本申請(qǐng)是2013年7月25日提交到中華人民共和國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的發(fā)明名稱為“在使用包含蒽環(huán)類化療劑的erbb2靶向免疫脂質(zhì)體的治療中防止心肌毒性的劑量和給藥”、申請(qǐng)?zhí)枮椤?01180066002.5”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2010年12月6日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/420,225號(hào)；于2010年12月7日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/420,688號(hào)；以及于2011年3月4日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/449,602號(hào)的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)。各個(gè)前述申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用的方式全部并入本文。對(duì)聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)中做出的發(fā)明的權(quán)利的聲明不適用參考以光盤提交的“序列表”、表格或計(jì)算機(jī)程序列表附錄不適用
背景技術(shù)：
：數(shù)十年來，蒽環(huán)類是癌癥治療的有效主力。盡管在乳腺癌的蒽環(huán)類方案中觀察到一貫的臨床益處，與這種治療相關(guān)的顯著毒性例如急性和/或慢性心功能障礙限制了更廣泛的治療用途。而脂質(zhì)體阿霉素制劑已成功地在一定程度上減小了心肌毒性，但它們未能表現(xiàn)出明確的效力優(yōu)勢(shì)，并且可能涉及其它毒性，例如掌足紅腫疼痛(手足綜合征)。在致力于改善當(dāng)前可得的蒽環(huán)類的效力時(shí)，已制備出一種新的免疫脂質(zhì)體制劑mm-302，其將阿霉素靶向her2(erbb2)過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。與her2結(jié)合而不阻斷her2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體片段，與聚乙二醇化的脂質(zhì)體阿霉素的外表面結(jié)合。阿霉素(dox)是用于治療多種癌癥的蒽環(huán)類化療劑。阿霉素使用的劑量受到藥物的心肌毒性的限制。為解決該問題，將阿霉素制備為聚乙二醇化的脂質(zhì)體制劑。藥物的脂質(zhì)體包囊可以遞送強(qiáng)效的細(xì)胞毒性藥物并使其具有改善的治療指數(shù)或治療窗。鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑是阿霉素的聚乙二醇化脂質(zhì)體包囊(脂質(zhì)體)形式。doxil是聚乙二醇化的脂質(zhì)體阿霉素(pld)的商用形式。doxil改變阿霉素的組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)特性。在未使用過蒽環(huán)類并在之前有過治療的患者中，當(dāng)doxil單獨(dú)使用或與曲妥珠單抗組合使用時(shí)，與使用游離阿霉素的療法相比，會(huì)引起顯著更低比率的左心室心功能障礙和癥狀性充血性心力衰竭。被批準(zhǔn)用于治療卡波氏肉瘤、卵巢癌和多發(fā)性骨髓瘤。鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑也以出售。免疫脂質(zhì)體是抗體(通常為抗體片段)靶向的脂質(zhì)體，其提供優(yōu)于非免疫脂質(zhì)體制劑的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楹奢d有被抗體靶向的細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞會(huì)選擇性地使它們內(nèi)化。這種抗體和免疫脂質(zhì)體在例如以下的美國專利和專利申請(qǐng)中有過記載：us2010-0068255、6,214,388、7,135,177和7,507,407(“immunoliposomesthatoptimizeinternalizationintotargetcells”)；6,210,707(“methodsofformingprotein-linkedlipidicmicroparticlesandcompositionsthereof”)；7,022,336(“methodsforattachingproteintolipidicmicroparticleswithhighefficiency”)以及us2008-0108135和7,244,826(“internalizingerbb2antibodies.”)。以下美國和國際專利以及專利申請(qǐng)描述了與本公開相關(guān)的檢定、細(xì)胞系和相關(guān)技術(shù)：us7,846,440(“antibodiesagainsterbb3andusesthereof”)和us12/757,801、pct/us2009/040259、以及pct/us2009/60721(“humanserumalbuminlinkersandconjugatesthereof”)?？梢愿鶕?jù)前述專利公開來制備靶向erbb2(her2)的免疫脂質(zhì)體。這種her2靶向免疫脂質(zhì)體包括mm-302，其包含f5抗her2抗體片段且含有阿霉素。相對(duì)于每一脂質(zhì)體，mm-302含有45個(gè)拷貝的哺乳動(dòng)物來源的f5-scfv(抗her2)。選擇f5-scfv，是因?yàn)槠渚哂袃?nèi)化相關(guān)的能力而不影響her2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。f5-scfv的特性表明，其不與小鼠、大鼠和兔的her2交叉反應(yīng)，并且處于游離scfv形式時(shí)不干擾her2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因?yàn)橐阎募〖?xì)胞表達(dá)her2，對(duì)于mm-302和相關(guān)的her2靶向免疫脂質(zhì)體的潛在心肌毒性表達(dá)出擔(dān)憂。市售的脂質(zhì)體阿霉素的劑量和給藥：(鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑)是示例性的脂質(zhì)體蒽環(huán)類化療藥物。doxil通常以mg/m2表示的且表征為鹽酸阿霉素當(dāng)量(阿霉素當(dāng)量(doxequiv.)，意指各劑量中的阿霉素的總質(zhì)量)的劑量靜脈給藥。各次給藥通常以周為單位的間隔進(jìn)行施用，以達(dá)到每y周xmg/m2(阿霉素當(dāng)量)的劑量。通常以1mg/min的初始速度進(jìn)行第一次脂質(zhì)體阿霉素給藥，以使輸注相關(guān)的反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。如果沒有觀察到輸注相關(guān)的不利反應(yīng)，通常提高輸注速度，以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成給藥?；加新殉舶┑幕颊撸和ǔＲ?0mg/m2阿霉素當(dāng)量的劑量向卵巢癌患者靜脈施用doxil。通常每4周向患者給藥一次，只要患者病情不再進(jìn)展、不顯示心肌毒性的證據(jù)并繼續(xù)耐受治療。建議最少4個(gè)療程，因?yàn)榕R床實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)的中值時(shí)間為4個(gè)月。為管理不利反應(yīng)，例如手足綜合征(hfs)、口腔炎、或血液毒性，可以延遲或減少給藥。應(yīng)該考慮止吐藥的預(yù)處理或伴隨使用?；加衋ids相關(guān)卡波氏肉瘤(ks)的患者：通常以20mg/m2(阿霉素當(dāng)量)的劑量向ks患者靜脈施用doxil。在ks患者中，通常每三周重復(fù)一次給藥，只要患者的反應(yīng)令人滿意并耐受治療?；加卸喟l(fā)性骨髓瘤的患者：為治療患有多發(fā)性骨髓瘤的患者，doxil與(硼替佐米)一起施用。每三周，在第1、4、8和11天，以1.3mg/m2的劑量經(jīng)靜脈團(tuán)注來施用硼替佐米。在各個(gè)第4天的硼替佐米給藥之后，通常以30mg/m2的劑量，經(jīng)1h靜脈輸注，向這些患者施用doxil。通常對(duì)患者治療高達(dá)8個(gè)周期，直到疾病出現(xiàn)進(jìn)展或出現(xiàn)不能接受的毒性。(曲妥珠單抗)是非常廣泛地用于治療her2過表達(dá)腫瘤的治療性抗her2抗體。曲妥珠單抗的關(guān)鍵的劑量限制作用是心肌毒性。已知心肌細(xì)胞表達(dá)her2，且通常認(rèn)為曲妥珠單抗介導(dǎo)的心肌毒性是由對(duì)表達(dá)her2的心肌細(xì)胞的損傷引起的，該損傷源自曲妥珠單抗與心肌細(xì)胞所表達(dá)her2的結(jié)合，參見例如hysingjandwiste,“cardiotoxiceffectsoftrastuzumab,”,tidsskrnorlaegeforen,2011nov15；131(22):2239-2241。