至大約30wt%的稀釋劑；大約2wt%至大約0.05wt%的助流劑；和大約2wt%至大約0.1wt%的潤(rùn)滑劑。

另一個(gè)示范性的藥物組合物包含占組合物重量的大約15wt%至大約70wt%(例如，大約15wt%至大約60wt%，大約15wt%至大約50wt%，或大約15wt%至大約40wt%或大約20wt%至大約70wt%，或大約30wt%至大約70wt%，或大約40wt%至大約70wt%，或大約50wt%至大約70wt%)的化合物1，和一或多種賦形劑，例如，大約20wt%至大約50wt%的填料；大約1wt%至大約5wt%的崩解劑；大約2wt%至大約0.3wt%的表面活性劑；大約0.1wt%至大約5wt%的粘合劑；大約1wt%至大約30wt%的稀釋劑；大約2wt%至大約0.05wt%的助流劑；和大約2wt%至大約0.1wt%的潤(rùn)滑劑。

另一個(gè)示范性的藥物組合物包含大約15wt%至大約70wt%(例如，大約15wt%至大約60wt%，大約15wt%至大約50wt%，或大約15wt%至大約40wt%或大約20wt%至大約70wt%，或大約30wt%至大約70wt%，或大約40wt%至大約70wt%，或大約50wt%至大約70wt%)的化合物1和一或多種賦形劑，例如，大約20wt%至大約50wt%的填料；大約1wt%至大約5wt%的崩解劑；大約2wt%至大約0.3wt%的表面活性劑；大約0.1wt%至大約5wt%的粘合劑；大約1wt%至大約30wt%的稀釋劑；大約2wt%至大約0.05wt%的助流劑；和大約2wt%至大約0.1wt%的潤(rùn)滑劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是包含下列的顆粒狀藥物組合物：

a.占組合物重量的大約30wt%的化合物1；

b.占組合物重量的大約42wt%的微晶纖維素；

c.占組合物重量的大約21wt%的甘露糖醇；

d.占組合物重量的大約3wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；

f.占組合物重量的大約2wt%的硬脂酸鎂；和

g.占組合物重量的大約0.5wt%的膠態(tài)二氧化硅。

配制為本發(fā)明的口服制劑的另一種顆粒狀組合物包含：

a.大約50wt%的化合物1；

b.占組合物重量的大約30wt%的微晶纖維素；

c.占組合物重量的大約13wt%的甘露糖醇；

d.占組合物重量的大約2wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.占組合物重量的大約4wt%的聚乙烯吡咯烷酮；和

f.占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物口服制劑包含：

a.占組合物重量的大約30wt%的化合物1；

b.占組合物重量的大約42wt%的微晶纖維素；

c.占組合物重量的大約21wt%的甘露糖醇；

d.占組合物重量的大約3wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；

f.占組合物重量的大約2.5wt%的硬脂酸鎂；和

g.占組合物重量的大約0.5wt%的膠態(tài)二氧化硅。

本發(fā)明的另一個(gè)藥物口服制劑包含：

a.占組合物重量的大約50wt%的化合物1；

b.占組合物重量的大約30wt%的微晶纖維素；

c.占組合物重量的大約13wt%的甘露糖醇；

d.占組合物重量的大約4wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.占組合物重量的大約4wt%的聚乙烯吡咯烷酮；

f.占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；和

g.占組合物重量的大約0.5wt%的硬脂酸鎂。

本發(fā)明的另一個(gè)藥物口服制劑包含：

a.占組合物重量的大約60wt%的化合物1；

b.占組合物重量的大約20wt%的微晶纖維素；

c.占組合物重量的大約13wt%的甘露糖醇；

d.占組合物重量的大約4wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.占組合物重量的大約4wt%的聚乙烯吡咯烷酮；

f.占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；和

g.占組合物重量的大約0.5wt%的硬脂酸鎂。

本發(fā)明的另一個(gè)藥物口服制劑包含：

a.大約150至250mg的化合物1；

b.大約40至50mg的甘露糖醇；

c.大約120至130mg的微晶纖維素；

d.大約10至20mg的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.大約10至20mg的聚乙烯吡咯烷酮；

f.大約1至5mg的月桂基硫酸鈉；和

g.大約1至5mg的硬脂酸鎂。

本發(fā)明的另一個(gè)藥物口服制劑包含：

a.大約200mg的化合物1；

b.大約43mg的甘露糖醇；

c.大約123mg的微晶纖維素；

d.大約15mg的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.大約13mg的聚乙烯吡咯烷酮；

f.大約3mg的月桂基硫酸鈉；和

g.大約4mg的硬脂酸鎂。

本發(fā)明的另一個(gè)藥物口服制劑包含：

a.大約200mg的化合物1；

b.大約45mg的甘露糖醇；

c.大約123mg的微晶纖維素；

d.大約15mg的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.大約10.4mg的聚乙烯吡咯烷酮；

f.大約2.6mg的月桂基硫酸鈉；和

g.大約4mg的硬脂酸鎂。

本發(fā)明的另一個(gè)藥物口服制劑包含：

a.占組合物重量的大約70wt%的化合物1；

b.占組合物重量的大約12wt%的微晶纖維素；

c.占組合物重量的大約11wt%的甘露糖醇；

d.占組合物重量的大約4wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；

e.占組合物重量的大約4wt%的聚乙烯吡咯烷酮；

f.占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；和

g.占組合物重量的大約0.5wt%的硬脂酸鎂。

可以將本發(fā)明的藥物組合物加工為適于口服給藥的片劑形式、膠囊劑形式、小袋形式、糖錠形式或其它固體形式。由此，在一些實(shí)施方案中，藥物組合物是片劑形式。

在本發(fā)明的又另一個(gè)藥物口服制劑中，具有5-21kp±20%的初始硬度的成型的藥物片劑組合物包含：大約30wt%的化合物1；占組合物重量的大約42wt%的微晶纖維素；占組合物重量的大約21wt%的甘露糖醇；占組合物重量的大約3wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；占組合物重量的大約2.5wt%的硬脂酸鎂；和占組合物重量的大約0.5wt%的膠態(tài)二氧化硅。其中對(duì)于每個(gè)片劑來(lái)說(shuō)，化合物1在成型的藥物片劑中的數(shù)量在大約25mg至大約250mg的范圍，例如，50mg，或75mg，或100mg，或150mg，200mg，或250mg化合物1。

在本發(fā)明的又另一個(gè)藥物口服制劑中，具有5-21kp±20%的初始硬度的成型的藥物片劑組合物包含：大約49wt%的化合物1；占組合物重量的大約29wt%的微晶纖維素；占組合物重量的大約12.6wt%的甘露糖醇；占組合物重量的大約4wt%的交聯(lián)羧甲纖維素鈉；占組合物重量的大約4wt%的聚乙烯吡咯烷酮；占組合物重量的大約1wt%的月桂基硫酸鈉；和占組合物重量的大約0.5wt%的硬脂酸鎂。對(duì)于每個(gè)片劑來(lái)說(shuō)，化合物1在成型的藥物片劑中的數(shù)量在大約25mg至大約250mg的范圍，例如，50mg，或75mg，或100mg，或150mg，200mg，或250mg化合物1。

在某些實(shí)施方案中，成型的藥物片劑包含大約100mg的化合物1。在某些實(shí)施方案中，成型的藥物片劑包含大約200mg的化合物1。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了由片劑或膠囊劑組成的藥物制劑，片劑或膠囊劑包含化合物1及其它賦形劑(例如，填料，崩解劑，表面活性劑，粘合劑，助流劑，著色劑，潤(rùn)滑劑，或其任何組合)，各自如上所述和下面的實(shí)施例所述，其中片劑在大約30分鐘內(nèi)溶解至少大約50%(例如，至少大約60%，至少大約70%，至少大約80%，至少大約90%，或至少大約99%)。在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物由片劑組成，片劑包含化合物1(數(shù)量為25mg至250mg的范圍，例如，25mg，或50mg，或75mg，或100mg，或150mg，200mg，或250mg)和一或多種賦形劑(例如，填料，崩解劑，表面活性劑，粘合劑，助流劑，著色劑，潤(rùn)滑劑，或其任何組合)，各自如上所述和下面的實(shí)施例所述，其中片劑在大約30分鐘內(nèi)溶解大約50%至大約100%(例如，大約55%至大約95%或大約60%至大約90%)。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物由片劑組成，片劑包含由化合物1和一或多種選自下列的賦形劑組成的組合物：填料，稀釋劑，崩解劑，表面活性劑，粘合劑，助流劑和潤(rùn)滑劑，其中片劑在大約30分鐘內(nèi)溶解至少大約50%(例如，至少大約60%，至少大約70%，至少大約80%，至少大約90%，或至少大約99%)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，片劑包含組合物，該組合物包含至少大約25mg(例如，至少大約30mg，至少大約40mg，或至少大約50mg)的化合物1；和一或多種選自下列的賦形劑：填料，稀釋劑，崩解劑，表面活性劑，粘合劑，助流劑和潤(rùn)滑劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片劑包含組合物，該組合物包含至少大約25mg(例如，至少大約30mg，至少40mg，至少大約50mg，至少大約100mg，或至少大約150mg)的化合物1和一或多種選自下列的賦形劑：填料，稀釋劑，崩解劑，表面活性劑，粘合劑，助流劑和潤(rùn)滑劑。

可以用標(biāo)準(zhǔn)uspii型裝置來(lái)測(cè)定溶解，這種裝置使用0.1%ctab的溶解介質(zhì)，溶于900mldi水中，在ph6.8用50mm磷酸二氫鉀緩沖，在大約50-75rpm下、在大約37℃溫度下攪拌。在該裝置的每個(gè)試驗(yàn)容器中檢驗(yàn)單個(gè)實(shí)驗(yàn)片劑。還可以用標(biāo)準(zhǔn)uspii型裝置來(lái)測(cè)定溶解，這種裝置使用0.7%月桂基硫酸鈉的溶解介質(zhì)，溶于900ml50mm磷酸鈉緩沖劑(ph6.8)中，在大約65rpm下、在大約37℃溫度下攪拌。在該裝置的每個(gè)試驗(yàn)容器中檢驗(yàn)單個(gè)實(shí)驗(yàn)片劑。還可以用標(biāo)準(zhǔn)uspii型裝置來(lái)測(cè)定溶解，這種裝置使用0.5%月桂基硫酸鈉的溶解介質(zhì)，溶于900ml50mm磷酸鈉緩沖劑(ph6.8)中，在大約65rpm下、在大約37℃溫度下攪拌。在該裝置的每個(gè)試驗(yàn)容器中檢驗(yàn)單個(gè)實(shí)驗(yàn)片劑。

制備化合物1、i型化合物1、ii型化合物1、化合物1hcl鹽形式a的方法

化合物1

化合物1用作其它固態(tài)形式的起點(diǎn)，并且可以按照反應(yīng)路線1-4、通過(guò)酰氯部分與胺部分偶合來(lái)制備。

反應(yīng)路線1.酰氯部分的合成

反應(yīng)路線1描述了1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷羰基氯的制備方法，其在反應(yīng)路線3中使用，制備化合物1的酰胺連接基。

起始原料，2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸，從saltigo(lanxess公司的分支機(jī)構(gòu))購(gòu)買。將2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸中的羧酸部分還原為伯醇，而后使用亞硫酰氯(socl2)轉(zhuǎn)化至相應(yīng)的氯化物，提供5-(氯甲基)-2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯，隨后使用氰化鈉使其轉(zhuǎn)變?yōu)?-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙腈。用堿和1-溴-2-氯乙烷處理2-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙腈，提供1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙腈。使用堿，將1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙腈中的腈部分轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?，得?-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷甲酸，使用亞硫酰氯將其轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)酰氯。

反應(yīng)路線2.酰氯部分的另一個(gè)合成法

反應(yīng)路線2描述了必要的酰氯的另一個(gè)合成法。在鈀催化劑的存在下，5-溴甲基-2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯與氰乙酸乙酯偶合，形成相應(yīng)的α氰基乙酯。酯部分進(jìn)行皂化反應(yīng)成為羧酸，得到氰乙基化合物。在堿的存在下，用1-溴-2-氯乙烷將氰乙基化合物烷基化，得到氰基環(huán)丙基化合物。用堿處理氰基環(huán)丙基化合物，得到羧酸鹽，將其用酸處理，轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?。然后，使用氯化劑，例如亞硫酰氯等等，將羧酸轉(zhuǎn)化為酰氯。

反應(yīng)路線3.胺部分的合成

反應(yīng)路線3描述了所需要的3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯的制備方法，在反應(yīng)路線3中，其與1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷羰基氯偶合，得到化合物1。2-溴-3-甲基吡啶與3-(叔丁氧羰基)苯基硼酸進(jìn)行鈀催化的偶合，得到3-(3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯，隨后將其轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)化合物。

