本發(fā)明涉及一種明膠海綿支架的制備方法。

背景技術(shù)：

明膠是膠原的部分水解產(chǎn)物，由于其無毒、無致癌、以及良好的生物相容性和生物降解性，明膠被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和醫(yī)療領(lǐng)域，例如作為傷口敷料材料、組織工程支架和藥物載體。組織工程支架材料是指能與組織活體細(xì)胞結(jié)合并能植入生物體的不同組織，并根據(jù)具體替代組織具備的功能的材料。適合于細(xì)胞和組織工程應(yīng)用的修復(fù)支架，應(yīng)具備以下特點(diǎn)：(1)無細(xì)胞毒性；(2)生物組織相容性好；(3)生物可降解，無任何殘留；(4)原料來源豐富，成本低；(5)良好的機(jī)械性能；(6)良好的三維結(jié)構(gòu)、空隙均勻、合適的空隙率；(6)制備工藝簡單，可大規(guī)模生產(chǎn)。

明膠的主要缺點(diǎn)是它的機(jī)械強(qiáng)度弱，耐水解性差。為了提高其強(qiáng)度和抗水解性，以及保持在植入期間的穩(wěn)定性，明膠支架需要通過交聯(lián)來增加穩(wěn)定性。目前已有一些技術(shù)可用于明膠材料的交聯(lián)，包括：物理方法如高溫脫水和紫外線照射；化學(xué)劑如戊二醛(gta)，1-乙基-3-(3-氨基丙基)碳二亞胺(edc)和京尼平(gp)；蛋白酶如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mtg)和辣根過氧化物酶。其中，化學(xué)交聯(lián)劑或多或少都存在著細(xì)胞毒性，隨著被交聯(lián)材料在體內(nèi)的降解，參與或者殘余在材料中的交聯(lián)劑會(huì)被釋放出來，導(dǎo)致對(duì)宿主造成傷害。物理交聯(lián)雖然無毒無害，但是卻有交聯(lián)度小，穩(wěn)定性差，單純的物理交聯(lián)無法實(shí)現(xiàn)快速交聯(lián)的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為交聯(lián)劑的明膠海綿支架及其制備方法。

本發(fā)明明膠海綿支架的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備明膠溶液：取明膠，溶于水，制備濃度為2-10％w/v的明膠溶液，滅菌；

(2)制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液：取轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，溶于磷酸鹽緩沖液，制備得到濃度為5～15％w/v的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的磷酸鹽溶液；

(3)將步驟(1)制備的明膠溶液與步驟(2)制備的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液混合，孵育，形成水凝膠，冷凍，凍干，即得海綿支架。

本發(fā)明中，w/v的比例為g/ml。

步驟(1)中，所述明膠溶液的濃度為4％w/v。

步驟(1)中，所述明膠溶液的制備方法為將明膠溶解在50℃去離子水中。

步驟(1)中，所述滅菌方法為0.22μm針式過濾器過濾滅菌。

步驟(2)中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液的濃度為10％w/v。

步驟(2)中，所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活性大于100u/克。

步驟(3)中，明膠溶液與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液的體積比為1000：(20～80)，優(yōu)選為1000：40。

步驟(3)中，所述孵育的方法是37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置。

步驟(3)中，所述凍干的條件是：在-10℃～-20℃下冷凍8h，然后在15～25℃下干燥48h。

本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的明膠海綿支架。

本發(fā)明海綿支架無細(xì)胞毒性，物理特性綜合性能優(yōu)良，具有較好的孔隙率、抗壓模量和抗降解能力，并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有采用水制備明膠溶液才能得到空隙均勻的海綿支架，而采用常規(guī)的磷酸緩沖液則無法制備得到空隙均勻的海綿支架；另外，生物相容性良好，細(xì)胞能在支架中很好的生長；將支架植入體內(nèi)，形成的材料包裹層薄，外包裹層上有毛細(xì)血管的形成，有利于新生組織的生長?？勺鳛榻M織工程支架、臨床止血海綿、藥物緩釋載體等材料，用于細(xì)胞和組織工程應(yīng)用中，具有廣闊的前景。

