本發(fā)明涉及醫(yī)藥材料領域，特別是涉及氣管內創(chuàng)面修復用半流動態(tài)溫敏水凝膠的制備方法。

背景技術：

隨著微創(chuàng)外科技術的發(fā)展,經(jīng)氣管鏡腔內治療已成為氣管內病變的重要治療方法，但會不可避免地造成氣管內創(chuàng)面，且創(chuàng)面愈合時間和質量與治療效果密切相關。此外，機械性損傷、燒灼傷、氣管插管等均易造成氣管內一定程度的損傷，形成氣管內創(chuàng)面，在其愈合過程中易發(fā)生氣管瘢痕性狹窄，嚴重影響患者生活質量乃至威脅患者生命。氣管狹窄瘢痕以成纖維細胞過度增生、細胞外基質過度沉積和成分改變?yōu)槠洳±硖卣?本質上是一種增生性瘢痕,往往引起外觀畸形或組織功能障礙，治療方法主要有介入治療、外科手術治療和藥物治療等，常用的方法包括支氣管鏡或支撐喉鏡下激光、氬氣刀、冷凍等瘢痕切除術、球囊擴張成形術，以及各種支架置入術等。這些治療方法可在氣管內造成新的損傷，易出現(xiàn)再狹窄。因此，使氣管內創(chuàng)面正常再生修復，防止疤痕過度增生，預防氣管瘢痕性狹窄的發(fā)生是目前研究的重點和難點。

殼聚糖有止血、止痛、調節(jié)巨噬細胞和成纖維細胞生長及廣泛的抑菌作用，不同濃度、不同來源的殼聚糖及其衍生物一方面促進成纖維細胞的增殖，有利于新生修復組織的結構重塑和構建，能增強或恢復傷口愈合后的力學強度；另一方面抑制成纖維細胞的過度繁殖，防止疤痕增生，利于外觀和功能的恢復，使傷口愈合質量提高，近年來,人們開始以殼聚糖為原料制備智能水凝膠，通過不同制備途徑，可得到各種類型溫敏水凝膠。殼聚糖溫敏水凝膠制備條件溫和，具有原位成膠的特點，并有生物黏附、生物相容和可生物降解等特性，廣泛應用于組織工程修復和藥物釋放載體的研究中。

溫敏水凝膠是指隨著外界溫度變化而產(chǎn)生刺激響應性的智能水凝膠，其響應性依賴于溫度的變化，有臨界相轉變溫度，優(yōu)點在于可以在液態(tài)下復合細胞、治療性的藥物、生長因子等，以內窺鏡或者注射器等微創(chuàng)的方式將其植入體內并且在原位形成凝膠。

授權公告號cn104984401a（申請?zhí)?01510434128.3）的中國專利文獻公開了一種溫敏水凝膠/磷酸三鈣材料的制備方法，該方法步驟流程包括將溫敏水凝膠在低溫下溶解、按一定比例加入磷酸三鈣粉體、混合材料隨意塑形成任何想要的形狀。公布號cn103004757a（申請?zhí)?01210571657.4）的中國專利文獻公開了一種多孔溫敏水凝膠緩釋劑及其制備方法。發(fā)明以聚n-異丙基丙烯酰胺多孔溫敏水凝膠為載體，在凝膠內負載上藥物，利用聚n-異丙基丙烯酰胺的溫度敏感特性，來實現(xiàn)對藥物的控制釋放。當溫度低于水凝膠的lcst時，藥物釋放很慢，而當溫度高于其lcst時，釋放速率加快。

