本發(fā)明屬于中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃芪生脈飲防護(hù)放射性心臟損傷。
背景技術(shù)：
胸腹部腫瘤放射治療時(shí)，位于縱隔的心臟不可避免受到照射而引起的心臟損傷，稱為放射性心臟疾病(radiation-inducedheartdisease，rihd)。rihd是胸部腫瘤放療后最常見(jiàn)的良性致死原因，其發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，該病逐漸成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。rihd的主要病理改變是纖維化，心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts，cfs)是心臟纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，可合成分泌tgf-β1和膠原蛋白，二者直接參與纖維化病理發(fā)展過(guò)程，現(xiàn)普遍認(rèn)為“纖維化”是細(xì)胞因子表達(dá)失衡的多因素復(fù)雜疾病?？傮w來(lái)說(shuō)，rihd的發(fā)病機(jī)理不清，臨床尚無(wú)可靠治療措施，通常以預(yù)防為主，按照循證醫(yī)學(xué)“有證查證用證，無(wú)證創(chuàng)證用證”的觀點(diǎn)分析，目前rihd的臨床防治處于“無(wú)證”或“少證”階段，這就要求在“查證”基礎(chǔ)上進(jìn)行“創(chuàng)證用證”實(shí)踐，深入研究放射性心臟纖維化損傷的病理學(xué)分子機(jī)制，為其臨床防治尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn)，這具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。
中藥在腫瘤治療方面減毒增效的作用，是一個(gè)多方面的復(fù)雜過(guò)程。中醫(yī)學(xué)講辨證論治，就是通過(guò)辨證治療來(lái)平衡人體陰陽(yáng)，恢復(fù)臟腑功能，提高機(jī)體的免疫功能，使“正氣內(nèi)存，邪不可干”。正氣，即人體正常的免疫功能，現(xiàn)代藥理研究表明，活血化瘀、清熱解毒、養(yǎng)陰生津、解毒散結(jié)的中藥，均具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)辨正用藥能平衡人體陰陽(yáng)，提高免疫功能改善癥狀。中藥應(yīng)用于腫瘤治療減毒增效的總原則是“扶正祛邪”，在此基礎(chǔ)上可有補(bǔ)氣補(bǔ)血、補(bǔ)陰補(bǔ)陽(yáng)、清熱解毒、理氣行氣、活血化瘀、去濕化痰、軟堅(jiān)散結(jié)、祛腐生新等治療原則。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了黃芪生脈飲防護(hù)放射性心臟損傷。
本發(fā)明另外提供了黃芪生脈飲制備方法：黃芪加水煎煮后過(guò)濾，濾液濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材1～2g，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75％，第二次為85％，回收乙醇并濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材10g，輔以野菊花、山楂、萊服子、甘草、枸杞，經(jīng)粉碎、加水浸泡、萃取、濃縮、回收乙醇后，加入蜂蜜、異麥芽糖、葡萄酒酵母菌種進(jìn)行初發(fā)酵，最后經(jīng)過(guò)濾、沉淀、殺菌、灌裝而成。
進(jìn)一步，黃芪生脈飲中，黃芪60-72％、野菊花5-12％、山楂5-12％、牛黃酸2-6％、萊服子1-5％、甘草2-7％、枸杞1-5％、蜂蜜2-10％、麥芽1-8％、異麥芽糖1-10％、葡萄酒酵母菌種3-7％。
本發(fā)明的有益效果是黃芪生脈飲有效改善受照射大鼠的心功能，降低心臟損傷標(biāo)志性分子肌鈣蛋白及肌酸激酶同工酶(ck-mb)的血清水平，有效防護(hù)受照射心臟，其抗放射性心臟纖維化損傷的分子機(jī)制可能主要相關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)、重構(gòu)酶、炎性細(xì)胞因子/趨化因子和tgf-β信號(hào)通路。該中藥復(fù)方對(duì)放射性心臟損傷有良好治療作用，延緩甚至抑制纖維化的進(jìn)程。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