反應(yīng)路線4.形成3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的酸式鹽

反應(yīng)路線4描述了1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙烷羰基氯與3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯的偶合，使用三乙基胺和4-二甲基氨基吡啶(dmap)，初始提供化合物1的叔丁基酯。

i型化合物1

如下制備i型化合物1：將化合物1的鹽形式(例如hcl鹽)分散或溶解在合適的溶劑中，保持有效量的時(shí)間。用酸例如hcl處理叔丁基酯，得到化合物1的hcl鹽，其典型地是結(jié)晶固體。還可以通過(guò)用合適的酸例如甲酸處理、由叔丁基酯前體來(lái)直接制備i型化合物1。

通過(guò)將3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的鹽酸鹽分散或溶解在合適的溶劑中，并保持有效量的時(shí)間，3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的鹽酸鹽可用于制備i型?？梢允褂?-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的其它鹽，例如，衍生自其它無(wú)機(jī)或有機(jī)酸的鹽。其它鹽由酸介導(dǎo)的叔丁基酯部分的水解所產(chǎn)生。衍生自其它酸的鹽可以包括，例如，硝酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，硼酸鹽，乙酸鹽，苯甲酸鹽和丙二酸鹽。根據(jù)使用的溶劑，3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的這些鹽形式可能溶解或可能不溶解，但沒有溶解性不會(huì)妨礙i型的形成。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，盡管3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的hcl鹽形式只微溶于水，但合適的溶劑可以是水或醇/水混合物，例如，50%甲醇/水混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的溶劑是水。

由3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的鹽形成i型的有效量的時(shí)間可以是2至24小時(shí)之間的任何時(shí)間，或時(shí)間可以更長(zhǎng)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，需要的時(shí)間量與溫度成反比。也就是說(shuō)，溫度越高，影響酸離解形成i型所需要的時(shí)間越少。當(dāng)溶劑是水時(shí)，在室溫下將分散體攪拌大約24小時(shí)，提供i型，產(chǎn)率大約98%。如果為了處理目的而需要3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸的鹽的溶液，則可以使用高溫。將溶液在高溫下攪拌有效量的時(shí)間之后，一旦冷卻，發(fā)生重結(jié)晶，提供基本上純的i型。在一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約90%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約95%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約98%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上純是指純度高于大約99%。選擇的溫度部分地取決于使用的溶劑，并且在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的測(cè)定能力范圍之內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度在室溫和大約80℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫度在室溫和大約40℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫度在大約40℃和大約60℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫度在大約60℃和大約80℃之間。

i型化合物1還可以直接由3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-苯甲酸叔丁酯形成(參見反應(yīng)路線3)，其是化合物1的鹽的前體物。由此，在合適的反應(yīng)條件下，使3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-苯甲酸叔丁酯與合適的酸例如甲酸進(jìn)行反應(yīng)，得到i型化合物1。

通過(guò)用有機(jī)溶劑重結(jié)晶，可以進(jìn)一步純化i型化合物1。有機(jī)溶劑的例子包括但不局限于：甲苯，枯烯，苯甲醚，1-丁醇，乙酸異丙酯，乙酸丁酯，乙酸異丁酯，甲基叔丁基醚，甲基異丁基酮和1-丙醇-水混合物。溫度可以如上所述。例如，在75℃，將i型溶于1-丁醇中，直到它完全溶解為止。將該溶液以0.2℃/min的速度冷卻至10℃，得到i型的晶體，可以將其過(guò)濾分離。

在一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的特征為：在使用cukα-輻射獲得的x射線粉末衍射中在15.2至15.6度、16.1至16.5度和14.3至14.7度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的特征為：在15.4、16.3和14.5度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在14.6至15.0度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在14.8度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在17.6至18.0度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在17.8度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在16.4至16.8度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在16.4至16.8度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在16.6度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在7.6至8.0度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在7.8度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在25.8至26.2度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在26.0度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在21.4至21.8度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在21.6度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在23.1至23.5度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，i型化合物1的進(jìn)一步特征為：在23.3度具有峰。在一些實(shí)施方案中，i型化合物1的特征為：衍射圖基本上與圖1中的相似。在一些實(shí)施方案中，i型化合物1的特征為：衍射圖基本上與圖2中的相似。

在一些實(shí)施方案中，對(duì)于i型化合物1，d90的粒徑分布大約為82μm或更小。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于i型化合物1，d50的粒徑分布大約為30μm或更小。

ii型化合物1

如下制備ii型化合物1：使i型化合物1在合適的溶劑中形成足夠濃度的漿液，保持足夠的時(shí)間。然后離心或真空過(guò)濾該漿液，在環(huán)境條件下干燥足夠的時(shí)間，得到ii型化合物1。

在一些實(shí)施方案中，使大約20至40mg的i型化合物1在大約400至600μl合適的溶劑中形成漿液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使大約25至35mg的i型化合物1在大約450至550μl合適的溶劑中形成漿液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使大約30mg的i型化合物1在大約500μl合適的溶劑中形成漿液。

在一些實(shí)施方案中，使i型化合物1與溶劑形成漿液的時(shí)間是1小時(shí)至四天。更尤其是，使i型化合物1與溶劑形成漿液的時(shí)間是1至3天。更尤其是，該時(shí)間是2天。

在一些實(shí)施方案中，合適的溶劑選自大小足以適合ii型化合物1的晶格中的空隙的有機(jī)溶劑。在其它實(shí)施方案中，溶劑化物是大小足以適合大約100?³空隙的溶劑化物。

在其它實(shí)施方案中，溶劑選自甲醇，乙醇，丙酮，2-丙醇，乙腈，四氫呋喃，乙酸甲酯，2-丁酮，甲酸乙酯和2-甲基四氫呋喃。

在其它實(shí)施方案中，兩種或多種這些溶劑的混合物可以用于獲得ii型化合物1?；蛘?，ii型化合物1可以由包含一或多種這些溶劑和水的混合物獲得。

在一些實(shí)施方案中，干燥ii型化合物1的有效量的時(shí)間是1至24小時(shí)。更尤其是，該時(shí)間是6至18小時(shí)。更尤其是，該時(shí)間是大約12小時(shí)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，如下制備ii型化合物1：將化合物1的鹽形式(例如，化合物1的hcl鹽)分散或溶解在合適的溶劑中，保持有效量的時(shí)間。

本文公開的ii型化合物1包含化合物1的晶格，其中晶格中的空隙是空的，或被合適溶劑的一個(gè)或多個(gè)分子占據(jù)，或被其部分地占據(jù)。合適的溶劑包括但不局限于：甲醇，乙醇，丙酮，2-丙醇，乙腈，四氫呋喃，乙酸甲酯，2-丁酮，甲酸乙酯和2-甲基四氫呋喃。化合物1同型溶劑化物形式的某些物理特征，例如x射線粉末衍射、熔點(diǎn)和dsc，基本上不受所述具體溶劑分子的影響。

在一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的特征為：在使用cukα-輻射獲得的x射線粉末衍射中，在21.50至21.90度、8.80至9.20度和10.80至11.20度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的特征為：在使用cukα-輻射獲得的x射線粉末衍射中，在21.50至21.90度、8.80至9.20度、10.80至11.20度、18.00至18.40度和22.90至23.30度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的特征為：在21.70、8.98和11.04度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的特征為：在21.70、8.98、11.04、18.16和23.06度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在21.50至21.90度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在21.70度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在8.80至9.20度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在8.98度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在10.80至11.20度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在11.04度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在18.00至18.40度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在18.16度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在22.90至23.30度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在23.06度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在20.40至20.80度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在20.63度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在22.00至22.40度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在22.22度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在18.40至18.80度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在18.57度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在16.50至16.90度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在16.66度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在19.70至20.10度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的進(jìn)一步特征為：在19.86度具有峰。

在一些實(shí)施方案中，ii型化合物1的特征為：衍射圖基本上與圖3中的相似。在一些實(shí)施方案中，ii型化合物1特征為：衍射圖基本上與圖4中提供的相似。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，形成ii型化合物1的溶劑化物選自甲醇，乙醇，丙酮，2-丙醇，乙腈，四氫呋喃，乙酸甲酯，2-丁酮，甲酸乙酯和2-甲基四氫呋喃。為下列ii型化合物1提供了衍射圖：甲醇(圖5)，乙醇(圖6)，丙酮(圖7)，2-丙醇(圖8)，乙腈(圖9)，四氫呋喃(圖10)，乙酸甲酯(圖11)，2-丁酮(圖12)，甲酸乙酯(圖13)和2-甲基四氫呋喃(圖14)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了ii型化合物1，據(jù)利用dsc或技術(shù)人員已知的類似的分析法測(cè)定，其顯示兩種或多種相變。在一些實(shí)施方案中，ii型化合物1的dsc基本上與圖15描述的dsc圖相似。在該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，dsc給出兩種相變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，dsc給出三種相變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相變之一出現(xiàn)在200和207℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相變之一出現(xiàn)在204和206℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相變之一出現(xiàn)在183和190℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相變之一出現(xiàn)在185和187℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1a型溶劑化物的熔點(diǎn)在183℃至190℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1a型溶劑化物的熔點(diǎn)在185℃至187℃之間。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1包含1至10重量百分?jǐn)?shù)(wt%)的溶劑化物(用tga測(cè)定)。在一些實(shí)施方案中，ii型化合物1的tga基本上與圖16描述的tga圖相似。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1包含2至5wt%的溶劑化物(用tga或技術(shù)人員已知的類似分析法測(cè)定)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1的丙酮溶劑化物的構(gòu)象基本上與圖17描述的構(gòu)象相似，其是基于單一x射線分析。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，ii型化合物1丙酮溶劑化物具有p21/n空間群和下列單位晶胞大小：

a=16.5235(10)?α=90°

b=12.7425(8)?β=103.736(4)°

c=20.5512(13)?γ=90°。

化合物1hcl鹽形式a

化合物1hcl鹽形式a可以由化合物1的hcl鹽制備：將化合物1的hcl鹽溶解在最少量的溶劑中，緩慢蒸發(fā)，除去溶劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溶劑是醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溶劑是乙醇。緩慢蒸發(fā)通常通過(guò)阻礙溶劑蒸發(fā)來(lái)進(jìn)行。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，緩慢蒸發(fā)包括：將化合物1的hcl鹽溶解在小瓶中，用石蠟?zāi)じ采w該小瓶，并在石蠟?zāi)ど洗坛鲆粋€(gè)孔。

在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在使用cukα-輻射獲得的x射線粉末衍射中，在8.80至9.20度、17.30至17.70度和18.20至18.60度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在使用cukα-輻射獲得的x射線粉末衍射中，在8.80至9.20度、17.30至17.70度、18.20至18.60度、10.10至10.50度和15.80至16.20度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在8.96、17.51和18.45度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在8.96、17.51、18.45、10.33和16.01度具有一個(gè)或多個(gè)峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在8.80至9.20度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在8.96度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在17.30至17.70度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：在17.51度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在18.20至18.60度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在18.45度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在10.10至10.50度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在10.33度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在15.80至16.20度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在16.01度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在11.70至12.10度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在11.94度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在7.90至8.30度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在8.14度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在9.90至10.30度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在10.10度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在16.40至16.80度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在16.55度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在9.30至9.70度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在9.54度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在16.40至16.80度具有峰。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的進(jìn)一步特征為：在16.55度具有峰。在一些實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為圖18描述的二聚體。

在一些實(shí)施方案中，化合物1hcl鹽形式a的特征為：衍射圖基本上與圖19中的相似。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的晶體化合物1hcl鹽形式a特征為具有p^-1空間群和下列單位晶胞大?。?/p>

a=10.2702(2)?α=67.0270(10)°

b=10.8782(2)?β=66.1810(10)°

c=12.4821(3)?γ=72.4760(10)°。

制備藥物組合物的方法

本發(fā)明的單位劑型可以通過(guò)壓縮或壓制混合物或組合物來(lái)制備，例如，在壓力下壓縮或壓制粉末或顆粒，形成穩(wěn)定的三維形狀(例如，片劑)。本文使用的“片劑”包括所有形狀和大小的壓制的單位劑型(不論是否包衣或無(wú)包衣的)。