已知蒽環(huán)類藥物例如阿霉素發(fā)揮劑量限制性的心肌毒性作用，這被視為對(duì)其使用的主要限制，參見例如sawyer等人,“mechanismsofanthracyclinecardiacinjury:canweidentifystrategiesforcardio-protection？”progcardiovascdis.,2010sep-oct；53(2):105-13。阿霉素引發(fā)的心臟損傷是不可逆的，導(dǎo)致急性損傷以及在治療數(shù)年后仍顯露出的損傷。暴露至高于550mg/m2的阿霉素累積濃度會(huì)增加心肌病和心力衰竭的可能性。用于治療her2陽性乳腺癌的針對(duì)her2的治療的發(fā)展已引發(fā)對(duì)阿霉素與曲妥珠單抗組合的臨床益處的調(diào)查。阿霉素加曲妥珠單抗的臨床效力優(yōu)于紫杉醇加曲妥珠單抗的效力；然而，在所研究的阿霉素加上曲妥珠單抗的臂中觀察到心肌毒性的增加的影響范圍，該組合沒有被批準(zhǔn)上市?；谳飙h(huán)類的療法的臨床益處，特別在her2陽性乳腺癌中，還存在爭議。藥物的脂質(zhì)體包囊可以對(duì)強(qiáng)效的細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行遞送，并使其具有改善的治療指數(shù)。聚乙二醇化的脂質(zhì)體阿霉素(pld)改變阿霉素的組織分布和藥物動(dòng)力學(xué)特性。在未使用過蒽環(huán)類并在之前有過治療的患者中，與使用常規(guī)阿霉素的治療相比，pld單獨(dú)給藥或與曲妥珠單抗組合給藥已顯示出顯著更低比率的左心室心功能障礙和癥狀性充血性心力衰竭。提出的關(guān)于pld的降低的心肌毒性的機(jī)制是，其相比于常規(guī)阿霉素的更大尺寸防止其穿越心臟中的內(nèi)皮屏障，從而使阿霉素對(duì)心臟組織的暴露降至最低。mm-302是靶向her2的聚乙二醇化脂質(zhì)體，其設(shè)計(jì)成將阿霉素直接遞送到her2過表達(dá)癌癥。her2靶向的pld經(jīng)由與pld相似的增強(qiáng)透過和滯留的效應(yīng)而沉積在腫瘤中。在腫瘤微環(huán)境中，使用her2靶向pld來靶向her2過表達(dá)細(xì)胞在臨床前模型中引起相對(duì)于pld更優(yōu)的效力。在mm-302的開發(fā)過程中，管理機(jī)構(gòu)表達(dá)出憂慮，即因其對(duì)her2的靶向，mm-302可能將有心肌毒性的阿霉素直接遞送到心肌細(xì)胞，與鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑相比，引起增加的心肌毒性，并且建議減小mm-302的劑量以避免這樣的威脅生命的毒性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供用于確定安全劑量和安全地使用抗her2免疫脂質(zhì)體蒽環(huán)類來治療her2表達(dá)癌癥的方法，例如，與鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑(doxil)相比，沒有增加的心肌毒性風(fēng)險(xiǎn)，并且本發(fā)明還提供其它優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，包含erbb2靶向抗體和蒽環(huán)類的免疫脂質(zhì)體，例如mm-302，不再比鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑具有更大的心肌毒性，并且可以使用與鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑完全相同的劑量(即劑量和給藥量和日程安排)進(jìn)行給藥，而不會(huì)增加心肌毒性風(fēng)險(xiǎn)或降低其效力。而且，現(xiàn)在已證實(shí)，mm-302可以在體外和體內(nèi)有效地靶向每一細(xì)胞表達(dá)200,000或更多個(gè)erbb2(her2)受體的細(xì)胞，表明其可以用于治療患有her2過表達(dá)腫瘤的患者，不管是her2“3+”(例如通過)、her2fish+(用于her2基因放大的熒光原位雜交)或her2“2+”(例如通過herceptest)。因此，本文公開的是用于確定安全且有效的劑量的方法，以通過施用包含蒽環(huán)類的抗her2免疫脂質(zhì)體用于治療人癌癥患者，其中患者診斷為由her2受體的表達(dá)所表征的癌癥，方法包括：針對(duì)診斷為由her2受體的表達(dá)所表征的癌癥的患者確定第一劑量，這樣的劑量表示劑量大小和給藥頻率，第一劑量用于不包含免疫脂質(zhì)體的脂質(zhì)體蒽環(huán)類化療劑，確定該劑量以向患者提供安全且有效的脂質(zhì)體蒽環(huán)類化療劑的量；以及確定用于施用包含蒽環(huán)類的抗her2免疫脂質(zhì)體的劑量，多個(gè)該免疫脂質(zhì)體各自在其表面上荷載多個(gè)抗her2的抗體分子并且各個(gè)含有蒽環(huán)類化療劑，其中用于施用包含蒽環(huán)類的抗her2免疫脂質(zhì)體的安全且有效的劑量是第一劑量。還公開了通過施用包含蒽環(huán)類的抗her2免疫脂質(zhì)體來治療人癌癥患者的方法，該方法包括：針對(duì)診斷為由her2受體的表達(dá)所表征的癌癥的患者確定第一劑量，這樣的劑量表明劑量大小和給藥頻率，第一劑量用于不包含免疫脂質(zhì)體的脂質(zhì)體蒽環(huán)類化療劑，確定該劑量以向患者提供安全且有效的脂質(zhì)體制劑的量；以及施用包含蒽環(huán)類的抗her2免疫脂質(zhì)體，多個(gè)該免疫脂質(zhì)體各自在其表面上荷載多個(gè)抗her2的抗體分子并且各個(gè)含有蒽環(huán)類化療劑，其中以第一劑量向患者施用包含蒽環(huán)類的抗her2免疫脂質(zhì)體。在某些方面，蒽環(huán)類是阿霉素。在其它方面，不包含免疫脂質(zhì)體的脂質(zhì)體蒽環(huán)類化療劑是鹽酸阿霉素脂質(zhì)體注射劑并且her2靶向免疫脂質(zhì)體是mm-302。在其它方面，癌癥是乳腺癌、卡波氏肉瘤、卵巢癌或多發(fā)性骨髓瘤。在其它方面，第一劑量是每兩周或每三周或每四周50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2、20mg/m2或10mg/m2。在其它方面，由her2受體的表達(dá)所表征的癌癥的特征還在于其為her22+、her23+或her2fish陽性。在其它方面，由erbb2受體的表達(dá)所表征的癌癥的特征還在于每一細(xì)胞表達(dá)平均至少200,000個(gè)細(xì)胞表面erbb2受體。在其它方面，以第一劑量施用免疫脂質(zhì)體可有效治療癌癥，并且在其它方面，與以第一劑量施用不包含免疫脂質(zhì)體的脂質(zhì)體蒽環(huán)類化療劑相比，以第一劑量施用免疫脂質(zhì)體不引起心肌毒性的增加。在其它方面，以第一劑量向患者施用免疫脂質(zhì)體在患者血流中引起免疫脂質(zhì)體的峰濃度，并且，與在沒有免疫脂質(zhì)體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照組人心肌細(xì)胞相比，通過在以約峰濃度包含免疫脂質(zhì)體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以在體外處理人心肌細(xì)胞并不降低所培養(yǎng)心肌細(xì)胞中調(diào)蛋白(heregulin)激發(fā)的perk或pakt的增加，或降低不多于5％。在其它方面，患者血流中免疫脂質(zhì)體的濃度被測(cè)量為血清免疫脂質(zhì)體濃度。在其它方面，各個(gè)her2免疫脂質(zhì)體在其表面荷載平均45個(gè)抗her2抗體分子。附圖說明圖1.her2水平對(duì)攝入的影響：使用15μg/ml的mm-302(a)和非靶性的聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素(ut-pld)(b)對(duì)表達(dá)各種水平的her2的多個(gè)細(xì)胞系處理2h，并且通過hplc對(duì)總的細(xì)胞內(nèi)阿霉素進(jìn)行定量。y軸表示相對(duì)于每一細(xì)胞的毫微微克阿霉素(左)和相對(duì)于每一細(xì)胞的脂質(zhì)體(右)，x軸表示每一細(xì)胞的her2受體數(shù)量(對(duì)數(shù)級(jí))。使小鼠腫瘤4t1細(xì)胞(c)和內(nèi)源性低her2表達(dá)的hela細(xì)胞(d)轉(zhuǎn)染有人her2，以產(chǎn)生具有不同表達(dá)水平的穩(wěn)定克隆。使用含有熒光標(biāo)記物的f5靶向脂質(zhì)體(dii5-f5-pl)處理各個(gè)克隆(由三角形、圓形或正方形表示)，并且通過facs確定總結(jié)合/攝入。圖2.(a)使用15μg/ml的mm-302(圓形)、pld(正方形)和游離阿霉素(三角形)對(duì)her2過表達(dá)的bt474-m3細(xì)胞處理指定時(shí)間(x軸，min)。