黃芪味甘、性微溫，有補(bǔ)氣固表、利尿消腫、托毒排膿、斂瘡生肌等功效，以往對(duì)黃芪心血管作用的研究主要集中在強(qiáng)心和保護(hù)心肌缺血/再灌損傷等方面，其保護(hù)心臟的藥理學(xué)機(jī)制包括：抗氧化應(yīng)激，改善微循環(huán)，擴(kuò)張血管，增強(qiáng)心肌血流量，減少心肌細(xì)胞內(nèi)鈣蓄積等。近幾年來(lái)黃芪在防治器官纖維化的研究中顯示出良好的療效，目前其抗纖維化的研究主要集中于肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化等方面。
生脈飲是由古方生脈散演變而來(lái)，生脈散始見(jiàn)于唐·孫思邈《千金要方》，由人參、麥冬、五味子組成，具有益氣滋陰，斂汗生津，補(bǔ)肺養(yǎng)心的功效，多用于治療氣陰兩虛，心悸氣短的冠心病及心肌梗塞。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生脈飲具有強(qiáng)心，改善周?chē)貉h(huán)，調(diào)節(jié)和促進(jìn)機(jī)體活動(dòng)能力，增強(qiáng)新陳代謝的功能，因此生脈飲應(yīng)用在腫瘤放療時(shí)可有助于增強(qiáng)身體機(jī)能對(duì)抗放療副反應(yīng)，其護(hù)心作用必將能改善放射性心臟損傷。有文獻(xiàn)報(bào)告生脈注射液可有效降低胸部腫瘤放療時(shí)血清心肌酶學(xué)異常的發(fā)生率而保護(hù)心臟，生脈飲還有明確的抗放射性肺炎、肺纖維化的作用。
根據(jù)rihd病機(jī)為射線——熱毒之邪損傷人體正氣和陰血，引起熱積血淤，氣陰兩傷，氣血凝滯，致纖維化，我們?cè)谏}飲基礎(chǔ)方上增加甘肅道地藥材黃芪，功效較生脈飲補(bǔ)氣之力強(qiáng)。黃芪生脈飲方中黃芪能補(bǔ)胸中之大氣，使氣旺則血旺，氣旺則血行；人參大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津安神；麥冬養(yǎng)陰清熱生津，潤(rùn)肺清心；五味子收斂心氣，使心氣不致過(guò)散。全方共奏益氣養(yǎng)陰、滋陰養(yǎng)血之功。黃芪生脈飲制備：黃芪加水煎煮后過(guò)濾，濾液濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材1～2g，用乙醇沉淀處理二次，第一次溶液中含乙醇量為75％，第二次為85％，回收乙醇并濃縮至每1ml相當(dāng)于原藥材10g，輔以野菊花、山楂、萊服子、甘草、枸杞，經(jīng)粉碎、加水浸泡、萃取、濃縮、回收乙醇后，加入蜂蜜、異麥芽糖、葡萄酒酵母菌種進(jìn)行初發(fā)酵，最后經(jīng)過(guò)濾、沉淀、殺菌、灌裝而成。其中黃芪60-72％、野菊花5-12％、山楂5-12％、牛黃酸2-6％、萊服子1-5％、甘草2-7％、枸杞1-5％、蜂蜜2-10％、麥芽1-8％、異麥芽糖1-10％、葡萄酒酵母菌種3-7％。
本專利基于“射線損傷人體正氣和陰血，致氣陰兩傷，氣血凝滯”的中醫(yī)理論，在前期細(xì)胞水平“x線促心肌成纖維細(xì)胞(cfs)纖維損傷機(jī)制研究及黃芪干預(yù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從“益氣養(yǎng)陰，滋陰養(yǎng)血”原則出發(fā)，采用黃芪生脈飲干預(yù)rihd大鼠模型，以x線照射引起大鼠心臟纖維化病理改變?nèi)胧?，從大鼠心臟病理形態(tài)學(xué)、心功能變化、心肌酶學(xué)等方面探討其藥效，并應(yīng)用rt-pcr技術(shù)、蛋白免疫印記技術(shù)在動(dòng)物整體水平上檢測(cè)分析前期細(xì)胞水平上篩選出的金屬基質(zhì)蛋白酶系統(tǒng)和smads相關(guān)分子，深入探討tgf-β1信號(hào)活化機(jī)制在x線促心臟損傷中的作用，闡明黃芪生脈飲防治rihd的藥理機(jī)制。
(1)通過(guò)檢測(cè)大鼠心功能、心肌酶學(xué)、組織病理學(xué)改變及纖維化主要效應(yīng)分子tgf-β1、i/iii型膠原的表達(dá)，觀察x線對(duì)大鼠心臟的影響，構(gòu)建rihd纖維化病變的大鼠模型，并研究黃芪生脈飲對(duì)該模型的作用明確其藥效；
(2)在動(dòng)物整體水平上應(yīng)用rt-pcr和westernblotting技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞水平上rt2profilertmpcrarray所篩選的smads分子(smad2、smad3、smad4、smad7等)和金屬基質(zhì)蛋白酶系統(tǒng)(mmp14、timp1等)的差異表達(dá)，闡明放射性心臟損傷中smads分子和金屬基質(zhì)蛋白酶系統(tǒng)對(duì)“整合素介導(dǎo)的tgf-β1”的活化及調(diào)節(jié)，探討rihd病理分子機(jī)制。