本文使用的表達(dá)“單位劑型”是指適合于所治療患者的藥劑的物理離散單位。通常，壓縮的混合物的密度大于擠壓之前的該混合物的密度。本發(fā)明的單位劑型可以具有幾乎任何形狀，包括凹和/或凸?fàn)畋砻?、圓形或楔形角和圓形至直線性的形狀。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的壓制劑型包括具有平表面的圓形片劑。本發(fā)明的固體藥物劑型可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的、形成壓制固體藥物劑型的任何擠壓和壓縮法來(lái)制備。在具體實(shí)施方案中，本文提供的制劑可以使用藥物制劑領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)制備，例如，在相關(guān)的教科書中所描述的方法。參見，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,21sted.,lippincottwilliams&wilkins,baltimore,md.(2003);ansel等人，pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第七版，lippincottwilliams&wilkins,(1999);thehandbookofpharmaceuticalexcipients,第4版，rowe等編，americanpharmaceuticalsassociation(2003);gibson,pharmaceuticalpreformulationandformulation,crcpress(2001),將這些參考文獻(xiàn)以其整體結(jié)合到本文中作為參考。

造粒和擠壓

在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)包含活性劑化合物1和包括的可藥用賦形劑(例如填料，稀釋劑，崩解劑，表面活性劑，助流劑，粘合劑，潤(rùn)滑劑，或其任何組合)的固體形式(包括粉末)進(jìn)行干法成粒過(guò)程。干法成粒過(guò)程導(dǎo)致粉末聚集成為具有適合于進(jìn)一步加工的粒徑的大顆粒。為了能夠制備符合質(zhì)量變化或含量均勻性要求的片劑，干法成?？梢蕴岣呋旌衔锏牧鲃?dòng)性。

本文所描述的制劑可以使用一個(gè)或多個(gè)混合和干法成粒步驟來(lái)制備?；旌虾统闪２襟E的順序和數(shù)量似乎不是很關(guān)鍵。然而，可以對(duì)至少一種賦形劑和化合物1進(jìn)行干法成?；驖袷礁呒羟谐闪＃髷D壓成為片劑。在片劑擠壓之前，使化合物1和賦形劑結(jié)合在一起進(jìn)行的干法成粒似乎意外地是在本發(fā)明組合物和制劑的組分之間提供緊密物理接觸的簡(jiǎn)單、廉價(jià)和有效方法，并由此導(dǎo)致具有良好穩(wěn)定性的片劑制劑。干法成?？梢酝ㄟ^(guò)機(jī)械方法進(jìn)行，與本文還涉及的濕式成粒方法相反，這種方法將能量轉(zhuǎn)移至混合物，而不使用任何液體物質(zhì)(不是水溶液形式、基于有機(jī)溶質(zhì)的溶液形式或其混合物形式)。通常，機(jī)械方法需要擠壓，例如碾壓所提供的擠壓。干法成粒的另一個(gè)方法的例子是擊壓法（slugging）。

在一些實(shí)施方案中，碾壓是包括高強(qiáng)度機(jī)械壓縮一或多種物質(zhì)的成粒方法。在一些實(shí)施方案中，在2個(gè)反向旋轉(zhuǎn)輥之間，將包含粉末混合物的藥物組合物壓縮，即碾壓，產(chǎn)生固體薄片，隨后將其在篩網(wǎng)中破碎，形式顆粒物質(zhì)。在這種顆粒物質(zhì)中，可以獲得組分之間的緊密機(jī)械接觸。碾壓設(shè)備的例子是minipactor?gerteis3w-polygran(得自于gerteismaschinen+processengineeringag)。

在一些實(shí)施方案中，在不使用任何液體物質(zhì)(不是水溶液形式、基于有機(jī)溶質(zhì)的溶液形式或其混合物形式)的條件下，可以進(jìn)行按照本發(fā)明的片劑擠壓方法，即，干法成粒方法。在典型的實(shí)施方案中，得到的核或片劑具有在1至15kp范圍內(nèi)的壓縮強(qiáng)度；例如，1.5至12.5kp，優(yōu)選在2至10kp范圍內(nèi)。

制備方法概述

在一些實(shí)施方案中，按照本文給定的配方稱量組分。接下來(lái)，將所有顆粒內(nèi)的組分過(guò)篩，并很好地混合。可以用合適的潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂)潤(rùn)滑組分。下一步可以包括擠壓/擊壓粉末混合物和篩過(guò)的組分。接下來(lái)，將壓縮或形成棒條的混合物碾磨成為顆粒，并過(guò)篩，獲得所需要的粒徑。緊接著，進(jìn)一步用例如硬脂酸鎂潤(rùn)滑顆粒。接下來(lái)，可以用合適的沖頭壓制本發(fā)明的顆粒組合物，形成按照本發(fā)明的各種藥物制劑。任選，可以用薄膜、著色劑或其它包衣將片劑包衣。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了制備藥物組合物的方法，該方法包括：提供組合物的混合物，其中組合物包含化合物1和一或多種選自下列的賦形劑：填料，稀釋劑，粘合劑，助流劑，表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑，將該組合物壓制成為片劑，這種片劑在大約30分鐘內(nèi)溶解至少大約50%。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行濕式成粒方法，由粉末和液體組分的混合物得到本發(fā)明的藥物制劑。例如，按照本文給定的配方稱量包含組合物的混合物的藥物組合物，其中組合物包含化合物1和一或多種選自下列的賦形劑：填料，稀釋劑，粘合劑，助流劑，表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑。接下來(lái)，將所有顆粒內(nèi)的組分過(guò)篩，并在高剪切或低剪切造粒機(jī)中混合，使用水或水與表面活性劑或水與粘合劑或水與表面活性劑和粘合劑，使該粉末混合物形成顆粒。也可以使用非水流體，其可以與表面活性劑和/或粘合劑一起使用，或不使用，使粉末混合物形成顆粒。緊接著，可以任選使用合適的碾磨機(jī)來(lái)碾磨濕潤(rùn)的顆粒。接下來(lái)，任選使用任何合適的方式將組分干燥，從混合物中除去水。緊接著，可以任選將干燥的顆粒碾磨至所需粒徑。接下來(lái)，可以通過(guò)混合的方式加入額外的顆粒賦形劑(例如填料、稀釋劑和崩解劑)。緊接著，可以用硬脂酸鎂和崩解劑(例如，交聯(lián)羧甲纖維素鈉)進(jìn)一步潤(rùn)滑定徑的顆粒。接下來(lái)，將本發(fā)明的顆粒組合物篩分足夠的時(shí)間，獲得合適的粒徑，而后用合適的沖頭壓制成為按照本發(fā)明的各種藥物制劑。任選，可以用薄膜、著色劑或其它包衣將片劑包衣。

這種示范性混合物的每個(gè)組分如上所述和下面實(shí)施例所述。此外，該混合物可以包含任選的添加劑，例如上面描述的和下面實(shí)施例描述的一或多種著色劑、一或多種調(diào)味劑和/或一或多種芳香劑。在一些實(shí)施方案中，上面和下面實(shí)施例也提供了該混合物中的這些組分(和任何任選的添加劑)的每個(gè)組分的相對(duì)濃度(例如，wt%)?？梢皂樞虻?、或以任何組合加入形式提供組成該混合物的組分；并且可以以任何順序提供組分或組分的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，潤(rùn)滑劑是最后加入到該混合物中的組分。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該混合物包含化合物1，和任何一或多種賦形劑；粘合劑，助流劑，表面活性劑，稀釋劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑和填料的組合物，其中以粉末形式提供這些組分當(dāng)中的每個(gè)組分(例如，提供中間或平均直徑(利用光散射測(cè)定)250μm或更小直徑的顆粒(例如，150μm或更小，100μm或更小，50μm或更小，45μm或更小，40μm或更小，或35μm或更小))。例如，該混合物包含化合物1、稀釋劑、助流劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑和填料的組合物，其中以粉末形式提供這些組分當(dāng)中的每個(gè)組分(例如，提供中間直徑(利用光散射測(cè)定)250μm或更小直徑的顆粒(例如，150μm或更小，100μm或更小，50μm或更小，45μm或更小，40μm或更小，或35μm或更小))。在另一個(gè)實(shí)施例中，該混合物包含化合物1、稀釋劑、粘合劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑和填料的組合物，其中以粉末形式提供這些組分當(dāng)中的每個(gè)組分(例如，提供中間直徑(利用光散射測(cè)定)250μm或更小直徑的顆粒(例如，150μm或更小，100μm或更小，50μm或更小，45μm或更小，40μm或更小，或35μm或更小))。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該混合物包含化合物1與下列的任何組合的組合物：粘合劑，助流劑，稀釋劑，表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑和填料，其中這些組分當(dāng)中的每個(gè)組分基本上不含水。每個(gè)組分包含占組分重量的小于5wt%(例如，小于2wt%，小于1wt%，小于0.75wt%，小于0.5wt%，或小于0.25wt%)的水。例如，該混合物包含化合物1、稀釋劑、助流劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑和填料的組合物，其中這些組分當(dāng)中的每個(gè)組分基本上不含水。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組分包含占組分重量的小于5wt%(例如，小于2wt%，小于1wt%，小于0.75wt%，小于0.5wt%，或小于0.25wt%)的水。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，將該混合物壓制成為片劑是如下實(shí)現(xiàn)的：用混合物填充模板(例如，模具)，并對(duì)混合物施加壓力。這可以使用壓模或其它類似的裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，可以首先將化合物1和賦形劑的混合物加工成為粒形。然后，篩分顆粒，并按照藥物領(lǐng)域已知的方法壓成片劑，或配制成為膠囊形式。還應(yīng)該注意，在每次擠壓期間，對(duì)模板中的混合物施加壓力可以使用相同壓力重復(fù)進(jìn)行，或在擠壓期間使用不同壓力來(lái)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用施加足夠壓力的壓模來(lái)壓縮粉末組分或顆粒的混合物，形成在大約30分鐘時(shí)溶解大約50%或溶解更多的片劑(例如，在大約30分鐘時(shí)溶解大約55%或更多，在大約30分鐘時(shí)溶解大約60%或更多)。例如，使用壓模來(lái)壓縮該混合物，產(chǎn)生至少大約5kp(至少大約5.5kp，至少大約6kp，至少大約7kp，至少大約10kp或至少15kp)的片劑硬度。在有些情況下，壓縮該混合物，產(chǎn)生大約5和20kp之間的片劑硬度。

在一些實(shí)施方案中，包含本文所描述藥物組合物的片劑可以涂有占片劑重量的大約3.0wt%的薄膜包衣，其中薄膜包衣包含著色劑。在某些情況下，用于包衣片劑的著色劑懸浮液或溶液包含占該著色劑懸浮液或溶液重量的大約20%w/w的固體。在更進(jìn)一步情況下，可以用標(biāo)志、其它圖像(image)或文字給包衣片劑做標(biāo)志。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備藥物組合物的方法包括：提供固體形式的混合物，例如，粉末和/或液體組分的混合物，該混合物包含化合物1和一或多種選自下列的賦形劑：粘合劑，助流劑，稀釋劑，表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑和填料；將該混合物混合，直到混合物基本上均勻?yàn)橹?，將該混合物壓縮或壓制成為粒形。然后，將包含化合物1的顆粒組合物壓縮成片劑，或配制到膠囊劑中，如上面所描述或下面實(shí)施例所描述?；蛘?，制備藥物組合物的方法包括：提供化合物1和一或多種下列賦形劑的混合物：粘合劑，助流劑，稀釋劑，表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑和填料；將該混合物混合，直到混合物基本上均勻?yàn)橹梗褂幂亯簷C(jī)，使用下面實(shí)施例列出的干法成粒組合物，將該混合物壓縮/壓制成為粒形，或者，使用下面實(shí)施例列出的高剪切濕式顆粒壓制方法，將該混合物壓縮/壓縮成為顆粒。藥物制劑，例如，本文所描述的片劑，可以使用顆粒來(lái)制備，這種顆粒除了結(jié)合所選擇的本文描述的賦形劑之外，還結(jié)合了化合物1。

在一些實(shí)施方案中，使用人工攪拌、混合器、攪拌機(jī)、其任何聯(lián)用形式等等，通過(guò)攪拌、摻和、搖動(dòng)等等來(lái)將混合物混合。當(dāng)順序地加入組分或組分的組合物時(shí)，混合可以在順序加入之間進(jìn)行、可以在連續(xù)加入組分的整個(gè)過(guò)程中進(jìn)行混合、在加入所有組分或組分的組合物之后進(jìn)行混合或其任何組合形式。將混合物混合時(shí)，直到它基本上成為均勻組合物為止。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在合適的常規(guī)碾磨裝置中噴射研磨化合物1、i型化合物1、ii型化合物1、化合物1hcl鹽形式a，該裝置使用適合于制備在0.1微米和50微米之間具有顯著粒徑部分的顆粒的空氣壓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒徑在0.1微米和20微米之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒徑在0.1微米和10微米之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒徑在1.0微米和5微米之間。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物1、i型化合物1、ii型化合物1、化合物1hcl鹽形式a具有2.0微米的粒徑d50。