近年來圍繞殼聚糖及其衍生物溫敏水凝膠的研究逐年增多,在再生醫(yī)學和組織工程學應用方面，如注射填充不規(guī)則形狀的腔隙或常規(guī)器械難以到達的部位，作為藥物載體和基因載體等，在外傷敷料、婦科疾病、口腔及牙周疾病、血管栓塞載體的應用等方面做了大量有意義的研究工作，但有關氣管內創(chuàng)面修復用功能復合溫敏水凝膠的研究鮮有報道，本發(fā)明構建氣管內創(chuàng)面修復用功能復合溫敏水凝膠，適合氣管腔內特殊環(huán)境的治療要求，可誘導氣管內創(chuàng)面再生修復、預防創(chuàng)面感染、抑制疤痕增生、提高愈合質量、預防氣管瘢痕性狹窄的發(fā)生，對氣管內創(chuàng)面修復及氣管內病變的腔內治療有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的問題，本發(fā)明的目的是提供一種氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝的制備方法，呈半流動狀態(tài)，適合氣管腔內特殊環(huán)境的治療要求，具有良好的抑菌作用及生物相容性，無纖毛毒性，可誘導氣管內創(chuàng)面再生修復、預防創(chuàng)面感染、抑制疤痕增生、提高愈合質量、預防氣管瘢痕性狹窄的發(fā)生，在氣管內膜損傷局部治療方面，有著良好的研究應用前景。

本發(fā)明的技術方案是：

氣管內膜損傷修復用半流動狀態(tài)溫敏水凝膠制備方法，呈半流動狀態(tài)，以白芨水提物、殼聚糖、甘油磷酸鈉為主要原料，具體步驟如下：

（1）取白芨洗凈，用紗布包好放于蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱，然后過濾除去濾渣，得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖粉碎研磨5-15分鐘，置于0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入恒溫水浴鍋中加熱，待溶液呈半流動狀態(tài)時，即形成溫敏水凝膠。

所述的溫敏水凝膠的制備方法，取下列重量份的原料，殼聚糖0.1-0.19，白芨水提物0.25-1.0，甘油磷酸鈉0.5-1.5（優(yōu)選為殼聚糖0.15，白芨水提物0.25，甘油磷酸鈉1.0）。

所述的溫敏水凝膠的制備方法，步驟（1）蒸餾水的用量為白芨重量的10-40倍（優(yōu)選為蒸餾水的用量為白芨重量的20倍）。

所述的溫敏水凝膠的制備方法，步驟（1）小火繼續(xù)加熱25-35分鐘（優(yōu)選的：小火繼續(xù)加熱30分鐘）。

所述的溫敏水凝膠的制備方法，步驟（2）冰乙酸水溶液的用量為殼聚糖質量的100倍。

所述的溫敏水凝膠的制備方法，步驟（3）恒溫水浴鍋的溫度為34-40℃（優(yōu)選的：恒溫水浴鍋的溫度為37℃）。

本發(fā)明提供的氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法科學，工藝簡單，所得產(chǎn)品同時兼具了殼聚糖和白芨的特性，具有良好的抑菌作用及良好的生物相容性以及無纖毛毒性在氣管內膜損傷局部治療方面，有著良好的研究應用前景。

附圖說明

圖1為纖毛毒性試驗的觀察結果；

圖2為不同濃度的溫敏水凝膠對nih-3t3細胞存活率的影響結果；注：a1；a2;a3;a4;a5;a6依次代表稀釋倍數(shù)，分別為是0倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍，b.c.d.同上；柱狀圖橫縱坐標分別為稀釋倍數(shù)和細胞相對增值率；

圖3：a所得溫敏水凝膠相轉變前;b所得溫敏水凝膠相轉變后。

具體實施方式

下面結合實施例和實驗例詳細說明本發(fā)明的技術方案，但保護范圍不限于此。

本申請所用材料均可從市場購買，其中白芨購自聊城市中醫(yī)院；殼聚糖購自浙江金殼生物化學有限公司，批號為20140318c；甘油磷酸鈉為國產(chǎn)分析純，購自湖北遠成賽創(chuàng)科技有限公司。

實施例1氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱25分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.1g粉碎研磨5分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.25ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入34℃恒溫水浴鍋中加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例2氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱25分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.15g粉碎研磨15分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入40℃恒溫水浴鍋中加熱加熱2分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例3氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.19g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成白芨殼聚糖基溫敏水凝膠。

實施例4氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨2g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.12g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài).即形成溫敏水凝膠。