(3)通過(guò)黃芪生脈飲干預(yù)rihd大鼠模型的研究，探討該藥方防治rihd的藥理作用機(jī)制，印證“益氣養(yǎng)陰，滋陰養(yǎng)血”防治rihd的有效性與科學(xué)性，為放射性心臟損傷臨床干預(yù)提供中醫(yī)新方藥的基礎(chǔ)研究支持。
實(shí)驗(yàn)方案
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照射造模：照射在省腫瘤醫(yī)院放療室，用醫(yī)用直線加速器(德國(guó)西門(mén)子primus)x射線一次性照射動(dòng)物，按照預(yù)先設(shè)定的輻射劑量完成照射。照射前大鼠需經(jīng)腹腔注射3％戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉，受照射大鼠固定于消毒清潔木板上，暴露胸部。照射結(jié)束后將大鼠置于室溫26-28℃下直至蘇醒，以免麻醉后體溫過(guò)低死亡。
動(dòng)物分組及給藥干預(yù)：spf級(jí)sd大鼠250只(200±20g)，雌雄各半鼠齡4-5月，符合spf級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)體重隨機(jī)分為5組，即：對(duì)照組、照射模型組、黃芪生脈飲高劑量組、中劑量組、低劑量治療組，每組50只。各組分籠飼養(yǎng)。黃芪生脈飲(市售)灌胃劑量按照人臨床給藥劑量折算動(dòng)物給藥劑量為3.1ml/(kg.d)，因此高、中、低劑量組灌胃劑量分別是6.2ml/(kg.d)、3.1ml/(kg.d)、1.6ml/(kg.d)。給藥組大鼠每天灌胃給藥1次或者2次(高劑量組)，連續(xù)灌胃治療12周。同時(shí)對(duì)照組及照射模型組大鼠給予等體積的雙蒸水灌胃。標(biāo)本采集及處理：分別在照射后第1天以及第2、4、8、12周時(shí)，每組各解剖10只大鼠，以12號(hào)大針頭直接從心室采血以備心肌酶檢測(cè)。采血后從大血管根部離斷大鼠心臟，收集大鼠心臟標(biāo)本，分別解剖心房和心室，在心室以及心房各取一小塊厚度≤0.5cm的組織,分別放于1.5ml的凍存管中，速置液氮中，-80℃保存?zhèn)溆?。其余心臟組織放入10％甲醛溶液中固定，24h后取材,取材時(shí)以橫斷面切取多個(gè)切面1.5mm厚心肌組織,放入10％甲醛溶液再固定12h。最后將上述心肌標(biāo)本投入系列濃度乙醇液脫水、浸蠟、石蠟包埋,保存?zhèn)溆谩?/p>
心臟功能評(píng)價(jià)：在上述各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本采集處理前行超聲心動(dòng)圖檢查，麻醉大鼠，褪去前胸部皮毛，取左室短軸觀、胸骨旁左室長(zhǎng)軸觀及心尖四腔觀，以m型超聲模式測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室收縮末期內(nèi)徑(lvesd)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(lvef)和左室短軸縮短率(lvfs)。
心臟損傷評(píng)價(jià)：檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)血清中肌鈣蛋白及肌酸激酶同工酶(isoenzymeofcreatinekinase,ck-mb)水平的變化。分離血清肌鈣蛋白及ck-mb,采用美國(guó)beckmancoulter公司進(jìn)口試劑盒進(jìn)行測(cè)定,儀器為美國(guó)access全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)。
masson染色及心臟組織膠原纖維定量：masson染色是纖維結(jié)締組織特殊染色法：組織浸泡于10％中性甲醛溶液中24-48h,常規(guī)脫水包埋。切片脫蠟后浸于0.5％碘乙醇中10min,以蒸餾水沖洗,再浸于5％硫代硫酸鈉5min,以流水沖洗10min；weigert氏鐵蘇木精染色；麗春紅酸性品紅溶液染色5-10min；蒸餾水稍沖洗；1％磷鉬酸水溶液處理標(biāo)本約5min；直接用苯胺藍(lán)溶液復(fù)染5min；10％冰醋酸處理1min；95％乙醇脫水多次；無(wú)水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固。染色后組織膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色,細(xì)胞核不顯色。心臟組織膠原纖維定量：切片置于顯微圖像分析系統(tǒng)下,以40倍放大觀察,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3張切片,每張切片隨機(jī)選取7個(gè)視野,圈出全部經(jīng)masson藍(lán)染的膠原纖維,測(cè)量各視野中總細(xì)胞面積和膠原纖維面積,計(jì)算公式為v＝100∑ai/∑ai?！芶i為膠原纖維面積總和,∑ai為視野面積總和。計(jì)算各切片中膠原纖維占視野總面積的百分比。