通過hplc對(duì)總的細(xì)胞內(nèi)阿霉素進(jìn)行定量(y軸，毫微微克/細(xì)胞)。(b)在指定的孵育時(shí)間(x軸，min)之后24h，通過高含量顯微術(shù)(highcontentmicroscopy)對(duì)細(xì)胞核阿霉素遞送進(jìn)行定量(y軸，高于背景的每一細(xì)胞的信號(hào))。(c)在bt474-m3原位乳腺癌模型中比較mm-302和pld的抗腫瘤活性。與對(duì)照組(圓形)相比，mm-302(正方形)和pld(三角形)均顯著抑制腫瘤生長(第55天t檢驗(yàn)；p<0.0001)。相對(duì)于pld，mm-302引起更強(qiáng)的腫瘤生長抑制(第55天t檢驗(yàn)；p＝0.0310)。y軸表示以mm3計(jì)的腫瘤體積，且x軸表示接種后的天數(shù)。圖2d示出以q7d以及3mg/kg或6mg/kg(阿霉素當(dāng)量)施用的bt474-m3異種移植物中的mm-302和ut-pld的藥代動(dòng)力學(xué)。y軸是血漿中的μg/ml阿霉素，且x軸是以小時(shí)計(jì)的時(shí)間。圖3.體內(nèi)her2水平的作用：使用dil5標(biāo)記的mm-302(dil5-f5-pld)或ut-pld(dil5-ut-pl)注射在乳房脂肪墊中荷載bt474-m3異種移植腫瘤的小鼠。制備腫瘤單細(xì)胞懸液并用fitc-her2抗體進(jìn)行染色。通過facs確定dil5-陽性-her2-陽性細(xì)胞。(a)示出her2水平(每一細(xì)胞的受體，x軸)作為與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的脂質(zhì)體(細(xì)胞陽性百分比，y軸)的函數(shù)的圖。(b)表明在腫瘤組織切片中測(cè)量的基于單細(xì)胞的her2表達(dá)異質(zhì)性的圖。圖4.在人心肌細(xì)胞中測(cè)量mm-302(圓形)、pld(正方形)和阿霉素(三角形)的攝入。使用15μg/ml的mm-302、pld和游離阿霉素對(duì)胚胎干細(xì)胞來源(escd)(a)和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ipsd)來源(b)的心肌細(xì)胞處理指定時(shí)間。通過hplc對(duì)總的細(xì)胞內(nèi)阿霉素進(jìn)行定量。y軸表示以毫微微克/細(xì)胞計(jì)的攝入，且x軸表示以min計(jì)的孵育時(shí)間。(c)細(xì)胞成活力：使用指定濃度的藥物對(duì)escd心肌細(xì)胞處理3h并使用新鮮培養(yǎng)基再孵育24h，評(píng)估細(xì)胞成活力。y軸表示相比于對(duì)照組的以％計(jì)的細(xì)胞成活力，且x軸表示以μg/ml計(jì)的濃度。(d)細(xì)胞成活力：使用指定濃度的游離阿霉素(圓形)、pld(正方形)或mm-302(三角形)對(duì)ipsd心肌細(xì)胞處理24小時(shí)。收集上清液，并且在剩余細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞成活力檢定。所有數(shù)值相對(duì)于未經(jīng)處理的群體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。(e)在(d)收集的上清液中進(jìn)行人肌鈣蛋白i的elisa。未處理線(虛線)表示未處理的孔中可檢測(cè)到的可溶肌鈣蛋白i的值。所有值針對(duì)所提供標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖5.使用mm-302(圓形)、pld(正方形)和游離阿霉素(三角形)以指定濃度對(duì)escd心肌細(xì)胞處理3h，然后使用新鮮培養(yǎng)基再孵育24h。對(duì)細(xì)胞染色并用高含量顯微術(shù)成像。對(duì)各個(gè)染色的單細(xì)胞強(qiáng)度進(jìn)行定量并將其表示為每一細(xì)胞的平均相對(duì)強(qiáng)度。對(duì)細(xì)胞的dna損傷標(biāo)記物γ-h2ax進(jìn)行染色(a)。此外，對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)激蛋白磷酸化p53(b)和磷酸化hsp27(c)以及凋亡蛋白parp的切割形式(cparp)進(jìn)行染色(d)。y軸表示相對(duì)強(qiáng)度且x軸表示以μg/ml計(jì)的濃度。圖6.(a)單獨(dú)的f5scfv、或與空(即沒有包囊的阿霉素)脂質(zhì)體結(jié)合的f5scfv(“f5lipo”-脂質(zhì)體，相當(dāng)于mm-302但不含阿霉素)在ips來源的人心肌細(xì)胞中以最小程度降低基礎(chǔ)perk水平，并且并不降低調(diào)蛋白刺激的perk水平，而(曲妥珠單抗)將基礎(chǔ)水平降低到更大程度，且曲妥珠單抗和拉帕替尼均以比f5scfv或f5lipo更大的程度降低調(diào)蛋白激發(fā)水平。(b)沒有測(cè)試劑在這些細(xì)胞中改變基礎(chǔ)pakt水平，并且曲妥珠單抗和拉帕替尼均以比f5scfv或f5lipo顯著更大的程度降低調(diào)蛋白激發(fā)水平。圖7.(a)研究mm-302(正方形)、pld(三角形)和游離阿霉素(圓形)的生物學(xué)分布。對(duì)荷載nci-n87腫瘤的小鼠(n＝4/時(shí)間點(diǎn)/組)給予阿霉素、mm-302或pld的單次給藥(3mg/kg)。在注射后0.5、4和24h處死小鼠，并通過hplc對(duì)心臟組織(a)、腫瘤組織(b)和爪(c)中的阿霉素積聚進(jìn)行定量。(d)相比于游離阿霉素，mm-302在心臟組織中引起更低的細(xì)胞核阿霉素積聚，并且與pld相當(dāng)。使用3mg/kg(阿霉素當(dāng)量)的mm-302-dii5、pld-dii5和游離阿霉素靜脈注射nu/nu裸小鼠。在設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)，收集心臟以制備冰凍切片，從而分析脂質(zhì)體和阿霉素的微觀分布。注射fitc-凝集素以使功能化的/灌注的血管可視化。使用煙酸己可堿(hoechst)復(fù)染心臟切片并通過共聚焦熒光顯微術(shù)對(duì)其成像(40x放大倍率)。示出阿霉素陽性細(xì)胞核。阿霉素陽性細(xì)胞核在0.5h和4h的游離阿霉素處理的樣品中可見，但在mm-302處理的樣品中不可見(參見“合并圖”)。(e)示出阿霉素和mm-302的在0.5h時(shí)間點(diǎn)的上述視野的細(xì)胞核與阿霉素信號(hào)重疊的更高放大倍率(2x)。(f)使用developerxdtm對(duì)阿霉素陽性細(xì)胞核的百分比進(jìn)行定量(f)。圖8：建模：建立計(jì)算模型并根據(jù)關(guān)于游離和脂質(zhì)體阿霉素的文獻(xiàn)和內(nèi)部數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)。將其用于理解競爭動(dòng)力學(xué)過程，該過程確定各種組織中脂質(zhì)體vs.游離阿霉素的藥物濃度和暴露。(a)pk和生物學(xué)分布：與游離阿霉素相比，脂質(zhì)體遞送引起長得多的循環(huán)時(shí)間。(b)組織沉積：該模型能夠捕獲小鼠中典型的脂質(zhì)體沉積數(shù)據(jù)。(c)微觀分布：動(dòng)力學(xué)建模能夠?yàn)槔斫鈎er2表達(dá)在mm-302攝入和阿霉素細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中的作用提供框架。具體實(shí)施方式mm-302脂質(zhì)體是直徑為約75～110nm的單層的脂質(zhì)雙層囊泡，其包囊含有膠凝或沉淀狀態(tài)的阿霉素的水性空間。脂膜由卵磷脂、膽固醇、和聚乙二醇衍生化的磷脂酰乙醇胺組成，含量為對(duì)于200個(gè)磷脂分子為約1個(gè)peg分子，其中對(duì)于每1780個(gè)磷脂分子，約一個(gè)peg鏈在其端部承載與her2結(jié)合的f5單鏈fv抗體片段。由hspc(氫化的大豆卵磷脂):膽固醇(植物來源):peg-dspe(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)以3:2:0.3的摩爾比制備mm-302脂質(zhì)體。mm-302的總hspc脂濃度為約40mmol/l。mm-302含有約10mmol/l的脂質(zhì)和約2mg/ml的阿霉素。mm-302在含有0.16～0.30mg/mldspe-peg-f5的脂質(zhì)體中包含1.8～2.2mg/ml的阿霉素(如us6,210,707中記載般進(jìn)行制備)。f5是抗erbb2(her2)scfv抗體片段(由atcc質(zhì)粒存放指定號(hào)pta-7843所編碼)。mm-302脂質(zhì)體包含130～170g阿霉素/mol磷脂和12～22gf5-peg-dspe/mol磷脂。在作為緩沖液(ph6.5)的無菌10mm/l組氨酸-hcl和保持等滲性的10％蔗糖和中制備mm-302。使用預(yù)載入的硫酸銨對(duì)mm-302脂質(zhì)體進(jìn)行載藥。