下面通過具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說明

圖1mtg交聯(lián)方式制備的明膠海綿支架的外觀圖示。上圖為干燥狀態(tài)，下圖為濕潤狀態(tài)。

圖2mtg交聯(lián)方式制備的明膠海綿支架的水解性能研究結(jié)果。

圖3mtg交聯(lián)方式制備的明膠海綿支架的酶解性能研究結(jié)果。

圖4皮下種植植入1月后明膠海綿的變化。(a)經(jīng)皮下注射1個(gè)月后皮下注射明膠的明膠海綿；(b)無附皮明膠海綿；(c)通過體視顯微鏡觀察收獲明膠海綿的橫截面。標(biāo)尺＝1mm。

圖5mtg明膠海綿支架材料植入大鼠皮下一個(gè)月后觀察。免疫組織化學(xué)染色(he)分析材料的生物相容性。

圖6mtg交聯(lián)方式制備的明膠海綿支架的消化效率評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖7mtg交聯(lián)方式制備的明膠海綿支架的細(xì)胞增殖能力評(píng)估。

圖8細(xì)胞活/死熒光染色。作圖為活細(xì)胞與calcein-am染色(綠色)，中間圖為死細(xì)胞染色和碘化丙啶(紅色)，右圖為合并的熒光圖像的細(xì)胞死活染色。

圖9掃描電鏡分析細(xì)胞的粘附狀態(tài)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明海綿支架的制備方法

1、制備方法

(1)水凝膠制備：定量稱取明膠(a型，300bloom；sigma，美國)溶解在50℃去離子水中，得到4％(w/v)溶液，0.22μm針式過濾器過濾滅菌。mtg(博美生物，中國，酶活性＞100u/克)溶于磷酸鹽緩沖液(pbs)獲得10％(w/v)溶液，過濾滅菌。按照每毫升明膠溶液加入40μlmtg溶液的比例制備混合溶液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置直至成膠。

(2)海綿支架的制備：將水凝膠冷凍干燥，具體是在-10℃～-20℃下冷凍8h，然后在15～25℃下干燥48h，得到海綿支架。

實(shí)施例2本發(fā)明海綿支架的制備方法

1、制備方法

(1)水凝膠制備：定量稱取明膠(a型，300bloom；sigma，美國)溶解在50℃去離子水中，得到2％(w/v)溶液，0.22μm針式過濾器過濾滅菌。mtg(博美生物，中國，酶活性＞100u/克)溶于磷酸鹽緩沖液(pbs)獲得5％(w/v)溶液，過濾滅菌。按照每毫升明膠溶液加入40μlmtg溶液的比例制備混合溶液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置直至成膠。

(2)海綿支架的制備：將水凝膠冷凍干燥，具體是在-10℃～-20℃下冷凍8h，然后在15～25℃下干燥48h，得到海綿支架。

實(shí)施例3本發(fā)明海綿支架的制備方法

1、制備方法

(1)水凝膠制備：定量稱取明膠(a型，300bloom；sigma，美國)溶解在50℃去離子水中，得到10％(w/v)溶液，0.22μm針式過濾器過濾滅菌。mtg(博美生物，中國，酶活性＞100u/克)溶于磷酸鹽緩沖液(pbs)獲得15％(w/v)溶液，過濾滅菌。按照每毫升明膠溶液加入66.7μlmtg溶液的比例制備混合溶液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置直至成膠。

(2)海綿支架的制備：將水凝膠冷凍干燥，具體是在-10℃～-20℃下冷凍8h，然后在15～25℃下干燥48h，得到海綿支架。

以下用實(shí)驗(yàn)例的方式來說明本發(fā)明的有益效果：

采用統(tǒng)計(jì)軟件spss進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)顯著性分析采用單因素方差分析(one-wayanova)，組間差異比較采用最小顯著性差異法(leastsignificantdifference,lsd)檢驗(yàn)。p＜0.05為統(tǒng)計(jì)具有顯著意義。