pcrarray是簡(jiǎn)單實(shí)用的檢測(cè)基因表達(dá)的高通量方法。qiagen的pcrarray可以被稱為功能分類芯片或pcr列陣，它結(jié)合了實(shí)時(shí)定量pcr技術(shù)靈敏可靠的優(yōu)勢(shì)以及微陣列技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種基因表達(dá)量的優(yōu)勢(shì)，是分析信號(hào)通路或某生物學(xué)功能相關(guān)基因表達(dá)狀態(tài)的首選工具。pcrarray使用熒光定量pcr的方法在一張96孔板或384孔板上同時(shí)對(duì)某個(gè)信號(hào)通路或某生物學(xué)功能相關(guān)的84個(gè)重要基因的表達(dá)量變化進(jìn)行檢測(cè)，它完全克服了常規(guī)雜交芯片假陽(yáng)性率高及海量數(shù)據(jù)難于有效分析的缺陷，使用方便，只需pcr儀就可進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，且有配套的在線分析程序。主要用于檢測(cè)某信號(hào)通路或某生物學(xué)功能相關(guān)的一系列重要基因的表達(dá)量變化，從而發(fā)現(xiàn)變化比較明顯的標(biāo)志性基因。本實(shí)驗(yàn)選用的pcrarray芯片是纖維化信號(hào)通路的相關(guān)基因芯片，芯片的基因布板情況，96孔內(nèi)包被了纖維化信號(hào)通路的84個(gè)相關(guān)基因的引物。h1-h5孔包含了5個(gè)看家基因(hk1-hk5)，用于芯片數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。h6為基因組dna參照(gdc)，其中固定的引物能特異性的檢測(cè)非轉(zhuǎn)錄的基因組dna重復(fù)片段，從而檢測(cè)樣品中是否存在dna污染。h7到h9是三個(gè)重復(fù)的孔，均為反轉(zhuǎn)錄參照(rtc)，用于檢測(cè)rt反應(yīng)的效率。h10到h12是陽(yáng)性pcr參照(ppc)，反映了pcr反應(yīng)的效率。這些孔中加入了人工合成的dna序列和相應(yīng)的引物對(duì)。兩組重復(fù)的對(duì)照rtc和ppc也可以用于檢測(cè)芯片間和芯片內(nèi)的一致性。pcrarray操作過(guò)程類似rt-pcr。
采用儀器配套的軟件計(jì)算pcr芯片中的每個(gè)基因的循環(huán)閾值(ct值)。最后將這些ct值上傳到pcrarray數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站，網(wǎng)站采用△△ct方法自動(dòng)定量并比較對(duì)應(yīng)的兩個(gè)樣本中同一基因的表達(dá)量變化。通過(guò)分析看家基因(gusb,b2m,hsp90ab1,gapdhandactb)ct值的一致性，確定合適的標(biāo)準(zhǔn)化方法。標(biāo)準(zhǔn)化后每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平取每個(gè)干預(yù)組三個(gè)樣本的平均值。芯片所設(shè)置的對(duì)照，可以檢測(cè)pcr體系中是否存在dna污染，或者是否有影響反轉(zhuǎn)錄或pcr實(shí)驗(yàn)步驟的因素存在。
rt-pcr法檢測(cè)基因表達(dá)：采用trizol試劑抽提總rna，提取的總rna經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度a值，并計(jì)算a260/a280。將所抽提的rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行tgf-β1、i/iii型膠原及前期研究篩選的纖維化靶點(diǎn)分子的實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增。