在各種實(shí)施方案中，可以與化合物1一起配制第二個(gè)治療劑，形成單一或單個(gè)劑量形式，例如，片劑或膠囊劑。

按照unitedstatespharmacopoeia29(unitedstatespharmacopeialconvention，inc.，rockville，md.，2005(“usp”))中的test711“dissolution”，可以對(duì)上面制備的劑型進(jìn)行體外溶解評(píng)價(jià)，測(cè)定活性物質(zhì)從該劑型中釋放的比例?？梢岳美绺咝б合嗌V(hplc)技術(shù)，方便地測(cè)定活性物質(zhì)的含量和雜質(zhì)水平。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用包裝材料，例如，高密度聚乙烯(hdpe)、低密度聚乙烯(ldpe)和/或聚丙烯和/或玻璃的容器和密封盒，玻璃紙薄片，鋁箔袋和由鋁或高密度聚氯乙烯(pvc)，任選包括干燥劑，聚乙烯(pe)，聚偏二氯乙烯(pvdc)，pvc/pe/pvdc，等等組成的泡罩或條板。使用藥物領(lǐng)域通常利用的化學(xué)或物理殺菌技術(shù)將包裝和其內(nèi)含物進(jìn)行合適的殺菌之后，這些包裝材料可以以無(wú)菌方式用于保存各種藥物組合物和制劑。

給予藥物組合物的方法

在一方面，可以每天或大約每24小時(shí)給予患者本發(fā)明的藥物組合物一次。或者，可以每天兩次或大約每12小時(shí)給予患者本發(fā)明的藥物組合物。以口服制劑形式給予這些藥物組合物，該口服制劑包含大約25mg、50mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg或400mg的化合物1。在該方面，除了化合物1之外，藥物組合物還包含填料；稀釋劑；崩解劑；表面活性劑；粘合劑和助流劑中的至少一種；和潤(rùn)滑劑。例如，400mg劑量的化合物1可以包括兩個(gè)本發(fā)明的片劑，每個(gè)包含200mg化合物1，或四個(gè)本發(fā)明的片劑，每個(gè)包含100mg化合物1。

還可以理解，本發(fā)明的化合物和可藥用組合物和制劑可以在聯(lián)合治療中使用；也就是說(shuō)，化合物1和其可藥用組合物可以與一或多種其它所需要的療法或醫(yī)療過(guò)程同時(shí)給予、在其之前或在其之后給予。用于聯(lián)合方案的療法(治療或過(guò)程)的具體組合將考慮目標(biāo)療法和/或過(guò)程的相容性以及所要達(dá)到的目標(biāo)治療效果。可以理解，所使用的療法對(duì)于相同病癥可以達(dá)到目標(biāo)效果(例如，本發(fā)明的化合物可以與另一種治療相同病癥所使用的藥劑同時(shí)給予)，或它們可以達(dá)到不同效果(例如，控制任何副作用)。本文使用的“其它治療劑”(其通常用于治療或預(yù)防具體疾病(例如，cftr介導(dǎo)的疾病)或病癥)被稱為“適合于所治療的疾病或病癥的治療劑”。

在一個(gè)實(shí)施方案中，其它治療劑選自：溶粘蛋白劑，支氣管擴(kuò)張劑，抗菌素，抗感染劑，消炎劑，不同于本發(fā)明的化合物1的cftr調(diào)節(jié)劑或營(yíng)養(yǎng)劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑是(r)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-n-(1-(2,3-二羥基丙基)-6-氟-2-(1-羥基-2-甲基丙-2-基)-1h-吲哚-5-基)環(huán)丙烷甲酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑是n-(5-羥基-2,4-二叔-丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑選自表1：

表1.

。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑是上述藥劑的任何組合物。例如，組合物可以包含化合物1、(r)-1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-n-(1-(2,3-二羥基丙基)-6-氟-2-(1-羥基-2-甲基丙-2-基)-1h-吲哚-5-基)環(huán)丙烷甲酰胺和n-(5-羥基-2,4-二叔-丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物可以包含化合物1、n-(5-羥基-2,4-二叔-丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺和表1中的任何一個(gè)化合物(即，表1的化合物1至14)或其任何組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，其它治療劑是抗菌素。本文使用的示范性的抗菌素包括：托普霉素，包括托普霉素吸入粉末(tip)，阿奇毒素，氨曲南，包括霧化形式的氨曲南，阿米卡星，包括其脂質(zhì)體制劑，環(huán)丙沙星，包括適合于吸入給藥的其制劑，左氧氟沙星，包括其霧化制劑和兩種抗菌素的聯(lián)用形式，例如，磷霉素(fosfomycin)和托普霉素組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑是mucolyte（溶粘蛋白劑）。本文使用的示范性的mucolytes（溶粘蛋白劑）包括pulmozyme?。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑是支氣管擴(kuò)張劑。示范性的氣管擴(kuò)張劑包括：沙丁胺醇，硫酸異丙喘寧(metaprotenerol)，乙酸吡布特羅，沙美特羅或tetrabuline硫酸鹽。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它藥劑是可有效恢復(fù)肺呼吸道表面液體的藥劑。這種藥劑提高鹽在細(xì)胞中的位移和從細(xì)胞當(dāng)中移出，使肺呼吸道中的粘液更水合化，并因此更容易廓清。示范性的這種藥劑包括：高滲鹽水，地紐福索(denufosol)四鈉([[(3s,5r)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3-羥基草脲胺-2-基（oxolan-2-yl）]甲氧基-羥基磷?；鵠[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-3，4-二羥基草脲胺-2-基（oxolan-2-yl）]甲氧基-羥基磷?；鵠氧基-羥基磷?；鵠磷酸氫鹽)，或bronchitol(甘露糖醇的吸入制劑)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是消炎劑，即，可以減輕肺部炎癥的藥劑。本文使用的示范性的這種藥劑包括：布洛芬，二十二碳六烯酸（docosahexanoicacid）(dha)，西地那非，吸入式谷胱甘肽，吡格列酮，羥氯奎或辛伐他汀(simavastatin)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是不同于化合物1的cftr調(diào)節(jié)劑，即，具有調(diào)節(jié)cftr活性的效果的藥劑。示范性的這種藥劑包括ataluren(“ptc124?”；3-[5-(2-氟苯基)-1,2,4-噁二唑-3-基]苯甲酸)，西那普肽(sinapultide)，蘭考韋泰(lancovutide)，depelestat(人重組體嗜中性白細(xì)胞彈性酶抑制劑)和cobiprostone(7-{(2r,4ar,5r,7ar)-2-[(3s)-1,1-二氟-3-甲基戊基]-2-羥基-6-氧代八氫環(huán)戊烷并[b]吡喃-5-基}庚酸)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是營(yíng)養(yǎng)劑。示范性的營(yíng)養(yǎng)劑包括胰脂肪酶(胰酶置換)，包括pancrease?，pancreacarb?，ultrase?或creon?，liprotomase?(以前的trizytek?)，aquadeks?或谷胱甘肽吸入劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，額外的營(yíng)養(yǎng)劑是胰脂肪酶。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是選自下列的化合物：慶大霉素，姜黃素，環(huán)磷酰胺，4-苯基丁酸酯，美格魯特(miglustat)，非洛地平，尼莫地平，philoxinb，geniestein，apigenin，camp/cgmp調(diào)節(jié)劑，例如洛利普利(rolipram)，西地那非，米利酮，他達(dá)拉非(tadalafil)，氨利酮，異丙基腎上腺素，沙丁胺醇和沙美特羅(almeterol)，去氧精胍啉(deoxyspergualin)，hsp90抑制劑，hsp70抑制劑，蛋白體抑制劑，例如epoxomicin，乳胞素(lactacystin)，等等。

在其它實(shí)施方案中，額外的藥劑是公開在wo2004028480、wo2004110352、wo2005094374、wo2005120497或wo2006101740中的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是顯示cftr調(diào)節(jié)活性的苯并[c]喹嗪鎓衍生物或顯示cftr調(diào)節(jié)活性的苯并吡喃衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是公開在美國(guó)專利us7,202,262、美國(guó)專利us6,992,096、us20060148864、us20060148863、us20060035943、us20050164973、wo2006110483、wo2006044456、wo2006044682、wo2006044505、wo2006044503、wo2006044502或wo2004091502中的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是公開在wo2004080972、wo2004111014、wo2005035514、wo2005049018、wo2006099256、wo2006127588或wo2007044560中的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，額外的藥劑是n-(5-羥基-2,4-二叔-丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予需要其的患者400mg化合物1，而后共同給予150mg的n-(5-羥基-2,4-二叔-丁基-苯基)-4-氧代-1h-喹啉-3-甲酰胺(化合物2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予需要其的患者400mg化合物1，而后共同給予250mg化合物2。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)給予一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的片劑，可以達(dá)到劑量要求。例如，通過(guò)給予每個(gè)包含200mg化合物1的兩個(gè)片劑或每個(gè)包含100mg化合物1的四個(gè)片劑，可以給予400mg化合物1?？梢砸园衔?和可藥用載體的藥物組合物形式給予化合物2。給藥時(shí)間可以持續(xù)，直到疾病得到改善為止，或直到患者的醫(yī)生給予建議為止，例如，給藥時(shí)間可以小于1周、1周、2周、3周或一個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。在共同給藥周期之前，可以進(jìn)行只是單獨(dú)化合物1的給藥周期。例如，可以給予2周的400mg化合物1，而后共同給予額外1周150mg或250mg化合物2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，給予需要其的患者400mg化合物1，一天一次，而后共同給予150mg化合物2，一天一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予需要其的患者400mg化合物1，一天一次，而后共同給予250mg化合物2，一天一次。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)給予一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的片劑，可以達(dá)到劑量要求。例如，通過(guò)給予每個(gè)包含200mg化合物1的兩個(gè)片劑或每個(gè)包含100mg化合物1的四個(gè)片劑，可以給予400mg化合物1?？梢砸园衔?和可藥用載體的藥物組合物形式給予化合物2。給藥時(shí)間可以持續(xù)，直到疾病得到改善為止，或直到患者的醫(yī)生給予建議為止，例如，給藥時(shí)間可以小于1周、1周、2周、3周或一個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。在共同給藥周期之前，可以進(jìn)行只是單獨(dú)化合物1的給藥周期。例如，可以給予2周的400mg化合物1，而后共同給予額外1周150mg或250mg化合物2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予需要其的患者400mg化合物1，一天一次，而后每12小時(shí)共同給予150mg化合物2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以給予需要其的患者400mg化合物1，一天一次，而后每12小時(shí)共同給予250mg化合物2。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)給予一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的片劑，可以達(dá)到劑量要求。例如，通過(guò)給予每個(gè)包含200mg化合物1的兩個(gè)片劑或每個(gè)包含100mg化合物1的四個(gè)片劑，可以給予400mg化合物1。可以以包含化合物2和可藥用載體的藥物組合物形式給予化合物2。給藥時(shí)間可以持續(xù)，直到疾病得到改善為止，或直到患者的醫(yī)生給予建議為止，例如，給藥時(shí)間可以小于1周、1周、2周、3周或一個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。在共同給藥周期之前，可以進(jìn)行只是單獨(dú)化合物1的給藥周期。例如，可以給予2周的400mg化合物1，而后共同給予額外1周150mg或250mg化合物2。

這些聯(lián)用形式可有效用于治療本文所描述的疾病，包括囊性纖維化。這些聯(lián)用形式也在本文所描述的試劑盒中使用。

存在于本發(fā)明組合物中的額外的治療劑的數(shù)量不超過(guò)通常在包含該治療劑作為唯一活性劑的組合物中所給予的數(shù)量。優(yōu)選，相對(duì)于額外的治療劑在包含其作為唯一治療活性劑的組合物中通常存在的數(shù)量，在本發(fā)明公開的組合物中額外的治療劑的數(shù)量在大約50%至100%的范圍。