實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明海綿支架的物理特征檢測(cè)

取實(shí)施例1制備的海綿支架，按照如下方法檢測(cè)：

一、試驗(yàn)方法

1、孔隙率測(cè)量

明膠海綿的孔隙率測(cè)定采用液體置換法。用無水乙醇作為置換液，因?yàn)樗粫?huì)引起材料的溶脹或收縮。將預(yù)先稱重的凍干海綿浸入已知體積(v1)的乙醇溶液，真空脫氣5分鐘。記錄二者的總體積為v2。將乙醇浸漬的海綿取走，測(cè)量剩余的乙醇體積為v3。按照以下公式計(jì)算該海綿的孔隙率(ε1)：

ε1(％)＝(v1-v3)/(v2-v3)×100(1)

2、力學(xué)特征測(cè)試

采用單軸20n的力學(xué)測(cè)試裝置(艾得堡hpb、福建、中國)，對(duì)干態(tài)和濕態(tài)的明膠海綿進(jìn)行測(cè)試，獲得其壓縮模量參數(shù)。將凍干的海綿在pbs中浸泡1h獲得濕態(tài)海綿。將干態(tài)和濕態(tài)的明膠海綿制備成直徑為10mm、高度為5mm的柱狀樣品，選擇表面平坦的樣品作為測(cè)試試樣。試樣被放置在一個(gè)恒溫鋁板(新寶db-h，浙江，中國)上面，在37℃恒溫條件下以固體壓縮板模式進(jìn)行測(cè)試。在開始記錄前施加一個(gè)微小的初始力(設(shè)定為0.01n)，確保每個(gè)樣品受到相同的初始荷載。壓縮推進(jìn)速度為1mm/分鐘，實(shí)時(shí)記錄應(yīng)力-應(yīng)變曲線，一旦測(cè)試到達(dá)壓力上限值則停止測(cè)量，計(jì)算該曲線線性區(qū)直線斜率獲得壓縮模量測(cè)量值。

3、溶脹率測(cè)試

溶脹率測(cè)試:將已稱重的凍干海綿(w0)浸入去離子水，在室溫下浸泡1h，取出，將其表面多余的水分用濾紙輕輕除去，然后再次稱重(w1)。膨脹比(ε2)計(jì)算如下：

ε2(％)＝(w1-w0)/w0×100(2)

二、試驗(yàn)結(jié)果

采用mtg交聯(lián)制備的明膠水凝膠經(jīng)過凍干后形成了多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)，呈半透明白色。如圖1所示。

1、孔隙率分析：從支架的孔隙來看，mtg孔徑均勻，孔隙率為53.51±3.45％。

2、力學(xué)特征測(cè)試：在材料的干操狀態(tài)，mtg交聯(lián)后的材料彈性模量為716.2±94.5kpa。材料吸水后，彈性模量顯著下降，mtg材料的濕態(tài)彈性模量為67.4±6.8kpa。

3、溶脹率測(cè)試：mtg材料的溶脹率為1209.31±57.77％，表明本發(fā)明的明膠海綿支架吸水率較好。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明孔隙率、抗壓模量和抗降解能力良好。

實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明海綿支架的酶解性能測(cè)試

取實(shí)施例1制備的海綿支架，按照如下方法檢測(cè)：

1、水解性能測(cè)試

將交聯(lián)的海綿支架材料浸泡在去離子水中一段時(shí)間，然后評(píng)估它們的降解率。預(yù)稱重凍干明膠海綿，用75％酒精消毒滅菌20min，以避免細(xì)菌污染造成材料降解，然后用滅菌的去離子水洗滌幾次。將海綿和水溶液放置在37℃.細(xì)胞培養(yǎng)箱中，于指定時(shí)間點(diǎn)(1-12周以內(nèi))，將未降解的海綿支架材料取出，凍干后稱重。通過計(jì)算剩余重量與原重量的百分比確定生物材料的降解率。