westernblooting法檢測(cè)蛋白表達(dá)：提取組織蛋白后，依次進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定與變性，sds-page電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光，檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證tgf-β1、i/iii型膠原及前期研究篩選的纖維化靶蛋白。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1動(dòng)物造模劑量篩選
rihd動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇大鼠為造模對(duì)象。按照相關(guān)文獻(xiàn)，動(dòng)物照射劑量從幾gy到二十幾gy不等，照射方式包括全身性照射和動(dòng)物心臟局部照射，不同文獻(xiàn)照射劑量差別巨大可能與照射方式有關(guān)。我們采用多種劑量(0，4，6，8，12，16，18，20，25，30gy)結(jié)合全身和局部?jī)煞N照射方式進(jìn)行動(dòng)物造模方法參數(shù)的篩選，結(jié)果顯示：全身照射劑量16gy時(shí)動(dòng)物全部死亡，低于該劑量的照射，動(dòng)物沒(méi)有死亡；心臟局部照射4—30gy動(dòng)物均全部存活。全身性照射時(shí)多組織器官均受到射線的損傷，動(dòng)物不能耐受，故照射劑量增大動(dòng)物死亡率較高；而應(yīng)用防護(hù)措施只進(jìn)行心臟局部放射時(shí)，動(dòng)物全身受射線影響較小，動(dòng)物可耐受較大照射劑量，由于這種局部照射心臟接受大劑量射線，因此對(duì)心臟的損傷更加顯著。
各劑量照射后12周取材病理觀察顯示心肌細(xì)胞有不同程度的水腫、透明樣變及脂肪變性，病灶為斑片狀的纖維化病灶和壞死灶，散在分布，間質(zhì)和血管周?chē)霈F(xiàn)纖維增生。masson染色后心肌組織膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色,細(xì)胞核不顯色。顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行心臟組織膠原纖維定量，照射組膠原纖維占視野總面積的百分比對(duì)比0gy組有不同程度的增多，局部大劑量照射尤為顯著，其中30gy組增多80％。電鏡下可見(jiàn)30gy組心肌細(xì)胞排列紊亂，肌纖維斷裂、萎縮，細(xì)胞核變形，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞膜下有高密度顆粒沉積，膜的連續(xù)性有中斷等。鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇30gy心臟局部照射作為rihd大鼠造模方法。
研究還顯示30gy心臟局部照射明顯抑制大鼠心功能，動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示左室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室收縮末期內(nèi)徑(lvesd)、左室射血分?jǐn)?shù)(lvef)和左室短軸縮短率(lvfs)對(duì)比對(duì)照組均顯著降低，分別降低了32％，46％，51％和43％。心臟損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)血清肌鈣蛋白及肌酸激酶同工酶(ck-mb)在模型組也顯著升高，對(duì)比對(duì)照組升高了64％和72％。
綜上所述，30gy心臟局部照射引起大鼠組織病理學(xué)改變，組織炎性滲出明顯，心肌膠原纖維合成增多，呈現(xiàn)顯著的纖維化病理改變特征，同時(shí)大鼠心功能下降，心臟損傷嚴(yán)重，由此可評(píng)價(jià)rihd大鼠模型構(gòu)建成功。
2黃芪生脈飲對(duì)rihd模型大鼠纖維化病理的影響
實(shí)驗(yàn)設(shè)置黃芪生脈飲高、中、低劑量三個(gè)治療組。灌胃劑量按照人臨床給藥劑量折算動(dòng)物給藥劑量為3.1ml/(kg.d)，因此高、中、低劑量組灌胃劑量分別是6.2ml/(kg.d)、3.1ml/(kg.d)、1.6ml/(kg.d)。給藥組大鼠每天灌胃給藥1次或者2次(高劑量組)，連續(xù)灌胃治療12周。心臟纖維化病理改變顯著改善，三種干預(yù)劑量下膠原纖維的比例對(duì)比模型組分別下降31％、56％和42％，說(shuō)明黃芪生脈飲可有效抑制照射引起的心臟纖維化病理進(jìn)程。