組合物的治療用途

在某些實(shí)施方案中，包含化合物1和任選額外藥劑的可藥用組合物可用于治療在呼吸和非呼吸上皮的頂膜顯示殘余cftr活性的患者的囊性纖維化或減輕其嚴(yán)重程度。可以使用本領(lǐng)域已知的方法，例如，標(biāo)準(zhǔn)電生理學(xué)、生物化學(xué)或組織化學(xué)技術(shù)，容易地檢測(cè)上皮表面的殘余cftr活性的存在。這種方法使用體內(nèi)或體表外電生理學(xué)技術(shù)測(cè)定汗液或唾液的cl^-濃度，或使用體表外生物化學(xué)或組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞表面密度，從而確定cftr活性。使用這種方法，可以容易地檢測(cè)各種不同突變的患者雜合體或純合子的殘余cftr活性，包括最常見突變?chǔ)膄508以及其它突變例如g551d突變或r117h突變的患者純合子或雜合體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所描述的化合物1或其可藥用組合物可有效用于治療顯示殘余cftr活性的某些基因型患者的囊性纖維化或減輕其嚴(yán)重程度，例如，iii型突變(削弱調(diào)節(jié)或門控)、iv型突變(改變傳導(dǎo)性)或v型突變(降低合成)(leer.choo-kang,pamelal.,zeitlin,typei,ii,iii,iv,andvcysticfibrosistansmembraneconductanceregulatordefectsandopportunitiesoftherapy;currentopinioninpulmonarymedicine6:521-529,2000)。顯示殘余cftr活性的其它患者基因型包括這些種類之一的患者純合子或與任何其它突變型的雜合體，包括i型突變、ii型突變或沒有分類的突變。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所描述的化合物1或其可藥用組合物可有效用于治療患者的囊性纖維化或減輕其嚴(yán)重程度，這種患者具有某些臨床表型，例如，典型地與上皮頂膜中的殘余cftr活性數(shù)量有關(guān)的中度至輕微的臨床表型。這種表型包括胰腺機(jī)能不全的患者或確診患有自發(fā)性胰腺炎和先天性不存在雙向輸精管或輕微肺疾病的患者。

所需要的確切數(shù)量將根據(jù)患者的不同而不同，取決于患者的物種、年齡、和一般狀況，感染的嚴(yán)重程度、具體藥劑、它的給藥模式，等等。為了容易給藥和劑量的均勻性，優(yōu)選，將本發(fā)明的化合物配制為劑量單位形式。本文使用的詞語(yǔ)“劑量單位形式”是指適合于所治療患者的藥劑的物理離散單位。然而，應(yīng)該理解，本發(fā)明化合物和組合物的總的日用量取決于主治醫(yī)師的可靠的醫(yī)療判斷。對(duì)于任何具體患者或有機(jī)體來(lái)說(shuō)，具體有效劑量水平取決于各種因素，包括：所治療的病癥和該病癥的嚴(yán)重程度；所使用的具體化合物的活性；所使用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康情況、性別和飲食；所使用的具體化合物的給藥時(shí)間、給藥途徑和排出速率；治療期限；在組合藥物中使用的藥物或與所使用的具體化合物相符的藥物，和醫(yī)療領(lǐng)域眾所周知的類似因素。本文使用的術(shù)語(yǔ)“患者”是指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。

在本申請(qǐng)中的任何地方，如果化合物的名稱不能準(zhǔn)確地描述化合物的結(jié)構(gòu)，則該結(jié)構(gòu)可替代該名稱，并以其為準(zhǔn)。

實(shí)施例

xrpd(x射線粉末衍射)

在brukerd8discover粉末衍射儀(帶有hi-star二維檢測(cè)器和平面石墨單色器)上收集化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a的x射線衍射(xrd)數(shù)據(jù)。在40kv、35ma下使用具有kα輻射的cu密封管。在25℃，將樣品放置在零背景硅片上。對(duì)于每個(gè)樣品，在2個(gè)不同的θ2角度(8度和26度)，在120秒時(shí)收集兩個(gè)數(shù)據(jù)幀。將該數(shù)據(jù)用gadds軟件整合，并用diffract^pluseva軟件融合。報(bào)道的峰位置的不確定性是±0.2度。

噴射研磨說(shuō)明

將未微粉化的化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a篩分，使其破塊，而后將其放到噴射碾機(jī)料斗中。所有的篩網(wǎng)是一次性篩網(wǎng)，在使用之前擦凈。將未微粉化的化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a加入到噴射碾機(jī)料斗中，使用壓縮氮?dú)鈦?lái)控制進(jìn)料速率。氣體壓力范圍是40-45/45-70(噴射管/碾機(jī))psi，進(jìn)料速率范圍是0.5-1.6kg/小時(shí)。在碾機(jī)中，通過(guò)顆粒-顆粒和顆粒-壁之間的碰撞，使化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a微粉化，并將加工的化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a注入到微粉化產(chǎn)品容器中。人們普遍相信，利用軸銷式碾機(jī)(pinmilling)，部分地基于如上所述的條件，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可以使化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a達(dá)到合適的粒徑。

差示掃描量熱(dsc)

使用dscq100v9.6build290(tainstruments，newcastle，de)，收集化合物1、i型化合物1、ii型化合物1或化合物1hcl鹽形式a的差示掃描量熱(dsc)數(shù)據(jù)。用銦校正溫度，用藍(lán)寶石校正熱容量。將3-6mg樣品稱量到鋁盤中，使用帶有1個(gè)針孔的蓋壓緊。從25℃至350℃掃描樣品，加熱速率1.0℃/min，并用50ml/min的氮?dú)獯祾?。用thermaladvantageqseriestmversion2.2.0.248軟件收集數(shù)據(jù)，用通用分析軟件4.1d版本(tainstruments，newcastle，de)進(jìn)行分析。報(bào)告編號(hào)代表單一的分析。

i型化合物1、ii型化合物1和化合物1hcl鹽形式a的單晶結(jié)構(gòu)測(cè)定

利用配備有密封管cukα源和apexiiccd檢測(cè)器的brukerapexii衍射器獲得衍射數(shù)據(jù)。使用shelx程序(sheldrick，g.m.，actacryst.，(2008)a64，112-122)來(lái)解析和精修結(jié)構(gòu)?；谙到y(tǒng)缺乏和強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)，在p21/n空間群中解析和精修結(jié)構(gòu)。

vitride?(二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉[或naalh2(och2ch2och3)2]，65wgt%溶液，在甲苯中)購(gòu)買于aldrichchemicals。

2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸購(gòu)買于saltigo(lanxesscorporation的分支機(jī)構(gòu))。

(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-甲醇的制備

使商購(gòu)的2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-甲酸(1.0eq)在甲苯(10vol)中形成漿液。通過(guò)加入漏斗加入vitride?(2eq)，要求加入速度必須保持溫度在15-25℃。在加入的最后，使溫度升至40℃，保持2小時(shí)，然后通過(guò)加入漏斗小心地加入10%(w/w)naoh水溶液(aq)(4.0eq)，保持溫度在40-50℃。額外攪拌30分鐘之后，在40℃分離各層。將有機(jī)相冷卻至20℃，然后用水(2x1.5vol)洗滌，干燥(na2so4)，過(guò)濾，濃縮，得到粗品(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-甲醇，其直接用于下一步。

制備5-氯甲基-2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯

將(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-甲醇(1.0eq)溶于mtbe(5vol)中。加入催化數(shù)量的4-(n,n-二甲基)氨基吡啶(dmap)(1mol%)，并通過(guò)加入漏斗加入socl2(1.2eq)。加入socl2，加入速度應(yīng)該使反應(yīng)器中的溫度保持在15-25℃。將溫度升至30℃，保持1小時(shí)，而后冷卻至20℃。通過(guò)加入漏斗加入水(4vol)，同時(shí)保持溫度小于30℃。額外攪拌30分鐘之后，分離各層。攪拌有機(jī)層，加入10%(w/v)naoh水溶液(4.4vol)。攪拌15至20分鐘之后，分離各層。然后干燥(na2so4)有機(jī)相，過(guò)濾，濃縮，得到粗品5-氯甲基-2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯，其直接用于下一步。

制備(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈

將5-氯甲基-2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯(1eq)的dmso(1.25vol)溶液加入到nacn(1.4eq)的dmso(3vol)漿液中，同時(shí)保持溫度在30-40℃之間。將該混合物攪拌1小時(shí)，而后加入水(6vol)，而后加入甲基叔丁基醚(mtbe)(4vol)。攪拌30分鐘之后，分離各層。用mtbe(1.8vol)提取水層。用水(1.8vol)洗滌合并的有機(jī)層，干燥(na2so4)，過(guò)濾，濃縮，得到粗品(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈(95%)，其直接用于下一步。

合成(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-1-乙酸乙酯-乙腈

用氮?dú)獯祾叻磻?yīng)器，并加入900ml甲苯。通過(guò)氮?dú)獯祾邅?lái)使溶劑脫氣，吹掃不少于16小時(shí)。然后向該反應(yīng)器中加入na3po4(155.7g，949.5mmol)，而后加入二(二亞芐基丙酮)鈀(0)(7.28g，12.66mmol)。在23℃，用10分鐘從氮?dú)獯祾叩募尤肼┒分屑尤?0%w/w叔丁基膦的己烷(51.23g，25.32mmol)溶液。將該混合物攪拌50分鐘，此時(shí)，用1分鐘加入5-溴-2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯(75g，316.5mmol)。額外攪拌50分鐘之后，用5分鐘向該混合物中加入氰乙酸乙酯(71.6g，633.0mmol)，而后加入一份水(4.5ml)。用40分鐘將該混合物加熱至70℃，每1-2小時(shí)用hplc分析反應(yīng)物至產(chǎn)物的百分轉(zhuǎn)化率。觀察到完全轉(zhuǎn)化之后(典型地5-8小時(shí)之后，轉(zhuǎn)化100%)，將該混合物冷卻至20-25℃，通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾。用甲苯(2x450ml)沖洗硅藻土墊，并在60-65℃將合并的有機(jī)物真空濃縮至300ml。向濃縮物中加入225mldmso，在70-80℃真空濃縮，直到溶劑停止蒸餾為止。將該溶液冷卻至20-25℃，并在步驟2的制備中用dmso稀釋至900ml。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.16–7.10(m,2h),7.03(d,j=8.2hz,1h),4.63(s,1h),4.19(m,2h),1.23(t,j=7.1hz,3h)。

合成(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈

用20分鐘向上述(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-1-乙酸乙酯-乙腈的dmso溶液中加入3nhcl(617.3ml，1.85mol)，同時(shí)保持內(nèi)部溫度<40℃。然后用1小時(shí)將該混合物加熱到75℃，每1-2小時(shí)用hplc分析轉(zhuǎn)化率(%)。當(dāng)觀察到轉(zhuǎn)化率>99%時(shí)(典型地5-6小時(shí)之后)，將該反應(yīng)冷卻至20-25℃，用mtbe(2x525ml)提取，在提取期間，用足夠的時(shí)間完成相分離。將合并的有機(jī)提取物用5%nacl(2x375ml)洗滌。然后將該溶液轉(zhuǎn)入適合于1.5-2.5torr真空蒸餾的裝置(配備有冷卻的接收燒瓶)中。將該溶液在<60℃條件下真空濃縮，除去溶劑。然后，在125-130℃(烘箱溫度)和1.5-2.0torr條件下，從得到的油中蒸餾出(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈。從5-溴-2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯中分離出(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈，是清澈的油，產(chǎn)率66%(2步)，hplc純度為91.5%auc(相當(dāng)于實(shí)測(cè)含量95%w/w)。¹hnmr(500mhz,dmso)δ7.44(brs,1h),7.43(d,j=8.4hz,1h),7.22(dd,j=8.2,1.8hz,1h),4.07(s,2h)。

制備(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙腈

將(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-乙腈(1.0eq)、50wt%koh水溶液(5.0eq)、1－溴－2－氯乙烷(1.5eq)和oct4nbr(0.02eq)的混合物在70℃下加熱1小時(shí)。將該反應(yīng)混合物冷卻，然后用mtbe和水后處理。用水和鹽水洗滌有機(jī)相。除去溶劑，得到(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙腈。

制備1-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷甲酸

使用6mnaoh(8當(dāng)量)/乙醇(5vol)，將(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙腈在80℃水解過(guò)夜。將該混合物冷卻至室溫，并真空蒸發(fā)乙醇。將殘余物吸收在水和mtbe中，加入1mhcl，分離各層。然后用二環(huán)己基胺(dcha)(0.97當(dāng)量)處理mtbe層。將該漿液冷卻至0℃，過(guò)濾，用庚烷洗滌，得到相應(yīng)的dcha鹽。將鹽吸收到mtbe和10%枸櫞酸中，攪拌，直到所有的固體溶解為止。分離各層，用水和鹽水洗滌mtbe層。溶劑換為庚烷，而后過(guò)濾，在真空烘箱中、在50℃干燥過(guò)夜之后，得到1-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷甲酸。

制備1-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷羰基氯

使1-(2,2-二氟-1,3-苯并二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙烷甲酸(1.2eq)在甲苯(2.5vol)中形成漿液，并將該混合物加熱至60℃。通過(guò)加入漏斗加入socl2(1.4eq)。30分鐘之后，從該反應(yīng)混合物中蒸餾出甲苯和socl2。加入額外的甲苯(2.5vol)，并將得到的混合物再次蒸餾，剩下產(chǎn)物酰氯油，其不用進(jìn)一步純化就使用。