2、體外酶降解測(cè)試

通過暴露明膠海綿于各種酶，評(píng)估它們的的生物穩(wěn)定性和降解率。將凍干海綿在pbs中浸潤1h后，取出海綿，用過濾紙除去多余的水分，然后稱重。將已稱重的濕海綿被浸入0.1％ⅰ型膠原酶(>125cdu/mg，invitrogen公司，美國)，0.1％ⅱ型膠原酶(>125cdu/mg，invitrogen公司)，0.1％ⅳ型膠原酶(>125cdu/mg，invitrogen公司)，和0.25％胰蛋白酶(250nfu/mg，invitrogen公司)，0.1％胃蛋白酶(800-2500u/mg,sigma)溶液中6h。以上酶容液均采用pbs配制。所有酶降解試驗(yàn)都是在37℃恒溫水浴振蕩箱中完成。在指定的時(shí)間點(diǎn)：0.5h,1h,1.5h,2h,3h,4h,5h,6h,，收集殘余的海綿,小心去除材料表面多余的水分，然后再次稱重。通過計(jì)算剩余重量與原始重量的比值確定材料降解率。

二、試驗(yàn)結(jié)果

1、水解性能測(cè)試：未交聯(lián)的明膠海綿抗水解能力很差，例如100mg未交聯(lián)的明膠海綿浸入到37度溫水以后，大約在2分鐘內(nèi)完全溶解。與未交聯(lián)的明膠海綿相比，交聯(lián)后的明膠海綿，其抗水解能力顯著增強(qiáng)。mtg材料的抗水解能力非常高，在37度溫水中浸泡一個(gè)月以后，未見質(zhì)量減少，繼續(xù)浸泡4-5個(gè)月，材料的質(zhì)量保持在94％以上。如圖2所示。

2、體外酶降解測(cè)試：分別采用多種酶對(duì)這些材料進(jìn)行測(cè)試，以便了解這些材料的酶解性能。所采用的蛋白酶中，除了木瓜蛋白酶以外，膠原酶i型，ii型和iv型，胰酶和胃蛋白酶都是哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的蛋白酶，同時(shí)也是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的蛋白酶，在細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增和消化過程當(dāng)中經(jīng)常使用的。通過了解這些蛋白酶對(duì)材料的降解作用，這樣可以在細(xì)胞培養(yǎng)過程當(dāng)中有效地利用這些蛋白酶對(duì)材料進(jìn)行操作，同時(shí)也了解這一材料在植入體內(nèi)后可能受到的蛋白酶作用。

0.1％膠原酶i型，ii型和iv型是細(xì)胞在消化過程中常用的消化酶濃度，這三種膠原酶，盡管亞型不同，但它們對(duì)四種不同的交聯(lián)方式的明膠海綿材料來說，其材料酶解曲線走向基本上相似。不過對(duì)于不同的材料而言，在不同時(shí)間點(diǎn)的膠原酶酶解程度是有區(qū)別的，膠原酶對(duì)mtg材料的酶解作用較為緩慢，膠原酶作用一小時(shí)后，仍然還有50％以上的殘余質(zhì)量，大約要四個(gè)小時(shí)殘余質(zhì)量才會(huì)小于20％。

0.25％的胰酶常用于細(xì)胞培養(yǎng)中，作為消化液消化細(xì)胞。了解這個(gè)酶對(duì)細(xì)胞的作用，有助于了解從細(xì)胞-明膠海綿材料中消化細(xì)胞所需要的時(shí)間，同時(shí)也有助于防止過度消化，避免對(duì)材料造成降解。0.25％的胰酶對(duì)mtg材料的消化作用曲線與膠原酶相似，但降解度要高一些。

胃蛋白酶雖然也是體內(nèi)常見的消化酶，但它對(duì)明膠海綿材料的消化作用比較弱，對(duì)于mtg材料而言，6小時(shí)消化后有40％以上的材料未被消化。

木瓜蛋白酶對(duì)mtg材料的消化作用與膠原酶相似，如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明降解速度合適。

