本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種四聯(lián)長效藥物組合物及其在治療疼痛中的應用。

背景技術(shù)：

高烏甲素又名拉巴烏頭堿，是從毛茛科植物高烏頭aconitumsinomontanumnakai根中提取的一種二萜類生物堿。高烏頭又名穿心蓮烏頭，為毛茛科烏頭屬植物，其性溫，味苦辛，具有祛風除濕、理氣止痛、活血消腫等功效，主要用于風濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、胃痛、跌打損傷等。高烏甲素作為高烏頭鎮(zhèn)痛的有效成分，為我國首創(chuàng)的非成癮性鎮(zhèn)痛藥，藥理研究已證明其具有較強的鎮(zhèn)痛、抗炎、局麻及抗心律失常作用，對癌癥疼痛及其他頑固性疼痛效果尤為顯著。臨床上常使用高烏甲素的氫溴酸鹽，用于中度以上疼痛的治療。延胡索乙素是從罌粟科植物延胡索corydalisyanhusuow.t.wangexz.y.suetc.y.wu的干燥塊莖中提取的一種生物堿，其具有多重藥理作用如鎮(zhèn)痛、抗腦缺血、抗心律失常、抗心肌缺血等作用，長期以來一直廣泛應用于臨床實踐中。延胡索酸又名富馬酸、紫堇酸或地衣酸，即反丁烯二酸，是最簡單的不飽和二元羧酸，最早從延胡索中發(fā)現(xiàn)。琥珀酸又名丁二酸，用于調(diào)味劑、酸味劑、緩沖劑，可以用做防腐劑，ph值調(diào)節(jié)劑，助溶劑，也是制備五元雜環(huán)化合物的重要化工原料。

中國專利(申請?zhí)枺?00910119610.2)中公開了一種抗炎鎮(zhèn)痛的高烏甲素與延胡索乙素藥物組合物，并且提供了該藥物組合物的貼片劑及其制備方法。但是上述專利僅提供該藥物組合物的一種劑型，即貼片劑，該藥物組合物存在一定的毒副作用、水溶性差，而且其抗炎鎮(zhèn)痛效果不如美洛昔康。因此，開發(fā)一種毒副作用小、溶解性好、鎮(zhèn)痛效果佳的長效鎮(zhèn)痛藥物組合物成為醫(yī)藥領(lǐng)域急需解決的難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種四聯(lián)長效藥物組合物，該藥物組合物包含治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸作為有效成分。該藥物組合物還可包括適量的藥學上可接受的藥用輔料(例如藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，包括增溶劑、表面活性劑、成膜劑、抗氧劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、潤滑劑等)

上述四聯(lián)長效藥物組合物，按重量份計，優(yōu)選包含高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是固體制劑、液體制劑或半固體制劑，優(yōu)選片劑、膠囊、注射劑、膜制劑、乳膏或噴霧劑，包括緩釋片劑、緩釋膠囊、緩釋注射劑。

本發(fā)明的另一實施方案提供上述藥物組合物作為預防和/或治療疼痛藥物的應用，以及在制備預防和/或治療疼痛藥物中的應用。所述疼痛包括腫瘤疼痛、癌癥患者化療后產(chǎn)生的疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、外傷疼痛、術(shù)后疼痛、炎性疼痛、戒毒或毒癮引起的疼痛及不明原因的頑固性疼痛。

本發(fā)明的另一實施方案提供上述藥物組合物在制備鎮(zhèn)靜、催眠、協(xié)同麻醉、抗心律失常藥物中的應用。

本發(fā)明上述藥物組合物中的高烏甲素包括高烏甲素以及藥學上可接受的高烏甲素鹽；延胡索乙素包括延胡索乙素以及藥學上可接受的延胡索乙素鹽。

本發(fā)明上述藥物組合物的通用制備方法與應用，如下：

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【制劑】采用現(xiàn)有技術(shù)中(例如藥典、教科書、工具書、期刊或?qū)＠?公知的藥用緩釋、成膜、乳化、透皮吸收、賦形和增溶劑等輔料和通用諸如壓片、膠囊填充、制膜和冷凍干燥等技術(shù)與方法，將上述有效成分按照治療和/或預防有效量可分別制備成適于臨床應用的四聯(lián)長效組合物制劑，其制劑可以是固體制劑、液體制劑或半固體制劑，包括但不限于片劑、膠囊、注射劑、膜制劑、乳膏或噴霧劑等制劑，上述制劑可以是緩釋、控釋制劑。