mm-302劑量劑量1劑量2劑量3劑量4劑量5每周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每兩周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每三周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每四周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2每五周10mg/m220mg/m230mg/m240mg/m250mg/m2“mg/m2”是指，患者每平方米體表面積的阿霉素(配制為mm-302)mg。對(duì)于乳腺癌，優(yōu)選劑量3、4、或5。對(duì)于卡波氏肉瘤的給藥，優(yōu)選劑量1、2、或3，對(duì)于卵巢癌，優(yōu)選劑量3、4、或5，且對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤，優(yōu)選劑量2、3、4、或5。相比于“晚期”(轉(zhuǎn)移瘤)，給藥方案在“早期”(轉(zhuǎn)移前，例如輔助(adjuvant)乳腺癌)的實(shí)體瘤患者中可以變動(dòng)。優(yōu)選的腫瘤是腫瘤細(xì)胞過表達(dá)her2的腫瘤。過表達(dá)her2的腫瘤是經(jīng)herceptesttm識(shí)別為her2“3+”或her2“2+”或經(jīng)熒光原位雜交識(shí)別為her2fish+的腫瘤?；蛘?，過表達(dá)her2的優(yōu)選腫瘤是由實(shí)施例中記載的方法所定量的每一細(xì)胞表達(dá)平均200,000或更多個(gè)受體的腫瘤。晚期乳腺癌的mm-302療法每4周通過靜脈(iv)輸注在60分鐘以8、16、30、40或50mg/m2向患者施用一次mm-302，該患者患有由fish或由ihc或通過每一細(xì)胞的her2受體的平均數(shù)量的確定而確定的過表達(dá)her2的局部晚期/不可切除或轉(zhuǎn)移晚期乳腺癌。患者應(yīng)該具有由以下所證實(shí)的足夠的骨髓儲(chǔ)量：1)絕對(duì)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(anc)≥1,500/μl；2)血小板計(jì)數(shù)≥100,000/μl；以及3)血紅蛋白≥9g/dl(允許輸血)?；颊邞?yīng)該具有由以下所證實(shí)的充足的肝功能：l)血清總膽紅素≤1.5xuln；以及2)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)和堿性磷酸酶(alp)正?；蚋哌_(dá)2.5×的正常上限(uln；如果存在肝轉(zhuǎn)移和/或骨轉(zhuǎn)移，對(duì)于alp，5×uln是可接受的)?；颊邞?yīng)該具有充足的腎功能，由血清肌酸肝≤1.5×uln所證實(shí)?；颊邞?yīng)該從任何之前的手術(shù)、放射療法或意在治療乳腺癌的其它療法的任何臨床相關(guān)毒性作用中恢復(fù)。須警告具有妊娠可能性的婦女以及有生育能力的男人及其伴侶在治療過程中以及在mm-302的最后給藥之后的90天避免性交或者使用有效的避孕形式。患者應(yīng)該具有足夠的心臟功能，如在治療的約30天內(nèi)由echo或muga測(cè)量的左心室射血分?jǐn)?shù)≥50％所證實(shí)的。對(duì)懷孕或哺乳的以及具有nyhaiii或iv級(jí)充血性心力衰竭或左心室射血分?jǐn)?shù)(lvef)<50％或具有延長的qtc間隔(≥460ms)的患者，優(yōu)選不使用mm-302進(jìn)行治療。以下實(shí)施例僅是示例說明性的，不應(yīng)該理解為以任何方式限制本公開的范圍，因?yàn)樵陂喿x本公開時(shí)，很多變化和等效物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。實(shí)施例用在這些實(shí)施例中的材料和方法：材料：阿霉素來自sigma-aldrich,inc.(st.louis,mo)。fitc結(jié)合的凝集素(番茄(lycopersiconesculentum)凝集素，cat#fl-1171)購自vectorlaboratories,inc.(burlingame,ca)。乙酸、甲酸和乙腈來自emdchemicalsinc.(gibbstown,nj)。水和三氟乙酸(tfa)來自j.t.baker(phillipsburg,nj)。煙酸己可堿33342三鹽酸三水合(hoechst33342trihydrochloridetrihydrate)、prolong和diic18(5)-ds(dii5)來自invitrogen(carlsbad,ca)。膽固醇和1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷脂?；掖及?n-[氨基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)(peg-dspe)來自avantipolarlipidsinc。氫化大豆卵磷脂(hspc)來自lipoid(newark,nj)。rpmi來自lonza(walkersville,md)，胎牛血清(fbs)來自tissueculturebiologicals且青霉素g/硫酸鏈霉素混合物來自gibco(invitrogen)。免疫脂質(zhì)體的制備：如之前記載的，制備脂質(zhì)體，并使用硫酸銨梯度來裝載阿霉素(kirpotin等人,cancerres.2006；66:6732-40；park等人,clincancerres.2002；8:1172-81)。脂質(zhì)組分是hspc、膽固醇和peg-dspe(3:2:0.3，mol:mol:mol)。制備抗erbb2(f5)-peg-dspe結(jié)合物并將其插入到脂質(zhì)體中，以形成由nellis等人報(bào)道的免疫脂質(zhì)體(biotechnolprog.2005；21:205-20；biotechnolprog.2005；21:221-32)。如上所述制備dii5標(biāo)記的脂質(zhì)體mm-302-dii5和pld-dii5，與上述不同之處在于，在濃度為總磷脂的0.3mol％時(shí)，diic18(5)-ds(dii5)染料與脂質(zhì)組分互溶。在所有情況下，使用以hepes緩沖鹽水(ph6.5)洗脫的g-75尺寸排阻柱，去除未裝載的游離阿霉素。以同上述相似的方式制備f5-lipo-dii5，不加阿霉素，并引入hepes緩沖鹽水的水溶液(ph6.5)。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)：bt474-m3細(xì)胞(參見noble,cancerchemother.pharmacol.200964:741-51)是her2過表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞。bt474-m3細(xì)胞在含有10％fbs和1％青霉素g/硫酸鏈霉素的rpmi培養(yǎng)基中生長。胚胎干細(xì)胞來源(escd)的心肌細(xì)胞得自p.w.zandstra,instituteofbiomaterialsandbiomedicalengineering,universityoftoronto,toronto,ontario,canada(bauwens等人,tissueengparta.2011apr25,pmid21417693；)。這些細(xì)胞已顯示出能夠表達(dá)心肌細(xì)胞的適當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記物，例如lim結(jié)構(gòu)域同源框基因isl-1、肌鈣蛋白t和肌球蛋白輕鏈2c。在分化之后確定肌鈣蛋白t陽細(xì)胞的百分比。舍棄肌鈣蛋白t陽性小于70％的批次。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來源(ipsd)的細(xì)胞得自美國國際細(xì)胞動(dòng)力學(xué)公司(celldynamicsinternational)并按照制造商的操作指南進(jìn)行處理。異種移植研究：從charlesriverlaboratories或taconicfarms,inc購買5～7周齡的雌裸小鼠(ncr裸小鼠)。除非另外指出，在小鼠的右背側(cè)使用bt474-m3乳腺癌細(xì)胞或nci-n87胃癌細(xì)胞(nci-dtp，100μlrpmi中l(wèi)0×l06個(gè)細(xì)胞)對(duì)小鼠進(jìn)行接種(皮下注射，s.c.)。當(dāng)腫瘤達(dá)到約200mm3的平均體積時(shí)，如下所述進(jìn)行研究。腫瘤her2水平的測(cè)試：在右上側(cè)開始數(shù)的第二乳房脂肪墊中使用15×106的bt474-m3細(xì)胞對(duì)純合ncr裸小鼠進(jìn)行接種。使用單劑量的不含阿霉素的4mg/ml熒光標(biāo)記(使用如下所述的dii5)的her2靶向或非靶性的脂質(zhì)體，注射bt474-m3腫瘤。二十四小時(shí)之后，切除腫瘤并通過機(jī)械和酶解方式使其分離。在使用her2抗體進(jìn)行表面染色之后，在facscaliburtm儀器(bdbiosciences)上通過流氏細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。