試驗(yàn)例3本發(fā)明海綿支架材料的生物相容性測(cè)試

取實(shí)施例1制備的海綿支架，按照如下方法檢測(cè)：

1、體內(nèi)相容性測(cè)試

采用動(dòng)物皮下植入的方法檢驗(yàn)海綿支架材料的體內(nèi)相容性，詳細(xì)方法可參見文章(yangg,etal.enzymaticallycrosslinkedgelatinhydrogelpromotestheproliferationofadiposetissue-derivedstromalcells.peerj,2016.4:p.e2497)。簡言之，先用75％酒精浸泡20min，對(duì)四種明膠海綿進(jìn)行消毒，然后用pbs清洗三次，dmem培養(yǎng)液中浸泡12h，取出，切割成7mm×7mm×4mm大小，在無菌室內(nèi)用手術(shù)刀在成體sd大鼠(7-8周齡)背側(cè)切～1cm的切口，在大鼠皮下拓展材料大小的空間。然后植入材料?？偣?2只大鼠隨機(jī)接受兩次皮下埋植，最終每組材料有五個(gè)重復(fù)樣本。另外有四個(gè)切口直接縫合，不作植入，留作陰性對(duì)照。材料植入一個(gè)月后，處死大鼠，用手術(shù)剪取出植入的海綿以及附帶的結(jié)締組織和皮膚。觀察拍照后，剪除附帶的皮膚，保留材料及其包裹組織，用游標(biāo)卡尺測(cè)量包裹物的長寬高，估算包裹物的體積。接下來對(duì)材料的降解程度進(jìn)行測(cè)試。將材料包裹物用鋒利的手術(shù)刀沿水平面居中切開，暴露橫截面，放置在體視顯微鏡下觀察拍照。使用ipp(imageproplus6.0，美國)軟件提供的直線測(cè)量工具測(cè)量包裹組織的厚度，估算整個(gè)包裹組織的體積，求出剩余海綿的體積以及材料的降解程度。

2、細(xì)胞接種效率:所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照四川大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)指南進(jìn)行。原代adscs的分離方法，參見文章(liz,etal.[biphasicpulsedelectricalstimulationpromotesthedifferentiationofadipose-derivedstemcellsintocardiomyocyte-likecells].xibaoyufenzimianyixuezazhi,2015.31(9):p.1200-4,1210；yangg,etal.enzymaticallycrosslinkedgelatinhydrogelpromotestheproliferationofadiposetissue-derivedstromalcells.peerj,2016.4:p.e2497)。按照上一節(jié)的方法，準(zhǔn)備dmem浸泡的明膠海綿。吸干多余水分，在超凈臺(tái)中中晾干1h。將海綿轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，每個(gè)海綿接種200μl的細(xì)胞懸液(包含大約1×10⁶個(gè)細(xì)胞)。將接種后的海綿小心移到另外一快新的24孔板。收集原先24孔板中殘留的細(xì)胞(在接種過程中從支架上滲漏下來的細(xì)胞)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定殘留的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算接種細(xì)胞的總數(shù)與殘留細(xì)胞之差，可以認(rèn)為是粘附在海綿材料中的細(xì)胞樹目，將此數(shù)目除以細(xì)胞接種總數(shù)獲得接種效率。

3、消化時(shí)間測(cè)定:如上面所述，將細(xì)胞接種到四種明膠海綿上，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置8小時(shí)使細(xì)胞完全附著在材料上，孵育后，棄培養(yǎng)液，pbs沖洗3次，加入0.1％ⅰ型膠原酶進(jìn)行細(xì)胞消化。在不同的時(shí)間點(diǎn)(10min,20min,30min,40min和1h)，搜集消化液，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。消化下來的細(xì)胞數(shù)目除以材料中粘附的細(xì)胞總數(shù)可計(jì)算出細(xì)胞消化效率。