【應用】本發(fā)明藥物組合物在臨床適用于預防、治療、緩解、減輕各種疼痛，包括但不限于腫瘤疼痛、癌癥患者化療后產(chǎn)生的疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、外傷疼痛、術(shù)后疼痛、炎性疼痛、戒毒或毒癮引起的疼痛及不明原因的頑固性疼痛；亦可用于鎮(zhèn)靜、催眠、協(xié)同麻醉、心律失常等的治療。

【制備方法】

藥物制劑制備過程中所涉及的輔料、藥物制劑的檢測方法均依據(jù)《中國藥典》(2015年版四部中國醫(yī)藥出版社出版)相關(guān)制劑指導原則的規(guī)定。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物原料藥延胡索酸、琥珀酸與高烏甲素、延胡索乙素之間形成鹽或其他絡合物或通過其他分子間作用提高了高烏甲素與延胡索乙素在水中的溶解度、同時降低了毒副作用；(2)本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物間存在某種協(xié)同作用使其鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于單一組分、兩種組分或三種組分形成的組合物；(3)本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物不僅具有更好的鎮(zhèn)痛效果，同時具有鎮(zhèn)靜、催眠、協(xié)同麻醉、抗心律失常等作用。

具體實施方式

為了便于對本發(fā)明的進一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細的說明。但是這些實施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實施方式不限于以下內(nèi)容。

實施例1緩釋制劑、注射制劑、膜制劑、噴霧制劑、片劑、膠囊等的制備例

緩釋制劑

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【主要輔料】緩釋材料、粘合劑、潤滑劑、常用載體輔料等。

【概念與原理】緩釋制劑系指在規(guī)定的釋放介質(zhì)中，按要求緩慢地非恒速釋放一物，與相應的普通制劑比較，給藥頻率比普通制劑減少一倍或有所減少，且能顯著增加患者依從性的制劑；以無機材料作為壁材包裹主效藥物成分，經(jīng)溶解、乳化、吸附等一系列反應得到有效藥物成分為芯材，無機鹽為囊材的納米膠囊緩釋原料，并按照設計要求可分別壓片或灌裝成膠囊制劑。

【制備實例】按【有效成分】含量，分別稱取各有效成分，與主要輔料中的行業(yè)規(guī)定允許添加量以下量的增溶劑(如吐溫-80等)混合、加適量水使充分溶解后，依次加入乳化劑和正硅酸乙酯，充分攪拌混合均勻形成混合溶液a，然后將a溶液加入反應裝置(裝有電磁攪拌器、溫度計、冷凝回流裝置和滴液漏斗)，高速(500轉(zhuǎn)/分)攪拌剪切10分鐘，形成透明油狀的初乳.在室溫條件下(25℃)，將明膠溶液逐步滴加進入反應裝置，主效成分在攪拌作用下形成o/w型小液滴，包裹在乳化劑膠束里面，反應2h，待正硅酸乙酯充分水解后滴加氯化鈣溶液，經(jīng)乳化劑膠束表面反應沉淀、包裹、固化后形成有效成分納米膠囊，反應完全后得到有效成分為囊芯、硅酸鈣為囊壁的納米膠囊，通過調(diào)節(jié)加入正硅酸乙酯與氯化鈣的量，制備不同芯壁比的有效成分納米膠囊緩釋制劑，即得。

注射制劑

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【主要輔料】增溶劑、賦形劑、表面活性劑等。

【概念與原理】注射劑系指有效成分或與適宜的輔料制成的供注入體內(nèi)的無菌制劑；注射劑可以依據(jù)實際需要制備成注射液、注射用無菌粉末等。

【制備實例】按【有效成分】含量，分別稱取各有效成分，與主要輔料中的行業(yè)規(guī)定允許添加量以下量的增溶劑、賦形劑、表面活性劑等，混合、加適量水使充分溶解后，濾過，除菌，分裝，冷凍干燥，即得注射用無菌粉末。