通過繪制由增加的her2信號(hào)所限定的窄門篩選的細(xì)胞子集中具有升高的脂質(zhì)體含量的細(xì)胞的總百分比，由流氏細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)組分析her2表面表達(dá)水平與給定閾值之上的脂質(zhì)體的攝入之間的關(guān)系。細(xì)胞表面her2的單細(xì)胞分布：使用抗her2抗體對(duì)bt474-m3腫瘤異種移植組織進(jìn)行染色，并使用dapi進(jìn)行復(fù)染。使用以20x放大倍率使片子成像，并分析圖像?；趩渭?xì)胞，將her2膜染色的強(qiáng)度定量為(her2層的內(nèi)圖廓的平均值)+(her2層的外圖廓的平均值)。效力研究：基于小鼠的平均腫瘤體積，將小鼠隨機(jī)分成三個(gè)處理組(n＝7/組)，接受pbs(對(duì)照)、mm-302或pld，以3mg/kg給藥(q7d,n＝3次總給藥)。使用卡尺測(cè)量腫瘤，每周兩次。使用下式計(jì)算腫瘤體積：寬度2×長度×0.52。對(duì)小鼠稱重，每周兩次，以監(jiān)測(cè)重量的減輕。her2表達(dá)細(xì)胞系中脂質(zhì)體的攝入：使用15μg/ml的mm-302或pld對(duì)表達(dá)各種水平her2的多個(gè)細(xì)胞系處理2h，并且通過hplc對(duì)總的細(xì)胞內(nèi)阿霉素進(jìn)行定量。鼠4t1乳腺癌細(xì)胞和人hela子宮頸癌細(xì)胞得自atcc并根據(jù)atcc建議進(jìn)行增殖。通過流氏細(xì)胞術(shù)，使用市售的抗her2抗體(bdbiosciences#340552)來表征細(xì)胞中人her2的表達(dá)。該抗體不與鼠her2交叉反應(yīng)但檢測(cè)人her2。對(duì)人her2進(jìn)行編碼的新霉素可選擇的表達(dá)載體得自genecopeia(z2866)。使用非脂質(zhì)聚合物轉(zhuǎn)染試劑1.0(origene)根據(jù)制造商的說明書，用該構(gòu)造來轉(zhuǎn)染4t1和hela細(xì)胞。使用400～500μg/ml的遺傳霉素/新霉素(invitrogen)來篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使存活的細(xì)胞在降低的遺傳霉素/新霉素濃度(100μg/ml)下擴(kuò)張，并在bdbiosciencesfacsariatm儀上分選，以獲得超過在親代hela細(xì)胞中觀察到的人her2表達(dá)的強(qiáng)化細(xì)胞群。然后使分選-強(qiáng)化的細(xì)胞通過有限的稀釋進(jìn)行亞克隆，并且通過her2表面水平對(duì)克隆進(jìn)行分級(jí)，以獲得表達(dá)不同范圍her2的4t1和hela細(xì)胞的代表群體。根據(jù)制造商的說明書，將通過流氏細(xì)胞術(shù)測(cè)量的her2表面染色的熒光強(qiáng)度與使用結(jié)合至quantumtmsimply抗小鼠igg微球(bangslaboratories#815)的相同抗體的染色進(jìn)行比較，以計(jì)算細(xì)胞的her2表面受體的數(shù)量。心肌細(xì)胞中脂質(zhì)體的攝入：按照制造商的說明書(celldynamicsinternationalcat#cmc-100-110-001)，將ipsd心肌細(xì)胞以250,000個(gè)細(xì)胞/孔放置于24孔組織培養(yǎng)板中。兩天后，去除孔中0.5ml的培養(yǎng)基，并替換為0.5ml的15.0μg/ml(阿霉素當(dāng)量)的mm-302、pld或游離阿霉素。以“8字形”將板旋轉(zhuǎn)20次，以使細(xì)胞最大化地暴露于脂質(zhì)體。使用mm-302、pld或游離阿霉素以所指定時(shí)間孵育細(xì)胞，之后去除培養(yǎng)基，用0.5ml的pbs將細(xì)胞洗滌一次。去除pbs，并向各個(gè)孔添加0.5ml的0.05％胰蛋白酶。監(jiān)測(cè)細(xì)胞，一旦開始分離，向各個(gè)孔添加0.5ml的含有fbs的培養(yǎng)基，以使胰蛋白酶失活。收集細(xì)胞并將其放置于微量離心管中。將細(xì)胞在4℃以1,500rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。通過渦旋和抽吸將細(xì)胞球重懸在0.5ml的1.0％乙酸于甲醇中的溶液中，并將其在-80℃放置1小時(shí)，以提取阿霉素。將含有重懸細(xì)胞球的微量離心管在冷室中以10,000rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘，并將450μ1的上清液轉(zhuǎn)移到hplc管。在hplc機(jī)器上運(yùn)行樣品，并且通過將數(shù)值關(guān)聯(lián)到阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定每個(gè)樣品的濃度。脂質(zhì)體的生物學(xué)分布：將小鼠隨機(jī)分成4組，分別接受pbs、阿霉素、mm-302-dii5或pld-dii5的單次靜脈(i.v.)給藥(均為3mg/kg)。在單次給藥之后的0.5、4、24和96h(阿霉素)或168h(mm-302-dii5和pld-dii5)處死小鼠(n＝4/時(shí)間點(diǎn)/組)。在處死前五分鐘，使用100μl的fitc-凝集素靜脈(i.v.)注射小鼠，以標(biāo)記脈管細(xì)胞。阿霉素的hplc定量：對(duì)心臟組織進(jìn)行稱重，并使用tissuelysertm(qiagen)以1mlh2o解聚3min。然后將100μl的組織勻漿轉(zhuǎn)移到新管中并添加900μl的1％乙酸/甲醇。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，如上所述，用藥物處理細(xì)胞、使其受胰蛋白酶作用并使用1.0％乙酸于甲醇的溶液使其裂解。將裂解產(chǎn)物渦旋10秒并在-80℃放置1h。將樣品在室溫(rt)下以10,000rpm旋轉(zhuǎn)10min。通過hplc(dionex)，使用c18反相柱(synergitm250×4.60mm4μm柱)來分析上清液和阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品。洗脫阿霉素，在7min時(shí)間中，以1.0ml/min的流量運(yùn)行以下梯度：30％乙腈；70％0.1％三氟乙酸(tfa)/h2o至55％乙腈；45％0.1％tfa/h2o。使用在485nm處激發(fā)并在590nm處發(fā)射的內(nèi)嵌的熒光檢測(cè)器，在6.5min時(shí)檢測(cè)阿霉素峰。通過使用已知量阿霉素的對(duì)照組心臟的峰確定的，心臟組織中阿霉素的提取率是83％。心臟速凍切片的共聚焦顯微和圖像分析：10μm厚的心臟切片在室溫下風(fēng)干30min，使用在貼片介質(zhì)(gold,invitrogen)中1:10,000稀釋的進(jìn)行復(fù)染，并進(jìn)行貼片。在裝備有enterprise(351、364nm)、氬(argon)(458、477、488、514nm)、hene1(543nm)和hene2(594nm)激光以及plan-40×/1.3dic油鏡的lsm510共聚焦顯微鏡上使片子成像。使用developerxdtm(definiens,parsippany,nj)進(jìn)行細(xì)胞核阿霉素的圖像分析和定量。在hoechst通道中分離出細(xì)胞核。在阿霉素通道中分離出阿霉素陽性細(xì)胞核。以阿霉素通道中目標(biāo)對(duì)象的數(shù)量除以hoechst通道中總細(xì)胞核對(duì)象，來定量阿霉素陽性細(xì)胞核的百分比。受體定量：使干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞受胰蛋白酶作用，洗滌，并如以上“her2表達(dá)細(xì)胞系中脂質(zhì)體的攝入”所述地確定her2水平。成活力：以指定濃度的mm-302、pld和阿霉素處理escd心肌細(xì)胞3h。用pbs洗滌細(xì)胞兩次，添加新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞再孵育24h。使用promega(madison,wi)的celltiter-評(píng)價(jià)細(xì)胞成活力，并且相對(duì)于未處理的群來確定成活細(xì)胞的百分比。肌鈣蛋白i的elisa：按照制造商的操作指南對(duì)15,000個(gè)ipsd心肌細(xì)胞(cellulardynamicsinternational,madisonwi)進(jìn)行鋪板。使用指定濃度的游離阿霉素、pld或mm-302處理細(xì)胞24h。收集上清液并使用人肌鈣蛋白ielisa(catalog#:gwb-83a61f,genwaybiotech,sandiegoca)按照制造商的操作指南進(jìn)行分析。按照制造商的操作指南，在100μl的剩余細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞成活力檢定(catalog#:a-13261,invitrogen,grandisland,ny)。高含量(high-content)分析：如上所述處理心肌細(xì)胞。使用3.7％甲醛固定細(xì)胞，使用含有0.1％吐溫20的pbs(pbs-t)洗滌兩次，并用甲醇使其通透。使用封閉緩沖液(lincoln,ne)與pbs-t的1:1混合物在室溫(rt)下封閉細(xì)胞1h。