實施例5氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.2g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例6氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨8g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.15g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例7氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.16g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉0.5ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例8氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.14g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例9氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱30分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.17g粉碎研磨10分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液0.50ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.5ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例10氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱35分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.18g粉碎研磨15分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入35℃恒溫水浴鍋中加熱加熱6分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例11氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱35分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.18g粉碎研磨15分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入37℃恒溫水浴鍋中加熱加熱4分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

實施例12氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的制備方法，步驟如下：

（1）取白芨4g洗凈，用紗布包好放于80ml蒸餾水中浸泡40分鐘，用電阻爐功率調制550w,大火進行性加熱30分鐘，后用400w功率小火繼續(xù)加熱35分鐘，然后過濾除去濾渣得白芨提取液備用；

（2）取殼聚糖0.12g粉碎研磨15分鐘，置于10ml，0.1mol/l的冰乙酸中充分溶解后，加入白芨提取液1.0ml，用ph計測量其ph值，逐滴添加56%的甘油磷酸鈉1.0ml，并不斷攪拌，用飽和的磷酸氫鈉溶液調節(jié)ph至6.96；

（3）將上述配置好的殼聚糖溶液置于容器中，放入39℃恒溫水浴鍋中加熱加熱3分鐘，呈半流動狀態(tài)，即形成溫敏水凝膠。

試驗例1本發(fā)明所得氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的抑菌性能測定：

設置四組，其中a、b、c組分別對應實施例1-3中的氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠，d組為不含白芨的殼聚糖溫敏水凝膠；

在實驗條件下，將保存的大腸桿菌進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基長出單個菌落后，用接種環(huán)挑取單個菌落制備大腸桿菌的菌懸液。無菌條件下，在90mm的培養(yǎng)基中加入適量的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，凝固后向培養(yǎng)基加入0.1ml菌懸液(10⁷cfu/ml)，用涂布器涂布均勻。選取直徑0.4cm打孔器，對凝膠樣品進行打孔，制得直徑0.4cm的圓柱體。在已經(jīng)劃好區(qū)域的培養(yǎng)基上，依次放置a、b、c、d，四種待測樣品，待培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，測量各個樣品抑菌圈直徑大小并記錄數(shù)據(jù)。以同樣的方法測試樣品對金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、綠膿桿菌的抑菌效果，同時測量各個樣品抑菌圈直徑大小并記錄數(shù)據(jù)。

試驗結果如下表所示：

表1：白芨殼聚糖基溫敏水凝膠抑菌試驗

通過表格1中實驗組（abc組）與空白組（d組）對照，明顯看出白芨殼聚糖基溫敏水凝膠對于四種菌具有較好的接觸抑菌的作用，各樣品與培養(yǎng)基的接觸面均沒有細菌的生長。同時發(fā)現(xiàn)隨著白芨含量的增加，抑菌圈的直徑明顯的增加，可以體現(xiàn)抑菌的作用效果明顯增強。

試驗例2本發(fā)明所得氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的纖毛毒性實驗：

2.1蟾蜍上顎粘膜觀察

本試驗中，選用無纖毛毒性的生理鹽水為陰性對照樣品，有嚴重纖毛毒性的去氧膽酸鈉為陽性對照品，分別評價不同濃度的試驗樣品的纖毛毒性；共分為5組，分別為a組（實施例1的水凝膠），b組（實施例2的水凝膠），c組（實施例3的水凝膠），d組（生理鹽水組），e組（1%去氧膽酸鈉組）。

將30只蟾蜍平均分成5組，將蟾蜍仰臥固定于蛙板上,使口腔張開,以止血鉗牽拉,防止閉合和吞咽。分別將0.5ml水凝膠,0.5ml去氧膽酸鈉應用到蟾蜍上顎部位,以生理鹽水0.5ml作為對照,保留30min。用眼科小剪刀從口腔上剪下3-4mm²粘膜,用生理鹽水將表面的血液和粘液漂洗干凈,并將其平鋪于載玻片上,滴加生理鹽水,輕輕蓋上蓋玻片,于10*40倍倒置顯微鏡下觀察黏膜形態(tài)。