膜制劑

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【主要輔料】成膜劑、促滲劑和增溶劑等。

【概念與原理】膜劑系指有效成分與適宜的成膜材料經(jīng)加工制成的膜狀制劑，可供口服或黏膜應用。

【制備實例】按【有效成分】含量，分別稱取各有效成分，與主要輔料中的行業(yè)規(guī)定允許添加量以下量的增溶劑混合、加適量水使充分溶解后，依次加入成膜劑如聚乙烯醇、丙烯酸樹脂類、纖維素等高分子材料中的一種或幾種組合、促滲劑如氮酮、丙二醇等中的一種或幾種組合，混合均勻，成膜，即得。

噴霧制劑

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【主要輔料】溶劑、助溶劑、抗氧劑、抑菌劑、表面活性劑和增溶劑等附加劑。

【概念與原理】噴霧劑系指有效成分或與適宜輔料填充于特制的裝置中，使用時借助手動泵的壓力、高壓氣體、超聲振動或其他方法將內(nèi)容物呈霧狀物釋出，用于肺部吸入或直接噴至腔道。

【制備實例】按【有效成分】含量，分別稱取各有效成分，與主要輔料中的行業(yè)規(guī)定允許添加量以下量的增溶劑混合，分別加入溶劑、助溶劑、抗氧劑、抑菌劑、表面活性劑，混合均勻，灌裝，即得。

亞微乳劑

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【主要輔料】油、乳化劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、水。

【概念與原理】亞微乳(submicroemulsion)是以植物油為基質(zhì)，由油相、乳化劑(磷脂)、水相制成粒徑在100-1000nm范圍的穩(wěn)定的o/w型分散體系。藥物可包封于油相和磷脂界面膜中，外觀呈不透明的渾濁或乳狀。作為一種新型藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，它可選擇性地蓄積于靶部位，使治療藥物在靶區(qū)濃度超出傳統(tǒng)制劑的數(shù)倍至數(shù)百倍，明顯提高療效。同時能夠延長藥物的半衰期，減少藥物在正常組織分布量，減輕不良反應，達到高效低毒的效果。

【制備實例】按【有效成分】含量，分別稱取各有效成分與乳化劑一起加入油中，攪拌使其溶解，作為油相；將穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑加入到水中，攪拌使其溶解，作為水相；將油相加入水相中，高速剪切分散，形成初乳；初乳調(diào)ph至6.0-7.5，高壓勻化，得精乳，即得亞微乳劑。

片劑

【有效成分】治療和/或預防有效量的高烏甲素、延胡索乙素、延胡索酸和琥珀酸；按重量份計，優(yōu)選高烏甲素1-5份、延胡索乙素1-5份、延胡索酸2-7份、琥珀酸2-7份。

【主要輔料】填充劑或稀釋劑，包括淀粉、糖粉、糊精、乳精、可壓性淀粉、微晶纖維素、無機鹽類；黏合劑和潤滑和劑，包括蒸餾水、乙醇、淀粉漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、甲基纖維素和乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素；崩解劑，包括干淀粉、羧甲基淀粉鈉、低取代基羥丙基纖維素；潤滑劑，包括硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、氫化植物油、聚乙二醇類和月桂醇硫酸鎂。

【制備實例】按【有效成分】含量，分別稱取各有效成分與主要輔料中的一種或幾種混勻，按照常規(guī)工藝制成片劑。

實施例2

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸2份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸20g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例3

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸2份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸20g、琥珀酸70g，與適量的常規(guī)藥用輔料(優(yōu)選羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂)，混勻，按照常規(guī)工藝制成片劑。

實施例4

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸7份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸70g、琥珀酸20g，與適量的常規(guī)藥用輔料(優(yōu)選1％吐溫-80、聚乙二醇400)，混勻，加適量水使充分溶解后，濾過，除菌，分裝，冷凍干燥，即得注射用無菌粉末。

實施例5

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸7份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸70g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得膜制劑。

實施例6

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素5份、延胡索酸2份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素50g、延胡索酸20g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得噴霧制劑。

實施例7

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素5份、延胡索酸2份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素50g、延胡索酸20g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得亞微乳劑。

實施例8

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素5份、延胡索酸7份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素50g、延胡索酸70g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例9

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素5份、延胡索酸7份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素50g、延胡索酸70g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得亞微乳劑。