使用1:400稀釋的cellsignalingtechnology(beverly,ma)的指定一抗對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并在4℃搖動(dòng)孵育過夜。洗滌細(xì)胞，并用1:2,000稀釋的熒光標(biāo)記二抗在室溫下孵育1h。使用pierceproteinresearchproducts(rockford,il)的1:10,000稀釋的hoechst33342和1:1,000稀釋的全細(xì)胞染料(wholecellstain)，在室溫下對(duì)細(xì)胞染色30min，以分別使dna和全細(xì)胞可視化。使用具有10×物鏡的appliedprecisioninstrumentsarray高含量掃描儀(issaquah,wa)來掃描板的hoechst33342/全細(xì)胞染料(460nm)、阿霉素(595nm)和apc/dii5(657nm)。使用軟件imagerail(如millard等人,natmethods.2011；8:487-92中記載的)來分析圖像。對(duì)細(xì)胞核和全細(xì)胞信號(hào)建立強(qiáng)度閾值。然后將該閾值應(yīng)用于所有圖像并且用于分離出單個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為對(duì)于指定通道的給定孔中所有細(xì)胞的平均像素強(qiáng)度。心肌細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：使用icelltm鋪板培養(yǎng)基(cdi#cmm-100-110-005,lot1013740)和icelltm維持培養(yǎng)基(cdi#cmm-100-120-005,lot1000305)來培養(yǎng)ips來源的心肌細(xì)胞(icelltmips來源的人心肌細(xì)胞-cellulardynamicsinternational(cdi),madison,wisconsin-cdi#cmc-100-010-001,lot1258680)，并將其暴露于mm-302的組分。然后使用免疫染色和高含量顯微術(shù)(highcontentmicroscopy)測(cè)量心肌細(xì)胞中磷酸化akt(pakt)和磷酸化erk(perk)的水平。使用曲妥珠單抗、拉帕替尼、或mm-302抗體(f5-scfv)以及當(dāng)量濃度為5.0μg/mlmm-302的不含阿霉素(f5-lipo)的mm-302分子(脂質(zhì)體)對(duì)細(xì)胞預(yù)處理24小時(shí)。在分別用10nμ和5nm的調(diào)蛋白刺激l0分鐘后，如上所述，針對(duì)(a)pakt和(b)perk對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并使用高含量顯微術(shù)進(jìn)行成像。之后在封閉緩沖液中以1:400稀釋使用以下一抗：perk抗體-細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(cst-danversmassachusetts)-目錄9106l(磷酸化p44/42mapk(erk1/2)(thr202/tyr204)(e10)小鼠mab#9106)；pakt抗體-cst-目錄4060l(磷酸化akt(ser473)(d9e)xptm兔mab#4060)。二抗是抗小鼠igg(h+l)f(ab')2片段(alexa647結(jié)合物)-cst目錄4410；抗兔igg(h+l)f(ab')2片段(alexa647結(jié)合物)-cst-目錄4414。如上所述使用全細(xì)胞染料和dna染料(hoechst33342)。分析圖像，并基于hoechst33342細(xì)胞核染色來分離單個(gè)細(xì)胞。對(duì)各個(gè)染料的單細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量并將其表示為單個(gè)細(xì)胞的平均相對(duì)強(qiáng)度。使用上述方法或其較小變型來獲得以下實(shí)施例中的結(jié)果。在表達(dá)各種水平her2的腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞攝入研究表明，相比于pld，mm-302向her2過表達(dá)腫瘤細(xì)胞遞送顯著更高的阿霉素水平，并且與高滲透的游離阿霉素相似或比其更高。然而，在人心肌細(xì)胞中，盡管游離阿霉素再次以高水平吸收，但mm-302和pld的阿霉素?cái)z入顯著更低。小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，與pld相比，mm-302具有相似的半衰期、清除率和器官分布。在her2過表達(dá)的bt474乳腺腫瘤異種移植物和nci-n87胃腫瘤異種移植物中，mm-302顯示出比游離蒽環(huán)類和pld更優(yōu)異的抗腫瘤活性。腫瘤微觀分布研究還表明，阿霉素在腫瘤中的定位差異可能是mm-302相比于游離阿霉素和pld具有增強(qiáng)活性的原因。實(shí)施例1：在體外實(shí)驗(yàn)中的her2表達(dá)與mm-302攝入之間的相關(guān)性：如上所述確定多個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞表面her2表達(dá)水平。然后，使用15μg/mlmm-302(圖1a，表1)或pld(圖1b，表2)對(duì)相同的細(xì)胞系處理180分鐘，之后收集細(xì)胞并通過hplc對(duì)與細(xì)胞相關(guān)的阿霉素的量進(jìn)行定量。通過繪制各個(gè)細(xì)胞系的每一細(xì)胞的her2受體數(shù)量vs.處理之后相同細(xì)胞系中每一細(xì)胞中存在的阿霉素的量，不斷增加的her2水平與不斷增加的阿霉素之間的關(guān)系變得明顯。通過該表示，在每一細(xì)胞約200,000個(gè)her2受體處呈現(xiàn)出拐點(diǎn)，而表達(dá)大于該數(shù)目的細(xì)胞似乎具有持續(xù)更高水平的細(xì)胞相關(guān)阿霉素?？偟膩碚f，這些結(jié)果支持mm-302的特異性，表達(dá)在拐點(diǎn)之上的her2水平的細(xì)胞(例如her2過表達(dá)癌癥)有高攝入，表達(dá)低于拐點(diǎn)的(例如正常組織中的細(xì)胞，例如心肌細(xì)胞)her2水平的細(xì)胞具有“從無到極少”的攝入。表1：her2水平vsmm-302攝入(mkn-45細(xì)胞的結(jié)果在檢測(cè)水平之下)表2her2水平vspld攝入(adrr-her2、hcc1954和mda-mb-361細(xì)胞的結(jié)果在檢測(cè)水平之下)為對(duì)不同細(xì)胞群體中的攝入進(jìn)行定量，mm-302制備成含有紅色熒光羰花青示蹤劑diic18(5)-ds(invitrogend12730-簡稱為dii5)。dii5是親脂性熒光染料，其在擠壓過程中被插入到脂質(zhì)體的脂雙層中。表達(dá)不同范圍的人her2的4t1-her2細(xì)胞群體與10μg/ml熒光標(biāo)記的mm-302一起孵育3小時(shí)，洗滌，并再孵育21小時(shí)。收集細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞表面的人her2進(jìn)行染色并經(jīng)流氏細(xì)胞術(shù)分析her2水平和脂質(zhì)體結(jié)合程度。盡管4t1細(xì)胞系表達(dá)鼠her2，mm-302不與鼠受體結(jié)合。圖顯示出，4t1細(xì)胞對(duì)這些脂質(zhì)體的攝入強(qiáng)烈地依賴于人her2的表達(dá)(圖1c)。在表達(dá)不同范圍的her2的hela細(xì)胞系群體中獲得相似的結(jié)果(圖ld)。這些結(jié)果還表明，mm-302在與具有高h(yuǎn)er2水平的細(xì)胞的結(jié)合中高度有效，但幾乎不結(jié)合或不結(jié)合具有相對(duì)較低her2蛋白表達(dá)的細(xì)胞。實(shí)施例2：mm-302能有效地內(nèi)化到her2過表達(dá)腫瘤細(xì)胞中，并顯著抑制異種移植模型中腫瘤的生長：為確定mm-302對(duì)her2過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的結(jié)合和內(nèi)化水平，將bt474-m3細(xì)胞(1.7×l06個(gè)her2/細(xì)胞)與15μg/ml的mm-302、pld或游離阿霉素孵育高達(dá)3h(圖2a)。由總細(xì)胞結(jié)合(圖2a)和細(xì)胞核阿霉素積聚(圖2b)所證實(shí)，mm-302有效地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。相比之下，非靶性的類似物pld沒有顯示出任何可評(píng)估的積聚，表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，需要靶向從而有效遞送脂質(zhì)體阿霉素。作為對(duì)照，游離阿霉素顯示出可自由地進(jìn)入細(xì)胞并積聚在細(xì)胞核中。