4、體外細(xì)胞增殖測(cè)試：細(xì)胞增殖通過噻唑藍(lán)(mtt)法測(cè)定。明膠海綿的細(xì)胞接種方法如上所述。每個(gè)海綿接種1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞，然后放置的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。每天用倒置顯微鏡(olympusckx41，日本)觀察細(xì)胞的生長情況。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)(0d，3d，6d，9d，12d，15d)，取出含有細(xì)胞的海綿材料，pbs洗三倍。加0.1％膠原酶ⅰ，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞30分鐘，收集消化液，低速離心后用pbs清洗，然后再次離心。細(xì)胞沉淀用800μl高糖dmem加80μlmtt溶液(5mg/ml溶解于pbs)重新懸浮，并轉(zhuǎn)移到24孔板，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h。棄孵育液，每孔添加400μldmso，溶解紫色結(jié)晶后用用酶標(biāo)儀(biotekelx800,，美國)測(cè)量該溶液的吸光度。檢測(cè)波長490nm，參比波長630nm。

5、細(xì)胞活死狀態(tài)檢測(cè)：adscs在不同的明膠海綿支架材料中的活死狀態(tài)采用live/dead染色法的檢測(cè)。如上所述制備含有細(xì)胞/海綿復(fù)合物。經(jīng)過兩周的培養(yǎng)，將含細(xì)胞的海綿在無菌pbs中沖洗，并在無菌超凈臺(tái)中用手術(shù)刀沿著海綿的橫切面，以大約1mm間隔切割，制成細(xì)胞/支架薄片。將切片浸泡在含有4μm鈣黃綠素-am(sigma)和4μm碘化丙啶(sigma)的溶液中.，于37℃孵育半個(gè)小時(shí)。孵育后，樣品清洗兩次，在倒置熒光顯微鏡下觀察(xds30，舜宇，中國)和拍照。

6、掃描電鏡形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)：為了研究細(xì)胞在支架上的粘附狀態(tài)，對(duì)于培養(yǎng)兩周后的細(xì)胞支架用鑷子和手術(shù)刀進(jìn)行切片，取材料中間具有代表性的樣本進(jìn)行掃描電鏡觀察。樣品用pbs洗滌，在室溫下用2.5％戊二醛固定2小時(shí)。梯度酒精脫水(10-100％)，真空干燥過夜。在觀察前，所有標(biāo)本均噴涂金粉，掃描電鏡(日立s3400+edx、日本)觀察，加速電壓設(shè)置為15kv。

二、試驗(yàn)結(jié)果

1、mtg材料接種后，傷口無炎癥反應(yīng)。傷口愈合良好，將大鼠處死，在植入位點(diǎn)周圍剪開皮膚，發(fā)現(xiàn)材料位于皮下和肌肉層之間的結(jié)締組織當(dāng)中，mtg材料形成的結(jié)締組織包裹層。囊狀的植入材料與結(jié)締組織形成緊密的連接結(jié)構(gòu)，剪取囊狀的植入材料及其附著的皮膚，在體視顯微鏡下觀察到一些包裹層上還有毛細(xì)血管生成。如圖4所示。原先切割為長方體的植入材料，在體內(nèi)植入1個(gè)月后已經(jīng)出現(xiàn)體積縮小，少了棱角，變得圓潤。這是體內(nèi)材料出現(xiàn)了一定程度的降解造成的。一個(gè)月后，mtg材料剩余體積為27.73±2.68％。mtg材料的包裹層厚度小，包裹層厚度為0.19±0.16mm。植入物的剖面觀察：將植入的材料沿著橫截面切開后觀察材料的形貌。mtg材料呈現(xiàn)肉色。血管網(wǎng)絡(luò)的生成：mtg材料的包裹層中有一些毛細(xì)血管，有些毛細(xì)血管還深入到材料邊緣，顯示了這個(gè)材料的非常好的相容性。能夠形成毛細(xì)血管血供。細(xì)胞浸潤分析(he染色)：mtg材料的周圍發(fā)生了降解，并出現(xiàn)了一些細(xì)胞，說明這些包裹層上的細(xì)胞開始滲入到這個(gè)材料中，形成了細(xì)胞層，但是在材料內(nèi)部并沒有出現(xiàn)細(xì)胞，說明植入的時(shí)間還未足以達(dá)到形成新的組織。如圖5所示。