試驗結果如附圖1所示：

取下粘膜后立即在顯微鏡下觀察，由圖片1結果顯示可知，生理鹽水組的粘膜表面和纖毛清晰完整，纖毛活動活躍，呈流水狀擺動;1%去氧膽酸鈉組纖毛停止擺動，粘膜受損嚴重，表面雜亂，纖毛基本脫落，只見裸露基部，周圍可見很多脫落細胞;其他藥物組粘膜和纖毛較完整清晰，無脫落等異?，F(xiàn)象，纖毛運動較活躍。

2.2纖毛持續(xù)運動時間和持續(xù)運動百分率的測定

將黏膜置于預先用少量蒸餾水飽和的層析缸中，密閉，環(huán)境溫度25℃，此后每隔一定的時間取出上顎標本于圖像分析系統(tǒng)下觀察，若蟾蜍纖毛繼續(xù)運動則放回層析缸中，直至纖毛運動停止。同時記錄從給藥開始至纖毛停止運動的時間，即蟾蜍纖毛的擺動時間（persistentvibrationduration,pvd）。以各給藥組的pvd除以生理鹽水對照組的pvd即得到纖毛持續(xù)運動的百分率（percentageofpersistentvibration,ppv)。百分率越低表示藥物對于纖毛的毒性越大，百分率越高則表示藥物對纖毛的毒性越小。

試驗結果如表2所示：

表2各組纖毛持續(xù)運動時間和持續(xù)運動百分率（x±s，n=6）

由表2可知，與生理鹽水組比較，去氧膽酸鈉組纖毛持續(xù)運動時間短于生理鹽水組，有極顯著性差異。同時給藥組的纖毛持續(xù)運動時間也短于生理鹽水組，但是無顯著性差異，可認為給予的藥物對纖毛運動無影響。用生理鹽水沖洗粘膜后，除去氧膽酸鈉組的纖毛之外，其余藥物組纖毛均恢復擺動。此結果提示氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的對蟾蜍口腔黏膜纖毛運動基本沒影響，因此水凝膠對蟾蜍纖毛毒性符合生物材料的安全評價標準。

2.3實驗樣品纖毛輸送速率的測定

分組、給藥同實驗2.1的方法。給藥5min后在上腭靠前方部位用毛細管放置甲基紅顆粒，此時顆粒將沿黏膜表面緩慢向咽部移動留下紅色軌跡，用秒表記錄顆粒移動1cm所需時間，每只蟾蜍測定3次，取均值后計算纖毛輸送速率。

上述實驗的統(tǒng)計學處理方法，計量資料數(shù)據(jù)以`x±s表示，應用spss19.0系統(tǒng)分析軟件進行分析，采用單因素方差分析及snk檢驗，p＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

試驗結果如表3所示：

表3對纖毛的輸送速率的影響（x±s，n=6）

如表3所示，所示各給藥組與生理鹽水組纖毛輸送速率比較，a、b、c組（凝膠組）與生理鹽水對照組無顯著差異（p＜0.05），其余1%去氧膽酸鈉組（e組）與生理鹽水組差異有顯著性（p>0.05），表明白芨殼聚糖基溫敏水凝膠對于纖毛的傳輸速率基本沒有影響。

試驗例3本發(fā)明所得氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠的細胞相容性試驗：

3.1不同白芨含量的殼聚糖基溫敏水凝膠的48h的制備

各種樣品水凝膠分別按照樣品:細胞培養(yǎng)液=0.2g:1ml的比例予以浸泡48h得試驗樣品的浸提液，0.2um的濾膜推慮除菌，將推慮好的試驗樣品進行梯度稀釋，依次是0倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍的樣品提取液。

3.2細胞的培養(yǎng)

小鼠成纖維細胞（nih-3t3），細胞培養(yǎng)在添加,15％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：5％co2、37℃、飽和濕度co2培養(yǎng)箱中，采用倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