結(jié)果顯示出mm-302(而非pld)對(duì)her2過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的有效結(jié)合和內(nèi)化。在乳腺癌異種移植模型中評(píng)價(jià)mm-302的抗腫瘤活性。使用bt474-m3細(xì)胞接種小鼠，并且當(dāng)腫瘤體積達(dá)到250mm3的平均值時(shí)，開始用pbs(對(duì)照)、mm-302或pld(均為6mg/kg阿霉素當(dāng)量)進(jìn)行處理(q7d，n＝3次給藥)。相比于對(duì)照組，mm-302和pld均顯著地抑制腫瘤生長(第55天的t檢驗(yàn)；p<0.0001)。相對(duì)于pld，mm-302引起更強(qiáng)的腫瘤生長抑制(第55天的t檢驗(yàn)；p＝0.0310)(圖2c)。在研究結(jié)束時(shí)，在mm-302中觀察到3個(gè)完全的消退，而在pld中僅觀察到1個(gè)。mm-302和pld具有相似的藥代動(dòng)力學(xué)特性(圖2d)，表明提高的效力是her2靶向的結(jié)果，而非延長的暴露的結(jié)果。實(shí)施例3：her2水平對(duì)體內(nèi)mm-302攝入的影響：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來證實(shí)異種移植模型中由her2介導(dǎo)的靶腫瘤細(xì)胞對(duì)mm-302的攝入，并與非靶性的脂質(zhì)體阿霉素比較。使用dil5標(biāo)記的mm-302(dil5-f5-pld)或ut-pld(dil5-ut-pl)來注射在乳房脂肪墊中荷載bt474-m3異種移植腫瘤的小鼠。制備腫瘤單細(xì)胞懸液，并用fitc-her2抗體對(duì)其染色。通過facs確定dil5-陽性-her2-陽性細(xì)胞。識(shí)別出具有提高的阿霉素水平的區(qū)別細(xì)胞群，表明脂質(zhì)體不僅僅沉積在腫瘤間隙中，還吸收到細(xì)胞自身中(圖3a)。這在從her2靶向脂質(zhì)體處理的腫瘤得來的細(xì)胞樣品中特別明顯。具有提高的脂質(zhì)體含量的細(xì)胞的百分比在每一細(xì)胞表達(dá)平均100,000和200,000個(gè)her2受體的細(xì)胞子集中開始上升。非靶性的脂質(zhì)體不會(huì)被優(yōu)先攝入到her2陽性細(xì)胞中。這些結(jié)果表明，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中mm-302的攝入是her2依賴性的，并且結(jié)果還支持，相對(duì)于每一細(xì)胞至少為100,000～200,000個(gè)her2受體的水平是mm-302的顯著結(jié)合和內(nèi)化所必需的。基于單個(gè)細(xì)胞，在全組織切片中確定her2膜強(qiáng)度的分布，并顯示在圖3b中，呈現(xiàn)出組織中表達(dá)的變化性。實(shí)施例4：人心肌細(xì)胞不表達(dá)充足的her2水平以主動(dòng)攝入mm-302：已報(bào)道，人心肌細(xì)胞表達(dá)低水平的her2，因此被認(rèn)為具有mm-302攝入的潛能。獲得escd和ipsd人心肌細(xì)胞，以研究mm-302對(duì)體外人心臟細(xì)胞的作用。通過qfacs將心肌細(xì)胞上的her2受體水平確定為，在人escd和ipsd心肌細(xì)胞中分別為每一細(xì)胞約70,000和200,000個(gè)受體。這些結(jié)果與所報(bào)道的人心臟組織中her2表達(dá)低是一致的(fuchs等人,breastcancerrestreat.2003；82:23-8)。經(jīng)定量免疫組化測(cè)量正常和患病的人心臟組織上的her2表達(dá)水平。對(duì)人心臟組織微陣列(tma)進(jìn)行her2和dapi染色，并且使用軟件對(duì)(平均her2強(qiáng)度)/細(xì)胞核進(jìn)行定量。如上所述，對(duì)處于不同her2表達(dá)水平的細(xì)胞系的細(xì)胞團(tuán)陣列進(jìn)行染色，并且對(duì)(平均her2強(qiáng)度)/細(xì)胞核進(jìn)行定量，并針對(duì)相應(yīng)log(her2受體#)繪圖以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)?；谒a(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)，插入不同人心臟tma細(xì)胞核的平均her2受體#/細(xì)胞核(表3)。表3：插入的her2受體數(shù)量為確定心肌細(xì)胞上her2表達(dá)水平是否足以引起mm-302的攝入，在對(duì)escd(圖4a)和ipsd(圖4b)心肌細(xì)胞處理之后通過hplc對(duì)總的細(xì)胞內(nèi)阿霉素進(jìn)行定量。用游離阿霉素處理的心肌細(xì)胞(和癌細(xì)胞)引起阿霉素在所有細(xì)胞中積聚。pld的處理不在任何心肌細(xì)胞類型中引起增加的阿霉素遞送。與her2過表達(dá)的癌細(xì)胞相比，心肌細(xì)胞上的her2表達(dá)水平不足以促進(jìn)mm-302的主動(dòng)攝入?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，與pld相比，經(jīng)由mm-302的阿霉素遞送并不增加對(duì)低水平her2表達(dá)的非靶性細(xì)胞例如心肌細(xì)胞的阿霉素暴露。實(shí)施例5：mm-302不減少人心肌細(xì)胞的成活力或激發(fā)凋亡反應(yīng)：暴露于低水平阿霉素可能有細(xì)胞毒性。為確定mm-302或pld的處理是否影響心肌細(xì)胞的成活力，escd心肌細(xì)胞與指定濃度的游離阿霉素、pld或mm-302孵育3h，隨后洗滌，并在新鮮培養(yǎng)基中孵育24h。游離阿霉素的處理在低至0.2μg/ml的濃度下就會(huì)導(dǎo)致成活力的損失(圖4c)。相反地，mm-302和pld的處理在測(cè)試的任何濃度下均不引起成活力的降低，包括高達(dá)45μg/ml的超治療濃度。為進(jìn)一步測(cè)試mm-302或pld的處理是否影響心肌細(xì)胞的成活力，使用指定濃度的游離阿霉素、pld或mm-302對(duì)ipsd心肌細(xì)胞處理24小時(shí)。與pld和mm-302的處理相比，阿霉素的處理導(dǎo)致成活力明顯降低(圖4d)。升高水平的心肌肌鈣蛋白的存在是心臟損傷的臨床指征。對(duì)(d)中ipsd心肌細(xì)胞的上清液分析肌鈣蛋白i的水平。如圖4e所示，與pld或mm-302的處理相比，阿霉素處理導(dǎo)致肌鈣蛋白i的顯著增加。這些結(jié)果表明，escd和ipsd心肌細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感，且mm-302和pld的處理不提供充足的阿霉素暴露來影響心肌細(xì)胞的成活力。細(xì)胞對(duì)低水平阿霉素的暴露可能引起在細(xì)胞成活力測(cè)量中無法反映出的微小細(xì)胞變化，包括dna損傷、細(xì)胞應(yīng)激和初期凋亡。在用mm-302、pld和游離阿霉素處理之后，對(duì)心肌細(xì)胞中各個(gè)這些應(yīng)答通路中的蛋白進(jìn)行染色，并使用高含量顯微術(shù)進(jìn)行成像。通過使用imagerail分析所得的圖像，產(chǎn)生單細(xì)胞數(shù)據(jù)。響應(yīng)于雙鏈dna損傷，組蛋白h2ax變?yōu)榱姿峄?，從而形成?h2ax。用游離阿霉素處理心肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致劑量依賴性的細(xì)胞核γ-h2ax的增加(圖5a)。然而，mm-302和pld的處理不會(huì)在任何測(cè)試濃度增加細(xì)胞核γ-h2ax信號(hào)，表明在體外實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)體包囊防止對(duì)心肌細(xì)胞的dna損傷。響應(yīng)于細(xì)胞應(yīng)激，hsp27和p53可以被磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，隨后根據(jù)損傷程度的不同進(jìn)行dna修復(fù)或凋亡。暴露于游離阿霉素的心臟細(xì)胞證實(shí)磷酸化hsp27和磷酸化p53的劑量依賴性增加，表明處理之后引起細(xì)胞應(yīng)激(圖5b和5c)。然而，在mm-302或pld處理的細(xì)胞中，不管濃度如何，沒有觀察到磷酸化hsp27的增加。在大多數(shù)情況下，在mm-302或pld處理的細(xì)胞中，似乎對(duì)磷酸化p53沒有作用，除在用5.0μg/ml的mm-302處理之后磷酸化p53稍有增加。然而，以此濃度以及更高的濃度處理并不引起增加的細(xì)胞死亡。在嚴(yán)重的dna損傷和細(xì)胞應(yīng)激的情況下，細(xì)胞可以引發(fā)凋亡通路，包括胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化，最終引起dna修復(fù)蛋白parp的切割。5.0μg/ml游離阿霉素的處理引起細(xì)胞核中已切割的parp(cparp)的增加(圖5d)，與觀察到的細(xì)胞死亡增加相關(guān)。