3黃芪生脈飲對(duì)rihd模型大鼠心功能和心肌損傷的改善作用
本實(shí)驗(yàn)表明黃芪生脈飲能有效改善模型大鼠的心功能，高、中劑量的黃芪生脈飲均可使模型大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室收縮末期內(nèi)徑(lvesd)、左室射血分?jǐn)?shù)(lvef)和左室短軸縮短率(lvfs)恢復(fù)，降低心臟損傷的特異性指標(biāo)——血清肌鈣蛋白及肌酸激酶同工酶(ck-mb)，中劑量組藥效較顯著，對(duì)比模型組，使lvedd、lvesd、lvef和lvfs分別升高了34％，31％，42％和45％，而肌鈣蛋白及ck-mb降低了52％和61％。
射線是熱毒之邪，引起的心氣血不足為放療心臟毒性的主要病機(jī)。射線損傷人體正氣和陰血，導(dǎo)致機(jī)體熱積血淤，氣陰兩傷，進(jìn)而久病入絡(luò)，氣血凝滯，最終引起心臟功能性和器質(zhì)性損害。黃芪生脈飲益氣滋陰養(yǎng)心，多用于治療氣陰兩虛，心悸氣短的冠心病，該方通過(guò)補(bǔ)益心氣、養(yǎng)血活血可很好的調(diào)整心臟功能，防護(hù)心臟損傷。
4黃芪生脈飲對(duì)模型大鼠心肌纖維化標(biāo)志分子tgf-β1和col-1表達(dá)的影響
在x線照射大鼠之后，以高、中、低劑量黃芪生脈飲灌胃動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)該方顯著降低x線誘導(dǎo)的心肌纖維化分子上調(diào)表達(dá)。綜合rt-pcr和westernblot檢測(cè)的結(jié)果，可以得出結(jié)論：黃芪生脈飲能明顯抑制照射心臟引起的促纖維化損傷，在mrna表達(dá)水平上，這種抑制效應(yīng)似乎還呈現(xiàn)劑量依賴性。
tgf-β是目前所知的最強(qiáng)大的促膠原生成因子，col-1、col-iii則是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在纖維化形成過(guò)程中起重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)研究顯示黃芪生脈飲能下調(diào)放射誘導(dǎo)的纖維化損傷細(xì)胞模型中tgf-β1和col-1的表達(dá)，有明確的抗放射誘導(dǎo)的纖維化藥理效用。黃芪生脈飲的這種抗纖維化作用可能與其抗氧化特性有關(guān)，因?yàn)榍捌诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)不但顯示該藥方中黃芪(ast)可以劑量依賴性的方式抑制受照射的cfs中的ros，表現(xiàn)為20μg/mlast對(duì)ros的抑制作用強(qiáng)于10μg/mlast；并且同時(shí)，照射誘導(dǎo)的tgf-β1、p-smad2/3和col-1的高表達(dá)也能被ast以類似的劑量依賴性的方式抑制，表現(xiàn)為20μg/mlast對(duì)纖維化分子的抑制作用強(qiáng)于10μg/mlast。這些結(jié)果表明：ast抑制放射促纖維化效應(yīng)可能與其抑制受照射cfs中的ros有密切的關(guān)系。這個(gè)推測(cè)可被已有研究支持，黃芪生脈飲通過(guò)其抗氧化特性減少炎性細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而減弱細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)引起的纖維化損傷。本研究表明黃芪生脈飲具有抑制x線誘導(dǎo)的纖維化損傷作用，因此有可能成為放射性心臟纖維化損傷的臨床防治藥物。
5黃芪生脈飲對(duì)rihd大鼠模型中84個(gè)纖維化相關(guān)分子表達(dá)的影響
上述黃芪生脈飲抑制30gyx射線局部照射引起的心肌中tgf-β1和膠原表達(dá)增加，表明該方可抑制放射引起的心臟纖維化損傷效應(yīng)，為進(jìn)一步深入其抗放射性纖維化的機(jī)制研究，我們應(yīng)用pcrarray技術(shù)研究30gy射線照射動(dòng)物心臟對(duì)纖維化相關(guān)的84個(gè)基因表達(dá)的影響。30gyx線照射后8周觀察發(fā)現(xiàn)：和未照射的對(duì)照組相比有40個(gè)基因表達(dá)顯著改變，幾乎50％的基因表達(dá)有差異，28個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，12個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示：5個(gè)抗纖維化基因表達(dá)并未明顯改變；細(xì)胞外基質(zhì)兩個(gè)基因col-1a2,col-3a1表達(dá)均上調(diào)；此外，重構(gòu)酶類、炎性細(xì)胞因子和趨化因子類以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族類的基因差異表達(dá)的較多。