制備3-(3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯

將2-溴-3-甲基吡啶(1.0eq)溶于甲苯(12vol)中。加入k2co3(4.8eq)，而后加入水(3.5vol)。在氮?dú)饬鳁l件下，將得到的混合物加熱至65℃，保持1小時(shí)。然后加入3-(叔丁氧羰基)苯基硼酸(1.05eq)和pd(dppf)cl2·ch2cl2(0.015eq)，并將該混合物加熱至80℃。2小時(shí)之后，停止加熱，加入水(3.5vol)，并分離各層。然后用水(3.5vol)洗滌有機(jī)相，用10%甲磺酸水溶液(2eqmsoh，7.7vol)提取。用50%naoh水溶液(2eq)使水相呈堿性，并用etoac(8vol)提取。將有機(jī)層濃縮，得到粗品3-(3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯(82%)，其直接用于下一步。

制備2-(3-(叔丁氧羰基)苯基)-3-甲基吡啶-1-氧化物

將3-(3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯(1.0eq)溶于etoac(6vol)中。加入水(0.3vol)，而后加入脲-過(guò)氧化氫(3eq)。然后將固體鄰苯二酸酐(3eq)分批加入到該混合物中，加入速度應(yīng)該保持反應(yīng)器中的溫度低于45℃。鄰苯二酸酐加入完畢后，將該混合物加熱至45℃。額外攪拌4小時(shí)之后，停止加熱。通過(guò)加入漏斗加入10%w/wna2so3水溶液(1.5eq)。na2so3加入完成之后，將該混合物額外攪拌30分鐘，并分離各層。攪拌有機(jī)層，加入10%wt/wtna2co3水溶液(2eq)。攪拌30分鐘之后，分離各層。用13%w/vnacl水溶液洗滌有機(jī)相。然后過(guò)濾有機(jī)相，濃縮，得到粗品2-(3-(叔丁氧羰基)苯基)-3-甲基吡啶-1-氧化物(95%)，其直接用于下一步。

制備3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯

將2-(3-(叔丁氧羰基)苯基)-3-甲基吡啶-1-氧化物(1eq)和吡啶(py,4eq)的乙腈(8vol)溶液加熱至70℃。用50分鐘通過(guò)加入漏斗加入甲磺酸酐(ms2o,1.5eq)的mecn(2vol)溶液，同時(shí)保持溫度低于75℃。加入完成之后，額外攪拌該混合物0.5小時(shí)。然后將該混合物冷卻至環(huán)境溫度。通過(guò)加入漏斗加入乙醇胺(10eq)。攪拌2小時(shí)之后，加入水(6vol)，并將該混合物冷卻至10℃。攪拌3小時(shí)之后，過(guò)濾收集固體，用水(3vol)、2:1乙腈/水(3vol)和乙腈(2x1.5vol)洗滌。在真空烘箱中、在50℃、在細(xì)微的氮?dú)饬鳁l件下，將固體干燥至恒重(差值<1%)，得到3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯紅黃色固體(53%產(chǎn)率)。

制備3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)-環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯

將上述粗品酰氯溶于甲苯(2.5vol，基于酰氯)中，并通過(guò)加入漏斗加入到3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯(1eq)、dmap(0.02eq)和三乙胺(3.0eq)的甲苯(4vol，基于3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯)混合物中。2小時(shí)之后，將水(4vol，基于3-(6-氨基-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁基酯)加入到該反應(yīng)混合物中。攪拌30分鐘之后，分離各層。然后過(guò)濾有機(jī)相，濃縮，得到3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯的稠油(定量的粗品產(chǎn)率)。加入乙腈(3vol，基于粗品)，蒸餾，直到出現(xiàn)結(jié)晶為止。加入水(2vol，基于粗品)，并將該混合物攪拌2小時(shí)。過(guò)濾收集固體，用1:1(體積)乙腈/水(2x1個(gè)體積，基于粗品)洗滌，在過(guò)濾器上部分地真空干燥。將固體在真空烘箱中、在60℃、在細(xì)微的氮?dú)饬鳁l件下干燥至恒重(差值<1%)，得到3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯褐色固體。

制備3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸·hcl鹽

向3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯(1.0eq)的mecn(3.0vol)漿液中加入水(0.83vol)，而后加入濃hcl水溶液(0.83vol)。將該混合物加熱至45±5℃。攪拌24至48小時(shí)之后，該反應(yīng)完成，將該混合物冷卻至周圍溫度。加入水(1.33vol)，并攪拌該混合物。過(guò)濾收集固體，用水(2x0.3vol)洗滌，在過(guò)濾器上部分地真空干燥。將固體在真空烘箱中、在60℃、在細(xì)微的氮?dú)饬鳁l件下干燥至恒重(差值<1%)，得到3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-苯甲酸·hcl類白色固體。

化合物1的¹hnmr譜示于圖20中，圖21描述了化合物1的hcl鹽的¹hnmr譜。

下面的表2列出了化合物i的¹hnmr數(shù)據(jù)。

表2.

。

i型化合物1的制備，方法a

將3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)苯甲酸·hcl(1eq)在水(10vol)中的漿液在室溫下攪拌。攪拌24小時(shí)之后，獲取樣品。過(guò)濾樣品，并將固體用水(2次)洗滌。對(duì)固體試樣進(jìn)行dsc分析。當(dāng)dsc分析表明完全轉(zhuǎn)化為i型時(shí)，過(guò)濾收集固體，用水(2x1.0vol)洗滌，并部分地在過(guò)濾器上真空干燥。然后，在真空烘箱中、在60℃、在細(xì)微的氮?dú)饬鳁l件下，將固體干燥至恒重(差值<1%)，得到i型化合物1類白色固體(98%產(chǎn)率)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)9.14(s,1h),7.99-7.93(m,3h),7.80-7.78(m,1h),7.74-7.72(m,1h),7.60-7.55(m,2h),7.41-7.33(m,2h),2.24(s,3h),1.53-1.51(m,2h),1.19-1.17(m,2h)。

i型化合物1的制備，方法b

將3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯(1.0eq)的甲酸(3.0vol)溶液在攪拌下加熱至70±10℃，保持8小時(shí)。當(dāng)剩余至多1.0%auc(色譜方法)的3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯)時(shí)，認(rèn)為反應(yīng)完成。將該混合物冷卻至環(huán)境溫度。將該溶液加入到水(6vol)中，在50℃下加熱，并將該混合物攪拌。然后將該混合物加熱到70±10℃，直到3-(6-(1-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烯-5-基)環(huán)丙甲酰胺基)-3-甲基吡啶-2-基)-叔丁基苯甲酸酯的水平不超過(guò)0.8%(auc)為止。過(guò)濾收集固體，用水(2x3vol)洗滌，在過(guò)濾器上部分地真空干燥。在真空烘箱中、在60℃、在細(xì)微的氮?dú)饬鳁l件下，將固體干燥至恒重(差值<1%)，得到i型化合物1類白色固體。

i型化合物1的dsc圖示于圖22中。i型化合物1在大約204℃出現(xiàn)熔融。

由i型化合物1的單晶結(jié)構(gòu)計(jì)算x射線衍射圖，并示于圖1中。表3列出了圖1的計(jì)算的峰。

表3.

。

i型化合物1的實(shí)際x射線粉末衍射圖示于圖2中。表4列出了圖2的實(shí)際的峰。

表4.

。

將濃1-丁醇溶液以0.2℃/min的速度從75℃冷卻至10℃，獲得i型化合物1的無(wú)色晶體。選擇0.50x0.08x0.03mm規(guī)格的晶體，用礦物油洗凈，安裝在micromount上，并定位在brukerapexii系統(tǒng)的中心。獲得倒易空間中分離的三批40幀信息圖像(image)，從而提供取向矩陣和起始晶胞參數(shù)。獲得最終晶胞參數(shù)，并基于全部數(shù)據(jù)組進(jìn)行精修。

獲得倒易空間的衍射數(shù)據(jù)組，達(dá)到0.82?的分辨率，使用0.5°步長(zhǎng)，每幀使用30s曝光時(shí)間。在100(2)k下收集數(shù)據(jù)。使用apexii軟件完成晶胞參數(shù)的強(qiáng)度積分和精修。數(shù)據(jù)收集之后，觀察晶體表明沒有分解的跡象。

基于單晶x射線分析的i型化合物1的構(gòu)象圖片示于圖23中。i型化合物1是單斜晶的，p21/n，具有下列單位晶胞大小：a=4.9626(7)?，b=12.299(2)?，c=33.075(4)?，β=93.938(9)°，v=2014.0?³，z=4。由結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)計(jì)算的i型化合物1的密度是1.492g/cm³(在100k下)。

由i型化合物1制備ii型化合物1

使i型化合物1(大約30mg)在500μl合適的溶劑(例如，甲醇，乙醇，丙酮，2-丙醇，乙腈，四氫呋喃，乙酸甲酯，2-丁酮，甲酸乙酯和-甲基四氫呋喃)中形成漿液，并保持兩天。然后離心或真空過(guò)濾該漿液，將其在室溫下放置過(guò)夜，至干，得到ii型化合物1。

ii型化合物1丙酮溶劑化物的dsc圖示于圖15中，顯示了兩個(gè)相變。ii型化合物1丙酮溶劑化物的熔點(diǎn)出現(xiàn)在大約188℃和205℃。

ii型化合物1的實(shí)際x射線粉末衍射圖示于圖3中。表5以相對(duì)強(qiáng)度的遞減次序列出了圖3的實(shí)際的峰。

表5.

。

基于單晶x射線分析的ii型化合物1丙酮溶劑化物的結(jié)構(gòu)描述示于圖24中。在ii型化合物1和丙酮之間的化學(xué)計(jì)量是大約4.4:1(4.48:1，由¹hnmr計(jì)算；4.38:1，由x射線計(jì)算)。晶體結(jié)構(gòu)顯示了一束分子，其中每個(gè)單位晶胞存在兩個(gè)空隙或袋，或每個(gè)主體分子存在1個(gè)空隙。在丙酮溶劑化物中，大約92%的空隙被丙酮分子占據(jù)。ii型化合物1是單斜晶的p21/n空間群，具有下列單位晶胞大?。篴=16.5235(10)?，b=12.7425(8)?，c=20.5512(13)?，α=90°，β=103.736(4)°，γ=90°，v=4203.3(5)?³,=4。由結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)計(jì)算的ii型化合物1中的化合物1的密度是1.430/cm³(在100k下)。

ii型化合物1丙酮溶劑化物的固態(tài)¹³cnmr譜示于圖25中。表6提供了相關(guān)峰的化學(xué)位移。

表6.

。

ii型化合物1丙酮溶劑化物的固態(tài)¹⁹fnmr譜示于圖26中。加注星號(hào)的峰表示自旋邊帶。表7提供了相關(guān)峰的化學(xué)位移。

表7.

。

制備化合物1hcl鹽形式a

將化合物1的hcl鹽的乙醇濃縮溶液緩慢蒸發(fā)，獲得化合物1hcl鹽形式a的無(wú)色晶體。選擇0.30x1/5x0.15mm規(guī)格的晶體，用礦物油洗凈，安裝在micromount上，并定位在brukerapexii衍射器的中心。獲得倒易空間中分離的三批40幀信息圖像(image)，從而提供取向矩陣和起始晶胞參數(shù)。獲得最終晶胞參數(shù)，并基于全部數(shù)據(jù)組進(jìn)行精修。

圖18提供了基于單晶分析的化合物1hcl鹽形式a的二聚體的構(gòu)象。由晶體結(jié)構(gòu)計(jì)算的化合物1hcl鹽形式a的x射線衍射圖示于圖27中。表8包括以相對(duì)強(qiáng)度的遞減次序列出的圖27的計(jì)算峰。

表8.

。

示范性的包含化合物1的口服藥物制劑

制備片劑，其具有表9的示范性片劑1a所列組分和數(shù)量，包含100mgapi，即i型化合物1。使用干式碾壓儀器配制方法，制備示范性的片劑1a(配制具有100mg化合物1)。在表9中，等級(jí)/商標(biāo)是微晶纖維素：avicelph102；甘露糖醇：pearlitolsd100；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；和膠態(tài)二氧化硅：cabosil。

表9.

。

制備片劑，其具有表10的示范性片劑1b所列組分和數(shù)量，包含100mgapi，即i型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1b(配制具有100mgi型化合物1)。在表10中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆?；旌衔?微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片劑組合物中-交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol。

表10.

。

制備片劑，其具有表11的示范性片劑1c所列組分和數(shù)量，包含100mgapi，即晶體i型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1c(配制具有100mg晶體i型化合物1)。在表11中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆?；旌衔?微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片劑組合物中-交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol。

表11.