然而，mm-302或pld的處理不會(huì)引起增加的細(xì)胞核cparp，表明在這些條件下的處理不足以引起凋亡。實(shí)施例6：her2靶向劑對(duì)心肌細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響：阿霉素和曲妥珠單抗的同時(shí)使用是禁忌，因?yàn)樵诮M合治療的患者中觀察到心臟事件的不可接受的高發(fā)率。與該組合相關(guān)的心肌毒性的作用機(jī)理被認(rèn)為是，同時(shí)誘發(fā)了由阿霉素造成的細(xì)胞應(yīng)激以及由曲妥珠單抗介導(dǎo)的her2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的抑制，其中該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是響應(yīng)于阿霉素引起的細(xì)胞應(yīng)激所必需的。為確定mm-302的預(yù)處理是否改變her2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(心肌細(xì)胞中的重要通路)，使用曲妥珠單抗、拉帕替尼(小分子her2酪氨酸激酶抑制劑)或mm-302抗體(f5-scfv)以及與mm-302相同除其不含阿霉素外的空脂質(zhì)體(f5-lipo)來對(duì)ipdd心肌細(xì)胞預(yù)處理24小時(shí)。在使用10nμ(圖6a)和5nm(圖6b)調(diào)蛋白(hrg)激發(fā)10min后，如上所述通過高含量顯微術(shù)測(cè)量磷酸化akt(pakt，圖6a)和磷酸化erk(perk，圖6b)的水平。用曲妥珠單抗預(yù)處理24h引起兩種蛋白的hrg介導(dǎo)磷酸化的降低。拉帕替尼的預(yù)處理引起akt和erk的基礎(chǔ)磷酸化的降低，以及這些蛋白的hrg誘導(dǎo)的磷酸化的完全抑制。f5-lipo的預(yù)處理不抑制akt或erk的hrg誘導(dǎo)的磷酸化。這些結(jié)果表明，盡管靶向her2，mm-302不抑制心肌細(xì)胞中配體引發(fā)的磷酸化akt和磷酸化erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得這些重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍正常工作。這些結(jié)果還示出，曲妥珠單抗和拉帕替尼比f5scfv或f5lipo對(duì)心肌細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有顯著更大的負(fù)面影響。進(jìn)而這是mm-302的抗her2抗體組分比抗her2抗體曲妥珠單抗具有更少心臟毒性的表征。結(jié)果示出，單獨(dú)的f5或與mm-302脂質(zhì)體的外部連接的f5不干預(yù)心肌細(xì)胞中調(diào)蛋白(配體)-激發(fā)的her2/her3異二聚體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形式，對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制被認(rèn)為是介導(dǎo)曲妥珠單抗引發(fā)心肌毒性的關(guān)鍵機(jī)制。實(shí)施例7：相比于游離阿霉素，mm-302在小鼠心臟組織中具有更低的積聚：具有高度特異性的抗體片段例如f5的脂質(zhì)體靶向通常不會(huì)改變脂質(zhì)體的總的組織沉積，而會(huì)在外滲之后改變其微觀分布。在如上所述接種的荷載nci-n87腫瘤的小鼠的鼠心臟組織(圖7a)、人異種移植腫瘤組織(圖7b)和爪組織(圖7c)中，比較mm-302(正方形)、pld(ut-pld，三角形)和阿霉素(游離阿霉素，圓形)的宏觀水平的生物學(xué)分布。使用mm-302、pld或游離阿霉素(均為3mg/kg阿霉素當(dāng)量)對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈注射(n＝4/時(shí)間點(diǎn)/組)，并在注射后0.5、4、24和96h(對(duì)于阿霉素)或168h(對(duì)于mm-302和pld)收集心臟并通過hplc對(duì)阿霉素進(jìn)行定量(圖7a)。相比于兩種脂質(zhì)體制劑，游離阿霉素的注射在0.5h時(shí)引起心臟中的高峰值暴露(10％的注射劑量(i.d.)/g組織)。在游離阿霉素注射之后，心臟組織中阿霉素的清除比mm-302和pld更快，并且在24h時(shí)，所檢測(cè)到的阿霉素的量(0.77％的i.d./g組織)接近背景。mm-302和pld均具有持續(xù)的積聚特性，在24h達(dá)到峰值(對(duì)于mm-302和pld分別為2.8％和2.6％)，而數(shù)值在168h時(shí)返回到背景。這些結(jié)果的范圍與之前報(bào)道的其它pld制劑在心臟的生物學(xué)分布數(shù)據(jù)相似。在mm-302和pld的心臟生物學(xué)分布之間沒有觀察到顯著的差異。實(shí)施例8：相比于游離阿霉素，mm-302在小鼠組織中引起更低的細(xì)胞核阿霉素積聚。在從注射有游離阿霉素、mm-302-dii5或pld-dii5(均為3mg/kg阿霉素當(dāng)量)的小鼠心臟組織產(chǎn)生的冰凍切片中，在注射后0.5、4和24h，分析阿霉素(天然熒光)和脂質(zhì)體(dii5標(biāo)記的)的微觀分布。為使心臟脈管系統(tǒng)可視化，在處死前5min使用fitc-凝集素靜脈注射小鼠。通過熒光共聚焦顯微術(shù)使心臟切片成像。在分析的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0.5、4和24h)的不同處理組的代表性視野顯示在圖7d中。也對(duì)未處理的心臟成像并且在圖7d(左板塊)中顯示代表性圖像。阿霉素與細(xì)胞核信號(hào)的共定位顯示在圖7d的底板塊中。對(duì)于在0.5h時(shí)間點(diǎn)的阿霉素和mm-302，細(xì)胞核阿霉素信號(hào)的更高倍圖像顯示在圖7e中。盡管對(duì)于mm-302，阿霉素信號(hào)在細(xì)胞核中不可見，對(duì)于游離阿霉素，大多數(shù)細(xì)胞核是阿霉素陽性的。如上所述分析圖像，并且確定阿霉素陽性細(xì)胞核的百分比。注射游離阿霉素在0.5h時(shí)引起顯著的阿霉素的細(xì)胞核積聚，其中約50％的細(xì)胞核為阿霉素陽性。然而，經(jīng)過4h，僅23％的細(xì)胞核為阿霉素陽性且信號(hào)在24h時(shí)返回到基礎(chǔ)水平。對(duì)于脂質(zhì)體制劑，在大多數(shù)視野檢測(cè)到幾乎沒有信號(hào)至沒有信號(hào)。偶爾在dii5通道(脂質(zhì)體)中檢測(cè)到信號(hào)。在這些情況下，脂質(zhì)體信號(hào)主要與fitc-凝集素信號(hào)共定位，表明脂質(zhì)體沒有外滲到心臟組織而仍保留在血管腔隙。在mm-302-dii5或pld-dii5處理時(shí)，在大部分分析的心臟視野中，沒有在細(xì)胞中檢測(cè)到阿霉素，與時(shí)間點(diǎn)無關(guān)。在0.5h收集的四個(gè)mm-302-dii5心臟的一個(gè)中，以及在4h收集的四個(gè)mm-302-dii5心臟的一個(gè)中，在血管外檢測(cè)到脂質(zhì)體信號(hào)，并且在較小百分比的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)阿霉素。相似地，在0.5h收集的四個(gè)pld心臟的一個(gè)中，以及在24h收集的四個(gè)pld心臟的兩個(gè)中，圖像反映血管外脂質(zhì)體信號(hào)以及細(xì)胞核阿霉素的存在。這些視野沒有呈現(xiàn)為代表性圖像，然而其數(shù)值被用于圖7f所示的定量。mm-302和pld曲線下的面積均在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于游離阿霉素auc(p<0.001)。在mm-302與pld的auc之間沒有觀察到顯著差異。為在心臟組織中得到阿霉素分布和脂質(zhì)體分布的更廣的可視化，采用全心臟切片掃描。全切片心臟掃描在視覺上證實(shí)共聚焦顯微術(shù)的結(jié)果，顯示出游離阿霉素注射時(shí)較廣的具有細(xì)胞核定位的阿霉素分布，而在注射有dii5mm-302或dii5pld的小鼠心臟中僅有稀少的脂質(zhì)體和阿霉素信號(hào)。總而言之，比起游離阿霉素處理之后所觀察到的，mm-302或pld的處理顯示出顯著更低的細(xì)胞核阿霉素積聚，但這在mm-302和pld之間沒有顯著不同。等效形式本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，或者僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就能夠確定并執(zhí)行本文記載的具體實(shí)施方式的許多等效形式。這些等效形式意在包含在權(quán)利要求中。在從屬權(quán)利要求中公開的實(shí)施方式的任何組合預(yù)計(jì)將在本公開的范圍內(nèi)。參考引入對(duì)本文提到的各個(gè)和每個(gè)美國及外國專利和待決專利申請(qǐng)和公開物的公開內(nèi)容均特定地通過引用的方式全部合并入本文。當(dāng)前第1頁12