然而，3.1ml/(kg.d)灌胃的中劑量黃芪生脈飲干預(yù)組灌胃8周檢測(cè)，上述差異表達(dá)基因中絕大部分被逆轉(zhuǎn)，即：射線引起高表達(dá)的基因可被黃芪生脈飲下調(diào)，反之，射線引起表達(dá)下調(diào)的基因可部分地被其恢復(fù)至基線水平或上調(diào)?？傮w上來(lái)說(shuō)，黃芪生脈飲中劑量組，上調(diào)表達(dá)的分子數(shù)減少至15個(gè)，而下調(diào)表達(dá)的分子數(shù)增加至23個(gè)，值得關(guān)注的是細(xì)胞外基質(zhì)類的兩個(gè)分子col-1a2、col-3a1，重構(gòu)酶分子中mmp14、mmp3、mmp8，炎性細(xì)胞因子/趨化因子中cxcr4、il-10、il-13、il-13ra2、il-1a、il-1b、tnf，tgf-β超家族中tgf-β1、smad2、smad3、smad4、cav1，以及ctgf、nf-κb1、fasl在單純30gyx線照射后被上調(diào)，而黃芪生脈飲干預(yù)后這些分子全部下調(diào)；此外，單純照射組中下調(diào)表達(dá)的timp1和smad被黃芪生脈飲上調(diào)。上述基因的差異表達(dá)我們還用rt-pcr和westernblooting進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與pcrarray基本一致。這些結(jié)果充分證明黃芪生脈飲能多途徑、多方面的抑制放射誘導(dǎo)cfs的促纖維化效應(yīng)。
器官纖維化是一個(gè)多因素相互作用的慢性炎癥疾病，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，這些基質(zhì)主要有i、iii型膠原(col-1和col-3)構(gòu)成。實(shí)驗(yàn)表明黃芪生脈飲干預(yù)能抑制射線引起的col-1a2和col-3a1基因的上調(diào)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從col-1蛋白表達(dá)水平證明中劑量黃芪生脈飲顯著減低其高表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明，黃芪生脈飲可抑制受照射心臟組織合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，因而具有防治放射誘導(dǎo)的促纖維效應(yīng)。
纖維化中基質(zhì)的沉積會(huì)受到膠原的合成和降解代謝的調(diào)節(jié)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，mmps)和它的抑制劑——組織抑制劑(tissueinhibitorsofmmps，timps)在纖維化組織基質(zhì)沉積中起重要調(diào)節(jié)作用。此外蛋白酶依賴的tgf-β的激活與mmp14有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明黃芪生脈飲干預(yù)能抑制射線引起的重構(gòu)酶中mmp14,mmp3andmmp8的上調(diào)表達(dá)，此外，射線引起的mmp抑制劑timp1的下調(diào)表達(dá)被黃芪生脈飲逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明可通過(guò)調(diào)節(jié)timps和mmps的平衡進(jìn)而減弱x線照射心臟誘導(dǎo)的促纖維化效應(yīng)。
成纖維細(xì)胞能分泌大量炎性介質(zhì)(例如：tnf-α、il-1β、il-3、il-6、il-8、il-1、il-13、mip1α/β等)和趨化因(例如：cxcl2、ccl2等)。這些細(xì)胞因子能直接激活成纖維細(xì)胞。il-13和其受體被認(rèn)為是纖維化的主要調(diào)節(jié)者。此外，成纖維細(xì)胞表達(dá)的趨化因子受體cxcr4能將成纖維細(xì)胞以cxcr4依賴的方式招募到炎癥部位，進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞和基質(zhì)聚集。實(shí)驗(yàn)表明黃芪生脈飲干預(yù)能抑制射線引起的炎性因子/趨化因子類中的cxcr4、il-13、il-13ra2、il-10、il-1a、il-1b和tnf的上調(diào)表達(dá)，因此黃芪生脈飲具有抗炎抗纖維化作用。這一結(jié)果可被黃芪生脈飲通過(guò)減少炎性介質(zhì)的釋放而抑制大鼠肝纖維化的研究支持。