。

制備片劑，其具有表12的示范性片劑1d所列組分和數(shù)量，包含200mgapi，即晶體i型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1d(配制具有200mg晶體i型化合物1)。在表12中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆?；旌衔?微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片劑組合物中-微晶纖維素：avicelph200；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；和硬脂酸鎂：5712。

表12.

。

制備片劑，其具有表13的示范性片劑1e所列組分和數(shù)量，包含200mgapi，即晶體i型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1e(配制具有200mg晶體i型化合物1)。在表13中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆粒混合物-微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片芯組合物中-微晶纖維素：avicelph200；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；和硬脂酸鎂：5712；在薄膜包衣中-薄膜包衣：opadryii；蠟：棕櫚蠟。

表13.

。

制備片劑，其具有表14的示范性片劑1f所列組分和數(shù)量，包含200mgapi，即晶體i型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1f(配制具有200mg晶體i型化合物1)。在表14中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆粒混合物-微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片芯組合物中-微晶纖維素：avicelph200；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；和硬脂酸鎂：5712；在薄膜包衣中-薄膜包衣：opadryii；蠟：棕櫚蠟。

表14.

。

制備片劑，其具有表15的示范性片劑1g所列組分和數(shù)量，包含100mgapi，即晶體i型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1g(配制具有100mg晶體i型化合物1)。在表15中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆粒混合物-微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片劑組合物中-交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol。

表15.

。

制備片劑，其具有表16的示范性片劑1h所列組分和數(shù)量，包含100mgapi，即i型或ii型晶體化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1h(配制具有100mgi型或ii型晶體化合物1)。在表16中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆?；旌衔?微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片芯組合物中-微晶纖維素：avicelph200；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；和硬脂酸鎂：5712。

表16.

。

制備片劑，其具有表17的示范性片劑1i所列組分和數(shù)量，包含100mgapi，即晶體i型或ii型化合物1。使用濕式高剪切顆粒配制方法，制備示范性的片劑1i(配制具有100mg晶體i型或ii型化合物1)。在表17中，等級(jí)/商標(biāo)如下。高剪切顆粒混合物-微晶纖維素：avicelph101；甘露糖醇：pearlitolc50；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；聚乙烯吡咯烷酮：kollidonpvpk30；在片芯組合物中-微晶纖維素：avicelph200；交聯(lián)羧甲纖維素鈉：acdisol；和硬脂酸鎂：5712。

表17.

。

由碾壓顆粒組合物形成片劑

設(shè)備/方法

設(shè)備

輥壓機(jī)：alexanderwerkwp120，vectortf-mini，或vectortf-labo。

篩分/稱量

在稱重之前或之后，可以篩分化合物1和賦形劑。合適的篩目大小是20目、40目或60目。為了簡(jiǎn)化篩分，化合物1可以預(yù)先與一或多種賦形劑混合。

混合

可以用不同順序?qū)⒒衔?和賦形劑加入到攪拌機(jī)中?？梢栽趖urbula攪拌機(jī)或v殼攪拌機(jī)中進(jìn)行攪拌?？梢栽跊]有潤(rùn)滑劑的條件下，將組分?jǐn)嚢?0分鐘，而后與潤(rùn)滑劑一起額外攪拌3分鐘。

碾壓

可以將該混合物碾壓成為帶狀物，并使用alexanderwerkwp120碾壓成為顆粒。使用的輥可以是25mm輥，使用18至50bar的壓制壓力，輥速為3至12rpm，螺旋進(jìn)料器速度為20至80rpm。一體化碾機(jī)的篩網(wǎng)大小可以是：上篩：2mm；底篩：0.8mm。

混合

可以使用v殼混合機(jī)，將碾壓的顆粒與額外的顆粒賦形劑例如填料和潤(rùn)滑劑一起混合?；旌蠒r(shí)間可以是5、3或1分鐘。

壓制

使用單工作站rivaminipress(帶有10mm工具)，將壓縮混合物壓制成片劑。100mg劑量的片劑的重量可以是大約200、250或300mg。

薄膜包衣

使用盤式涂布機(jī)，例如，o'haralabcoat，可以將片劑進(jìn)行薄膜包衣。

印刷

可以用例如hartnettdelta印刷機(jī)，在片劑的一個(gè)或兩個(gè)面上將薄膜包衣片印上字母圖案。

由高剪切顆粒組合物形成片劑

設(shè)備/方法

設(shè)備

造粒機(jī)：proceptmipro，帶有250ml或1l造粒斗。

篩分/稱量

在稱重之前或之后，可以篩分化合物1和賦形劑。合適的篩目大小是20目、40目或60目。為了簡(jiǎn)化篩分，化合物1可以預(yù)先與一或多種賦形劑混合。

造粒操作

造粒流體–將sls和粘合劑加入到凈化水中，混合，直到溶解為止。合適的比例是2.5%w/wsls和10.0%w/wpvpk30(在水中)。

造粒–將賦形劑和化合物1加入到造粒斗中。加入順序可以是化合物1、崩解劑、稀釋劑和填料?？梢詫⒔M分在250ml斗中混合1分鐘，推進(jìn)器速度1000rpm，切碎機(jī)速度1000rpm?？梢栽?000rpm的推進(jìn)器速度、4000rpm的切碎機(jī)速度下進(jìn)行造粒，同時(shí)用注射泵加入造粒流體，速度1.5至4.5g/min。流體加入時(shí)間可以是4至12分鐘。加入所需的粘合劑流體之后，可以使顆粒形成濕塊大約10秒鐘至大約1分鐘。本發(fā)明的高剪切造粒方法的一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是使用造粒流體，其包含表面活性劑和粘合劑兩者，通過(guò)提高濕潤(rùn)性而使造粒更優(yōu)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑是sls。

干燥

可以使用真空烘箱、盤式烘燥機(jī)、雙錐形干燥器或流化床式干燥機(jī)將顆粒干燥。已使用真空烘箱干燥顆粒(用氮?dú)獯祾?。

混合

顆?？梢耘c額外的顆粒賦形劑一起混合。使顆粒與額外的顆粒崩解劑、稀釋劑、填料和潤(rùn)滑劑一起混合。在潤(rùn)滑之前（pre-lubricant），使用turbula混合機(jī)將顆?；旌?分鐘，與潤(rùn)滑劑一起混合1分鐘。可以使用更大規(guī)模的混合機(jī)，例如，4-夸脫v殼混合機(jī)。

壓制

使用單工作站rivaminipress(帶有8mm或10mm工具)，將壓縮混合物壓制成片劑。100mg劑量的片劑的重量可以是大約160、200或250mg。

薄膜包衣

使用盤式涂布機(jī)，例如，o'haralabcoat，可以將片劑進(jìn)行薄膜包衣。

印刷

可以用例如hartnettdelta印刷機(jī)，在片劑的一個(gè)或兩個(gè)面上將薄膜包衣片印上字母圖案。

劑量給藥方案

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療患者的cftr介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括：給予需要其的患者有效量的本發(fā)明提供的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每?jī)芍芙o予患者一次該藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每周給予患者一次該藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每三天給予患者一次該藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每天給予患者一次該藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)藥物組合物是按照表9、10、11、12、13、14、15、16或17的片劑時(shí)，每天給藥一次。

試驗(yàn)

檢測(cè)和測(cè)定化合物的δf508-cftr糾正性能的試驗(yàn)

檢驗(yàn)化合物的δf508-cftr調(diào)節(jié)性能的膜電位光學(xué)法（membranepotentialopticalmethods）

光學(xué)膜電位試驗(yàn)使用gonzalez和tsien(參見gonzalez，j.e.和r.y.tsien(1995)“voltagesensingbyfluorescenceresonanceenergytransferinsinglecells”biophysj69(4)：1272-80，gonzalez，j.e.和r.y.tsien(1997)“improvedindicatorsofcellmembranepotentialthatusefluorescenceresonanceenergytransfer”chembiol4(4)：269-77)描述的壓敏fret檢測(cè)器與測(cè)定熒光變化的儀器例如電壓/離子探針讀數(shù)器(vipr)(參見gonzalez，j.e.，k.oades等人(1999)“cell-basedassaysandinstrumentationforscreeningion-channeltargets”drugdiscovtoday4(9)：431-439)的聯(lián)用形式。

這些壓敏試驗(yàn)基于膜溶解的壓敏染料disbac2(3)和熒光磷脂cc2-dmpe(其附著于質(zhì)膜的外層小葉片，并起到fret供體的作用)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)的變化。膜電位(vm)的變化導(dǎo)致帶負(fù)電荷的disbac2(3)跨過(guò)質(zhì)膜重新分布，并且從cc2-dmpe轉(zhuǎn)移的能量相應(yīng)地發(fā)生變化。使用vipr^tmii監(jiān)測(cè)熒光發(fā)射的變化，vipr^tmii是一體化的液體處理器和熒光檢測(cè)器，設(shè)計(jì)能夠在96或384孔微孔滴定板中進(jìn)行基于細(xì)胞的篩選。

1.校正化合物的鑒定

為了確定能夠校正與δf508-cftr相關(guān)的輸送缺陷的小分子，進(jìn)行單個(gè)加入hts測(cè)定格式。在37℃，在存在試驗(yàn)化合物或不存在試驗(yàn)化合物(陰性對(duì)照)的條件下，將細(xì)胞在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)。作為陽(yáng)性對(duì)照，在27℃，將涂覆在384孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)，達(dá)到“溫度校正(temperature-correct)”δf508-cftr。隨后，用krebsringers溶液沖洗該細(xì)胞三次，并加入壓敏染料。為了活化δf508-cftr，向每個(gè)孔中加入10μm毛喉素和cftr增效劑、染料木素(20μm)以及不含cl^-的培養(yǎng)基（cl^--freemedium）。在對(duì)δf508-cftr活化的響應(yīng)的過(guò)程中，加入不含cl^-的培養(yǎng)基（cl^--freemedium）可以促進(jìn)cl-流出（efflux），并使用基于fret的電壓敏感染料來(lái)光學(xué)檢測(cè)所導(dǎo)致的膜去極化。

2.增效化合物的鑒定

為了確定δdf508-cftr的增效劑，進(jìn)行雙加入hts試驗(yàn)?zāi)Ｊ健Ｔ诘谝淮渭尤肫陂g，將不含cl^-的培養(yǎng)基(有或沒有試驗(yàn)化合物)加入到每個(gè)孔中。22秒之后，第二次加入不含cl^-的培養(yǎng)基(包含2-10μm毛喉素)，使δf508-cftr活化。兩次加入之后，胞外cl^-濃度是28mm，在對(duì)δf508-cftr活化的響應(yīng)的過(guò)程中，其可以促進(jìn)cl^-流出（efflux），并使用基于fret的電壓敏感染料來(lái)光學(xué)檢測(cè)所導(dǎo)致的膜去極化。

3.溶液

槽液（bathsolution）#1：(mm)nacl160，kcl4.5，cacl22，mgcl21，hepes10，ph7.4(用naoh調(diào)節(jié))。

不含氯的槽液（bathsolution）：槽液（bathsolution）#1中的鹽酸鹽被葡糖酸鹽替代。

cc2-dmpe：在dmso中制備成為10mm儲(chǔ)備溶液，并在-20℃下保存。

disbac2(3)：在dmso中制備成為10mm儲(chǔ)備溶液，并在-20℃下保存。

4.細(xì)胞培養(yǎng)

穩(wěn)定表達(dá)δf508-cftr的nih3t3小鼠纖維母細(xì)胞用于膜電位的光學(xué)測(cè)量。在175cm²培養(yǎng)燒瓶中，在dulbecco's改性的eagle's培養(yǎng)基(補(bǔ)充有2mm谷氨酰胺，10%胎牛血清，1xneaa，β-me，1x青霉素/鏈霉素和25mmhepes)中，將該細(xì)胞在37℃保持在5%co2和90%濕度條件下。對(duì)于所有光學(xué)試驗(yàn)，將細(xì)胞以30,000個(gè)/孔播種在384孔涂有基質(zhì)膠的板中，并在37℃培養(yǎng)2小時(shí)，而后在27℃下培養(yǎng)24小時(shí)，用于增效試驗(yàn)。用于校正試驗(yàn)，將有和沒有化合物的條件下，將細(xì)胞在27℃或37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。

檢驗(yàn)化合物的δf508-cftr調(diào)節(jié)性能的電生理學(xué)試驗(yàn)

1.尤斯灌流室試驗(yàn)