實施例10

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素5份、延胡索酸2份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素50g、延胡索酸20g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得噴霧制劑。

實施例11

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素5份、延胡索酸7份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素50g、延胡索酸70g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得注射液體制劑。

實施例12

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素5份、延胡索酸2份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素50g、延胡索酸20g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得膜制劑。

實施例13

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素5份、延胡索酸7份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素50g、延胡索酸70g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得片劑。

實施例14

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素1份、延胡索酸2份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素10g、延胡索酸20g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得注射液體制劑。

實施例15

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素1份、延胡索酸7份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素10g、延胡索酸70g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得膠囊緩釋制劑。

實施例16

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素1份、延胡索酸2份、琥珀酸7份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素10g、延胡索酸20g、琥珀酸70g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得膜劑。

實施例17

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素1份、延胡索酸7份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素10g、延胡索酸70g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得片劑。

實施例18

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸1份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸10g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例19

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸2份、琥珀酸1份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸20g、琥珀酸10g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例20

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素5份、延胡索酸8份、琥珀酸2份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素50g、延胡索酸80g、琥珀酸20g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得片劑。

實施例21

原料藥：高烏甲素5份、延胡索乙素5份、延胡索酸2份、琥珀酸8份

按上述重量份，取高烏甲素50g，延胡索乙素50g、延胡索酸20g、琥珀酸80g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得片劑。

實施例22

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、延胡索酸1份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、延胡索酸10g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例23

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份、琥珀酸1份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g、琥珀酸10g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例24

原料藥：高烏甲素1份、延胡索酸1份、琥珀酸1份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索酸10g、琥珀酸10g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得納米膠囊緩釋制劑。

實施例25

原料藥：高烏甲素1份、延胡索乙素1份

按上述重量份，取高烏甲素10g，延胡索乙素10g，按照實施例1中記載的制備例方法，可制備得片劑。

實施例26

按照中國專利(申請?zhí)枺?00910119610.2)中實施例3記載的方法(原料藥：高烏甲素1.8kg、延胡索乙素0.5kg，輔料：丙二醇1.8kg，聚硅氧烷壓敏膠4kg)制備高烏甲素和延胡索乙素組合物透皮貼片。

按照本發(fā)明實施例1記載的方法，將上述原料藥：高烏甲素1.8kg、延胡索乙素0.5kg，與適量的常規(guī)藥用輔料(優(yōu)選羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂)，混勻，按照常規(guī)工藝制成片劑。

實施例27本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠的藥理活性實驗

材料與方法

1、動物：昆明小鼠1400只，雄性，6周齡，體重20-24g；由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)合格證號：scxk(軍)字第2012-0007號。

2、試劑和儀器：高烏甲素(含量98.7％，批號201611022)、延胡索乙素(含量99.1％，批號201611011)、延胡索酸(含量98.9％，批號201610012)、琥珀酸(含量99.2％，批號201610021)均購自陜西省寶雞市辰光生物科技有限公司；鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠)，規(guī)格：10mg/ml，批號：20161102；0.6％醋酸溶液(臨用前取冰醋酸1.2ml加蒸餾水至200ml)；吐溫-80(含量98.5％，批號2016051701)購自江蘇省海安石油化工廠；艾司唑侖片(天津太平洋制藥有限公司)，規(guī)格：1mg/片，批號：20160304；戊巴比妥鈉(上海試劑二廠)，用前以生理鹽水配成6mg/ml。

3、方法與結(jié)果

(1)本發(fā)明組合物中有效成分(即原料藥)的小鼠灌胃急性毒性試驗

受試品：實施例2-6原料藥、實施例25原料藥，臨用前用0.5％cmc制成溶液或混懸液供試。

實驗方法：取健康昆明小鼠456只，雌雄各半，依性別體重分為38組，各組小鼠以0.4ml/10g體重灌胃上述受試品,給藥后嚴密觀察各組動物反應，連續(xù)觀察7天小鼠的行為活動、皮毛光澤、飲食、體重和死亡情況，觀察期間死亡小鼠解剖未發(fā)現(xiàn)有主要臟器肉眼觀察到的病理性改變。主要臟器病理切片未見明顯改變。各組動物死亡之情況如表1所示。