大量研究顯示tgf-β信號(hào)通路參與放射性纖維化的發(fā)生發(fā)展。這條信號(hào)通路的激活起始于tgf-βs結(jié)合到絲/蘇氨酸蛋白激酶受體復(fù)合物上，隨后招募并磷酸化細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器蛋白smad2/smad3，磷酸化的smad2/smad3結(jié)合到smad4并移位至細(xì)胞核內(nèi)激活基因表達(dá)。tgf-β信號(hào)通路可以被抑制性smads,主要包括smad6和smad7負(fù)性調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)表明黃芪生脈飲能抑制射線引起的tgfβ1、smad2、smad3和smad4的上調(diào)表達(dá)；同時(shí)，射線引起的抑制性調(diào)節(jié)分子smad7的下調(diào)表達(dá)被ast逆轉(zhuǎn)。我們pcrarray的研究從mrna水平提示黃芪生脈飲抑制了x線促纖維化效應(yīng)中引起的tgf-β-smad信號(hào)通路的激活。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從蛋白表達(dá)水平證明3.1ml/(kg.d)的黃芪生脈飲顯著減低tgf-β1和p-smad2/3的高表達(dá)，因此具有抑制放射性纖維化的作用。這一研究結(jié)果也被黃芪可降低成纖維細(xì)胞中tgf-β的表達(dá)研究支持。
綜上所述，黃芪生脈飲減弱x線照射引起的心臟纖維化損傷效應(yīng)可通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)、重構(gòu)酶、炎性細(xì)胞因子/趨化因子、tgf-β超家族等功能類別中主要分子進(jìn)行多途徑、多方面抑制放射誘導(dǎo)的促纖維化效應(yīng)。
結(jié)論
1)實(shí)驗(yàn)顯示30gy局部照射引起大鼠心臟組織病理學(xué)改變，組織炎性滲出明顯，心肌膠原纖維合成增多，呈現(xiàn)顯著的纖維化病理改變特征，同時(shí)大鼠心功能下降，左室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室收縮末期內(nèi)徑(lvesd)、左室射血分?jǐn)?shù)(lvef)和左室短軸縮短率(lvfs)均顯著降低，血清肌鈣蛋白及肌酸激酶同工酶(ck-mb)升高，心臟損傷顯著。本研究以30gyx線心臟局部照射構(gòu)建大鼠rihd模型，并以此探討放射性心臟纖維化損傷的分子機(jī)制符合其病理特點(diǎn)和臨床防治需求。
2)本研究表明30gyx線局部照射誘導(dǎo)心臟纖維化損傷效應(yīng)是多分子、多途徑共同介導(dǎo)的復(fù)雜過(guò)程，84個(gè)纖維化相關(guān)分子中幾乎50％的基因表達(dá)受x線照射而改變，根據(jù)這些分子的功能類別可認(rèn)為rihd纖維化發(fā)生過(guò)程主要涉及：促纖維化和抗纖維化兩方面失衡，tgf-β1引起的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)負(fù)性調(diào)節(jié)被抑制而正性調(diào)節(jié)強(qiáng)化，細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，炎癥反應(yīng)和基質(zhì)重構(gòu)系統(tǒng)活化，最終導(dǎo)致受照射的心臟向纖維化病理方向發(fā)展。
3)中藥復(fù)方黃芪生脈飲有效改善受照射大鼠的心功能，降低心臟損傷標(biāo)志性分子肌鈣蛋白及肌酸激酶同工酶(ck-mb)的血清水平，有效防護(hù)受照射心臟，其抗放射性心臟纖維化損傷的分子機(jī)制可能主要相關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)、重構(gòu)酶、炎性細(xì)胞因子/趨化因子和tgf-β信號(hào)通路。該中藥復(fù)方有望應(yīng)用于放射性心臟纖維化損傷的臨床防治。
以上所述僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施方式而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施方式所做的任何簡(jiǎn)單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。