為了進(jìn)一步表征在光學(xué)試驗(yàn)中鑒定的δf508-cftr調(diào)節(jié)劑，在表達(dá)δf508-cftr的極化上皮細(xì)胞上進(jìn)行尤斯灌流室實(shí)驗(yàn)。將生長(zhǎng)在costarsnapwell細(xì)胞培養(yǎng)板(inserts)上的frt^δf508-cftr上皮細(xì)胞裝在尤斯灌流室(physiologicinstruments，inc.，sandiego，ca)中，并使用電壓-夾鉗系統(tǒng)(departmentofbioengineering，universityofiowa，ia和physiologicinstruments，inc.，sandiego，ca)使該單層連續(xù)短路。通過(guò)施加2mv脈沖，測(cè)定跨上皮電阻。在此條件下，frt上皮顯示4kω/cm²或更大的電阻。使該溶液保持在27℃，并鼓入空氣。使用無(wú)細(xì)胞的插件（insert），校正電極偏移電位和流體電阻。在此條件下，電流反映cl^-通過(guò)頂膜中表達(dá)的δf508-cftr的流量。使用mp100a-ce界面和acqknowledge軟件(v3.2.6；biopacsystems，santabarbara，ca)，數(shù)字性獲得isc。

2.校正化合物的鑒定

典型的方案使用基底外側(cè)至頂膜的cl^-濃度梯度。為了建立這種梯度，在基底外側(cè)膜上使用正常ringer溶液，而頂端nacl被等摩爾的葡糖酸鈉(用naoh滴定至ph7.4)替代，得到跨上皮的大的cl^-濃度梯度。用完整的單層進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。為了充分地活化δf508-cftr，加入毛喉素(10μm)和pde抑制劑ibmx(100μm)，而后加入cftr增效劑,染料木素(50μm)。

正如在其它細(xì)胞類型中所觀察到的那樣，在低溫下培養(yǎng)穩(wěn)定地表達(dá)δf508-cftr的frt細(xì)胞，可提高cftr在質(zhì)膜中的功能密度。為了測(cè)定校正化合物的活性，在37℃，用10μm試驗(yàn)化合物培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，隨后洗滌三次，而后記錄。在化合物處理的細(xì)胞中，將camp-和染料木素-介導(dǎo)的isc對(duì)27℃和37℃對(duì)照物歸一化，并表示為百分比活性。相比于37℃對(duì)照物，用校正化合物預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，可顯著地提高camp-和染料木素-介導(dǎo)的isc。

3.增效化合物的鑒定

典型的方案使用基底外側(cè)至頂膜的cl^-濃度梯度。為了建立這種梯度，在基底外側(cè)膜上使用正常ringers溶液，并用制霉菌素(360μg/ml)透化，而頂端nacl被等摩爾的葡糖酸鈉(用naoh滴定至ph7.4)替代，得到跨上皮的大的cl^-濃度梯度。制霉菌素透化之后，將所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30分鐘。將毛喉素(10μm)和所有的試驗(yàn)化合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)物插件的兩面。將推定的δf508-cftr增效劑的效果與已知的增效劑染料木素的效果進(jìn)行比較。

4.溶液

基底外側(cè)溶液(mm)：nacl(135)，cacl2(1.2)，mgcl2(1.2)，k2hpo4(2.4)，khpo4(0.6)，n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)(10)和葡萄糖(10)。用naoh將該溶液滴定至ph7.4。

頂部溶液(mm)：與基底外側(cè)溶液相同，用葡糖酸鈉(135)替代nacl。

5.細(xì)胞培養(yǎng)

表達(dá)δf508-cftr(frt^δf508-cftr)的fisher小鼠上皮(frt)細(xì)胞用于尤斯灌流室實(shí)驗(yàn)，用于推定我們光學(xué)試驗(yàn)所鑒定的δf508-cftr調(diào)節(jié)劑。將細(xì)胞在costarsnapwell細(xì)胞培養(yǎng)插件上培養(yǎng)，在37℃和5%co2條件下，在coon's改性的ham'sf-12培養(yǎng)基(補(bǔ)充有5%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)五天。在用于表征化合物的增效活性之前，將細(xì)胞在27℃下培養(yǎng)16-48小時(shí)，以便校正δf508-cftr。為了測(cè)定校正化合物的活性，在有和沒有化合物的條件下，將細(xì)胞在27℃或37℃培養(yǎng)24小時(shí)。

6.全細(xì)胞記錄

在全細(xì)胞記錄中，使用多孔膜片檢測(cè)溫度和試驗(yàn)化合物校正的、穩(wěn)定地表達(dá)δf508-cftr的nih3t3細(xì)胞中的宏觀δf508-cftr電流(iδf508)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在室溫下，使用axopatch200b膜片鉗增強(qiáng)器(axoninstrumentsinc.，foster，ca)，進(jìn)行iδf508的電壓鉗（voltage-clamp）記錄。在10khz的取樣頻率和低通濾波器(1khz)條件下，獲得所有記錄。當(dāng)充滿胞內(nèi)溶液時(shí)，移液管具有5-6mω的電阻。在這些記錄條件下，在室溫下計(jì)算的cl^-的逆轉(zhuǎn)電位(reversalpotential)(ecl)是-28mv。所有的記錄具有密封電阻>20gω和串聯(lián)電阻<15mω。使用配備有digidata1320a/d界面(與clampex8(axoninstrumentsinc.)結(jié)合)的pc，進(jìn)行脈沖發(fā)生、數(shù)據(jù)收集和分析。液槽包含<250μl的鹽水，并且使用重力驅(qū)動(dòng)的灌注系統(tǒng)，以2ml/min的速度連續(xù)地表面灌流（perifused）。

7.校正化合物的鑒定

為了測(cè)定校正化合物在質(zhì)膜中提高功能性δf508-cftr的密度的活性，我們使用上述多孔膜片記錄技術(shù)，測(cè)定用校正化合物處理24小時(shí)之后的電流密度。為了充分活化δf508-cftr，將10μm毛喉素和20μm染料木素加入到細(xì)胞中。在我們的記錄條件下，在27℃培養(yǎng)24小時(shí)之后的電流密度高于在37℃培養(yǎng)24小時(shí)之后所觀察到的電流密度。對(duì)于質(zhì)膜中δf508-cftr的密度來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果與已知的低溫培養(yǎng)效果一致。為了測(cè)定校正化合物對(duì)cftr電流密度的效果，在37℃，用10μm試驗(yàn)化合物培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，并將電流密度與27℃和37℃對(duì)照物進(jìn)行比較(%活性)。在記錄之前，用胞外記錄培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三次，除去任何殘留的試驗(yàn)化合物。相比于37℃對(duì)照物，用10μm校正化合物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可顯著地提高camp-和染料木素-依賴性電流。

8.增效化合物的鑒定

使用多孔膜片記錄技術(shù)，還研究了δf508-cftr增效劑在穩(wěn)定地表達(dá)δf508-cftr的nih3t3細(xì)胞中提高宏觀δf508-cftrcl^-電流(iδf508)的能力。光學(xué)試驗(yàn)鑒定的增效劑引起iδf508的劑量依賴性提高，與光學(xué)試驗(yàn)中所觀察到的效能和效果類似。在檢驗(yàn)的所有細(xì)胞中，在增效劑運(yùn)用之前和在增效劑運(yùn)用期間，逆轉(zhuǎn)電位(reversalpotential)大約為-30mv，其是計(jì)算的ecl(-28mv)。

9.溶液

胞內(nèi)溶液(mm)：cs-天冬氨酸鹽(90)，cscl(50)，mgcl2(1)，hepes(10)和240μg/ml兩性霉素（amphotericin）-b(用csoh將ph值調(diào)節(jié)至7.35)。

胞外溶液(mm)：n-甲基-d-葡糖胺(nmdg)-cl(150)，mgcl2(2)，cacl2(2)，hepes(10)(用hcl將ph值調(diào)節(jié)至7.35)。

10.細(xì)胞培養(yǎng)

穩(wěn)定地表達(dá)δf508-cftr的nih3t3小鼠纖維母細(xì)胞用于全細(xì)胞記錄。在175cm²培養(yǎng)燒瓶中，在dulbecco's改性的eagle's培養(yǎng)基(補(bǔ)充有2mm谷氨酰胺，10%胎牛血清，1xneaa，β-me，1x青霉素/鏈霉素和25mmhepes)中，將該細(xì)胞在37℃保持在5%co2和90%濕度條件下。對(duì)于全細(xì)胞記錄，將2,500-5,000個(gè)細(xì)胞播種在涂有聚l-賴氨酸的玻璃蓋片上，并在27℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，而后用于檢驗(yàn)增效劑的活性；在有或者沒有校正化合物的條件下，在37℃進(jìn)行培養(yǎng)，用于測(cè)定校正劑的活性。

11.單通道記錄

使用切開的外翻膜片，觀察在nih3t3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的、溫度校正的δf508-cftr的單通道活性和增效化合物的活性。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在室溫下，使用axopatch200b膜片鉗增強(qiáng)器(axoninstrumentsinc.)，進(jìn)行單通道活性的電壓鉗（voltage-clamp）記錄。在10khz的取樣頻率和低通濾波器(400hz)條件下，獲得所有記錄。用corningkovarsealing#7052玻璃(worldprecisioninstruments，inc.，sarasota，fl)加工膜片移液管，當(dāng)充滿胞外溶液時(shí)，具有5-8mω的電阻。切除之后，通過(guò)加入1mmmg-atp和75nm依賴于camp的蛋白激酶，催化亞單位(pka；promegacorp.madison，wi)，使δf508-cftr活化。通道活性穩(wěn)定之后，使用重力驅(qū)動(dòng)的微灌注系統(tǒng)，對(duì)膜片進(jìn)行表面灌流（perifused）。使入流靠近膜片，導(dǎo)致全部溶液在1-2秒之內(nèi)互換。為了在快速表面灌流（perifusion）期間保持δf508-cftr活性，將非特異性的磷酸酶抑制劑f^-(10mmnaf)加入到槽液（bathsolution）中。在這些記錄條件下，在整個(gè)膜片記錄期間(至高達(dá)60min)，通道活性保持恒定。正電荷從胞內(nèi)溶液移動(dòng)至胞外溶液(陰離子在相反方向上移動(dòng))所產(chǎn)生的電流顯示為正電流。移液管電位(vp)保持在80mv。

用包含≤2個(gè)活性通道的膜片分析通道活性。在實(shí)驗(yàn)期間，同時(shí)開放的最大數(shù)目確定活性通道數(shù)目。為了測(cè)定單通道電流振幅，在100hz，“脫線”過(guò)濾δf508-cftr活性的120sec所記錄的數(shù)據(jù)，而后使用bio-patch分析軟件(bio-logiccomp.france)，用于構(gòu)成與多高斯函數(shù)擬合的所有的點(diǎn)振幅直方圖（all-pointamplitudehistograms）。由120sec的通道活性測(cè)定總的顯微電流和開放概率(po)。使用bio-patch軟件，或利用關(guān)系式po=i/i(n)，測(cè)定po，其中i=平均電流，i=單通道電流振幅，n=膜片中活性通道的數(shù)目。

12.溶液

胞外溶液(mm)：nmdg(150)，門冬氨酸(150)，cacl2(5)，mgcl2(2)，hepes(10)(用tris堿將ph值調(diào)節(jié)至7.35)。

胞內(nèi)溶液(mm)：nmdg-cl(150)，mgcl2(2)，egta(5)，tes(10)和tris堿(14)(用hcl將ph值調(diào)節(jié)至7.35)。

13.細(xì)胞培養(yǎng)

穩(wěn)定地表達(dá)δf508-cftr的nih3t3小鼠纖維母細(xì)胞用于離體的膜片鉗記錄。在175cm²培養(yǎng)燒瓶中，在dulbecco's改性的eagle's培養(yǎng)基(補(bǔ)充有2mm谷氨酰胺，10%胎牛血清，1xneaa，β-me，1x青霉素/鏈霉素和25mmhepes)中，將該細(xì)胞在37℃保持在5%co2和90%濕度條件下。對(duì)于單通道記錄，將2,500-5,000個(gè)細(xì)胞播種在涂有聚l-賴氨酸的玻璃蓋片上，并在27℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，而后使用。

使用上述方法，測(cè)定化合物1的活性，即ec50值，并示于表18中。

表18.

。

其它實(shí)施方案

本文以引證的方式結(jié)合本公開中所提到的所有出版物和專利，好象每個(gè)單獨(dú)出版物或?qū)＠唧w和獨(dú)立地以引證的方式結(jié)合到本文中一樣。如果在以引證的方式結(jié)合的任何專利或出版物中的術(shù)語(yǔ)的含義與本公開所使用術(shù)語(yǔ)的含義不一致，則以本公開中術(shù)語(yǔ)的含義為準(zhǔn)。此外，上述討論僅僅公開和描述了本發(fā)明的示范性的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員由這種討論和附圖和權(quán)利要求可以容易地認(rèn)識(shí)到，在不背離下面權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以進(jìn)行各種改變、修飾和變化。