2、細(xì)胞接種效率：細(xì)胞在材料表面粘附以后，會(huì)根據(jù)材料表面的形狀和特征攀爬和遷徙，并通過細(xì)胞增殖形成不同的聚落。所以經(jīng)過兩周的培養(yǎng)以后，細(xì)胞在材料上的分布和生長情況會(huì)發(fā)生變化，對(duì)于孔隙大的材料，細(xì)胞能夠侵入到材料內(nèi)部生長，對(duì)于比較致密的材料則只能在表面生長，而隨著時(shí)間的推移，逐漸滲透到材料內(nèi)部生長。mtg材料的細(xì)胞接種效率分別為84.08±2.79％。

3、細(xì)胞消化效率：將細(xì)胞從支架材料中消化下來,有利于做進(jìn)一步的細(xì)胞操作和分析，包括細(xì)胞傳代、細(xì)胞生長測(cè)試、細(xì)胞的基因表型測(cè)試。在二維培養(yǎng)皿表面上消化細(xì)胞常使用0.25％胰蛋白酶消化液，消化時(shí)間一般在2-5分鐘，但是，生長在三維支架材料中的細(xì)胞往往需要更長的消化時(shí)間才能從材料表面脫落，而胰蛋白酶消化液作用時(shí)間過長會(huì)降低細(xì)胞成活率。這里我們采用0.1％的膠原酶對(duì)支架材料中的細(xì)胞進(jìn)行消化，對(duì)消化下來的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞消化效率。消化時(shí)間在半個(gè)小時(shí)的時(shí)候，mtg材料細(xì)胞存活效率基本在90％以上，如果再增加消化時(shí)間，消化效率不再有明顯的變化。因此半個(gè)小時(shí)的消化時(shí)間被后續(xù)實(shí)驗(yàn)所采用。如圖6所示。

4、通過mtt細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)了解這些材料對(duì)細(xì)胞生長的影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，mtg材料中細(xì)胞生長較快，在各個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)都有較高的生長率。這些實(shí)驗(yàn)總體來說，這些材料都有比較好的細(xì)胞相容性，因?yàn)槭撬劳龅募?xì)胞非常少，我們認(rèn)為如果隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞可能還會(huì)有一個(gè)繼續(xù)上升的趨勢(shì)，如圖7所示。

5、從細(xì)胞活死染色結(jié)果表明，mtg海綿支架有比較好的細(xì)胞相容性?；罴?xì)胞多，死亡的細(xì)胞比較少。mtg材料上面細(xì)胞的分布比較均勻，細(xì)胞存活率較高，數(shù)量也較多。mtg材料著色呈現(xiàn)出暗綠色，如圖8所示。

6、我們對(duì)細(xì)胞在mtg明膠海綿材料上的生長狀態(tài)做了掃描電鏡檢測(cè)，經(jīng)初步觀察，可以看到細(xì)胞能夠比較好的粘附在材料表面，在有些地方還形成了細(xì)胞聚落，細(xì)胞之間相互連接。表明了這個(gè)材料有良好的細(xì)胞相容性。細(xì)胞為偽足完全貼在材料表面。如圖9所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明具有良好的細(xì)胞相容性和體內(nèi)生物相容性。

綜上，本發(fā)明海綿支架具有如下性能：1)無細(xì)胞毒性；2)物理特性綜合性能優(yōu)良，具有較好的孔隙率、抗壓模量和抗降解能力；3)良好的細(xì)胞相容性，細(xì)胞能在支架中很好的生長；4)良好的體內(nèi)生物相容性，將支架植入體內(nèi)，形成的材料包裹層薄，外包裹層上有毛細(xì)血管的形成，有利于新生組織的生長。可作為組織工程支架、臨床止血海綿、藥物緩釋載體等材料，用于細(xì)胞和組織工程應(yīng)用中，具有廣闊的前景。