3.3細胞存活率的測定

將處于對數(shù)生長期的細胞按4000個/孔種植到96孔板，37℃、5％co2培養(yǎng)，待nih-3t3細胞長到80％以上，除正常組外所有處理組，分別經(jīng)不同濃度的分別處理細胞24h后，取出96孔板，甩出細胞培養(yǎng)液；每孔添加100ul,10％三氯乙酸（tca）放置4℃恒溫冰箱固定1h；甩出tca，用超凈水對每孔側壁沖洗5遍，放烘箱37℃烘干；每孔添加50ul的0.4％srb染料并放置搖床5min,吸出染料；1％的乙酸沖洗5遍并放置烘箱烘干；每孔添加100ul,100mmol/ltris堿溶解；492nm處測od吸光值。計算細胞的相對增值率（relativegrowthrate,rgr）*100％。

根據(jù)美國藥典中細胞毒性的六級標準評價材料的毒性大小，細胞毒性反應分級如下：

表4細胞相對增值率與細胞毒性分級的關系

毒性的判定標準:0級和ⅰ級判為合格，ⅱ級者結合形態(tài)分析綜合評價，?！ぜ壵吲袨椴缓细?。

采用spss19.0軟件包統(tǒng)計分析,計量資料以“`x±s”表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。^*p＜0.05為差異顯著，^**p＜0.01為差異極顯著。細胞存活率(％)=(處理組od值／對照組od值)x100％，數(shù)據(jù)采用采用spssvl1.5軟件包統(tǒng)計分析。

試驗結果如附圖2所示：

不同濃度的溫敏水凝膠對nih-3t3細胞存活率的影響如附圖2所示，不同濃度稀釋倍數(shù)的白芨殼聚糖基溫敏水凝膠復合物以及殼聚糖溫敏水凝膠的浸提液對于nih-3t3細胞都沒有表現(xiàn)出細胞毒性。水凝膠提取液稀釋50倍，100倍對于nih-3t3細胞的增值有著明顯的促進作用（p＜0.01)。浸提液稀釋5倍、10倍、20倍，對于細胞的生長基本沒有影響。浸提液稀釋0倍，細胞的增值率相對降低，但是對于nih-3t3細胞造成不了毒性作用。因此水凝膠浸提液對于nih-3t3細胞毒性符合生物材料的安全評價標準。

綜上可知，本發(fā)明氣管內創(chuàng)面修復用溫敏水凝膠對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎球菌均有較好的接觸抑菌作用，并且隨著水凝膠中白芨含量的提高抑菌效果也隨之增強，同時與殼聚糖溫敏水凝膠相比其抑菌作用更強；白芨殼聚糖基溫敏水凝膠和殼聚糖溫敏水凝膠24h浸提液對nih-3t3細胞均沒有毒性并且有良好的細胞相容性；白芨殼聚糖基溫敏水凝膠的對蟾蜍口腔黏膜纖毛運動基本沒影響。因此該類溫敏水凝膠可促進氣管內膜損傷的修復，具有良好的抑菌作用及生物相容性，無纖毛毒性，可誘導氣管內創(chuàng)面再生修復、預防創(chuàng)面感染、抑制疤痕增生、提高愈合質量、預防氣管瘢痕性狹窄的發(fā)生，可用于氣管內創(chuàng)面等內膜損傷的局部治療，有著良好的研究應用前景。

且圖3為所得溫敏水凝膠相轉變前后的狀態(tài)圖，其中a為所得溫敏水凝膠相轉變前；b為所得溫敏水凝膠相轉變后，由此可看出該溫敏水凝膠可隨溫度的變化，發(fā)生相變，且常溫狀態(tài)下為流動狀態(tài)，體溫狀態(tài)下為半流動狀態(tài)。

應當指出的是，具體實施方式只是本發(fā)明比較有代表性的例子，顯然本發(fā)明的技術方案不限于上述實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員，以本發(fā)明所明確公開的或根據(jù)文件的書面描述毫無異議的得到的，均應認為是本專利所要保護的范圍。