表1各組動物的死亡情況

由表1中的實驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明實施例2-6藥物組合物原料藥的小鼠灌胃急性毒性ld50均大于或等于250mg/kg，而實施例25原料藥(高烏甲素：延胡乙素＝1∶1，各10g)的ld50小于150mg/kg，可見，本發(fā)明藥物組合物中原料藥的毒副作用小于高烏甲素與延胡索乙素(1∶1)兩種組分的構(gòu)成的原料藥。原因可能是本發(fā)明藥物組合物中的延胡索酸、琥珀酸與高烏甲素、延胡索乙素之間形成鹽或其他絡合物或通過其他分子間作用降低了高烏甲素與延胡索乙素的毒性。

(2)本發(fā)明組合物中有效成分(即原料藥)及有效成分中單一組分的鎮(zhèn)痛試驗

扭體法：按照現(xiàn)有技術(shù)(例如chenq.thebookoftechnologyonpharmcologyofmateriamedica[m].beijing:people’smedicalpublishinghouse,1996:360)中的方法，372只小鼠隨機分成嗎啡組(劑量50mg/kg，腹腔注射即ip)、實施例2-26組(劑量100mg/kg，灌胃即ig)、高烏甲素組(劑量100mg/kg，灌胃即ig)、延胡索乙素組(劑量100mg/kg，灌胃即ig)、延胡索酸組(劑量100mg/kg，灌胃即ig)、琥珀酸組(劑量100mg/kg，灌胃即ig)、對照組(等體積生理鹽水，ig)，每組12只；小鼠連續(xù)給藥3天，末次給藥后30分鐘各組小鼠ip0.6％醋酸溶液10ml/kg，觀察ip后出現(xiàn)扭體的時間(潛伏期)和15分鐘內(nèi)出現(xiàn)扭體(伸展后肢，腹部收縮內(nèi)凹，臀部抬高)次數(shù)；結(jié)果見表2。

熱板法：小鼠372只，實驗前在55℃的熱板上測定小鼠疼痛反應時間(小鼠放上熱板到開始舔后足時間)，選擇疼痛反應時間在13～30秒的小鼠，按照疼痛反應時間隨機分成31組(具體分組、劑量和給藥方法均同扭體法)。末次給藥后30分鐘將各組小鼠再次放上熱板，觀察小鼠的疼痛反應時間，超過60秒的按60秒計；結(jié)果見表3。

表2本發(fā)明組合物實施例2-26中有效成分(即原料藥)、高烏甲素組、延胡索乙素組、延胡索酸組、琥珀酸組、對照組及嗎啡組對小鼠的鎮(zhèn)痛作用(扭體法)

與對照組比較：^*p<0.05，^**p<0.01；與實施例26和25比較：^δp<0.05，^δδp<0.01；與嗎啡組比較：^δp<0.05，^δδp<0.01。

表3本發(fā)明組合物實施例2-26中有效成分(即原料藥)、高烏甲素組、延胡索乙素組、延胡索酸組、琥珀酸組、對照組及嗎啡組對小鼠的鎮(zhèn)痛作用(熱板法)

與對照組比較：^*p<0.05，^**p<0.01；與實施例26和25比較：^δp<0.05，^δδp<0.01；與嗎啡組比較：^δp<0.05，^δδp<0.01。

表2-3結(jié)果表明，本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物(實施例2-21原料藥)連續(xù)給藥3天，均能顯著減少ip醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)、顯著延長疼痛反應時間(秒)，表明本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物可以用于預防和/或治療疼痛相關(guān)疾病。其中，實施例2-17的有效成分(原料藥)的鎮(zhèn)痛作用最強，實施例18-21次之，實施例22-26的鎮(zhèn)痛作用相對實施例2-21稍弱；本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物的鎮(zhèn)痛作用明顯強于組合物中單一組分(例如高烏甲素組、延胡索乙素組、延胡索酸組、琥珀酸組)、兩種組分或三種組分的組合(實施例22-26)，原因可能是高烏甲素-延胡索乙素-延胡索酸-琥珀酸四聯(lián)組合物之間可能存在某種協(xié)同作用，顯著增強組合物的鎮(zhèn)痛作用。

(3)本發(fā)明組合物不同劑型對小鼠的鎮(zhèn)痛作用

扭體法：按照現(xiàn)有技術(shù)中的方法，48只小鼠隨機分成嗎啡組(劑量為50mg/kg，ip)、組合物片劑組(劑量150mg/kg，ig，以實施例3制備的片劑為例)、組合物注射劑組(劑量50mg/kg，ip，以實施例11制備的注射劑為例)和對照組(灌胃等體積生理鹽水)，連續(xù)給藥3天，末次給藥后30分鐘各組小鼠腹腔注射(ip)0.6％醋酸溶液10ml/kg，觀察ip后出現(xiàn)扭體的時間(潛伏期)和15分鐘內(nèi)出現(xiàn)扭體(伸展后肢，腹部收縮內(nèi)凹，臀部抬高)次數(shù)；結(jié)果見表4。

表4組合物不同劑型對小鼠的鎮(zhèn)痛作用(醋酸扭體法)

與對照組比較：^**p<0.01。

熱板法：小鼠48只，實驗前在55℃的熱板上測定小鼠疼痛反應時間(小鼠放上熱板到開始舔后足時間)，選擇疼痛反應時間在13～30秒的小鼠，按照疼痛反應時間隨機分成4組(具體分組、劑量和給藥方法均同扭體法)。末次給藥后30分鐘將各組小鼠再次放上熱板，觀察小鼠的疼痛反應時間，超過60秒的按60秒計；結(jié)果見表5。

表5組合物不同劑型對小鼠的鎮(zhèn)痛作用(熱板法)

與對照組比較：^**p<0.01。

結(jié)果證實，本發(fā)明組合物不同劑型連續(xù)給藥3天，能顯著減少ip醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)、延長小鼠疼痛反應時間(秒)，說明本發(fā)明組合物的片劑及注射劑均有顯著鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛效果與陽性對照藥嗎啡相當。

(4)本發(fā)明組合物對戊巴比妥鈉麻醉的協(xié)同作用：小鼠70只隨機分成對照組、艾司唑侖片組(劑量2mg/kg，ig)、組合物注射劑組(劑量50mg/kg，ip，以實施例4制備的注射劑為例)和組合物片劑組(劑量150mg/kg，ig，以實施例17制備的片劑為例)，每組15只，余下10只用于戊巴比妥鈉的睡眠時間劑量的預試。各組小鼠連續(xù)ig3天，對照組ig同體積生理鹽水。麻醉實驗前，先進行戊巴比妥鈉麻醉時間預試，選取麻醉時間(翻正反射消失的時間)在30秒左右的戊巴比妥鈉劑量。本實驗條件下經(jīng)預試，ip戊巴比妥鈉的合適劑量為47mg/kg。末次給藥后30分鐘ip4.8mg/ml戊巴比妥鈉生理鹽水溶液10ml/kg，觀察小鼠翻正反射消失1min以上后開始計時(包括1min)，到翻正反射恢復的時間；結(jié)果見表6。結(jié)果表明，本發(fā)明組合物注射劑和片劑給藥3天具有顯著延長戊巴比妥鈉的睡眠時間，說明本發(fā)明組合物具有鎮(zhèn)靜催眠作用。

表6組合物不同劑型對戊巴比妥鈉麻醉的協(xié)同作用

與對照組比較：^**p<0.01。

實施例28本發(fā)明四聯(lián)長效藥物組合物有效成分(原料藥)的溶解度測試

按照現(xiàn)有技術(shù)中的方法(例如“靜態(tài)法與動態(tài)法測定藥物水中溶解度的探討”，袁飛，等，廣東藥學院學報，2010年第26卷第5期第462-465頁中記載的動態(tài)法)測定本發(fā)明實施例2-17、22、23、25原料藥的溶解度，結(jié)果表明，實施例25原料藥(高烏甲素：延胡乙素＝1∶1，各10g)的溶解度(100g水中)小于10mg，實施例22、23原料藥的溶解度(100g水中)小于100mg，實施例2-17原料藥的溶解度大于1g，相對于實施例25原料藥的溶解度，提高100倍以上，原因可能是本發(fā)明藥物組合物中的延胡索酸、琥珀酸與高烏甲素、延胡索乙素之間形成鹽或其他絡合物或通過其他分子間作用提高了高烏甲素與延胡索乙素在水中的溶解度。