本發(fā)明屬于納米纖維傷口敷料的制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料及其制備方法，還涉及所述傷口敷料在制備促進創(chuàng)面修復、誘導組織再生或抑制創(chuàng)面瘢痕形成的藥品或美容品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：增生性瘢痕是病理性瘢痕中的一種主要類型，常導致瘙癢、疼痛、活動障礙等諸多并發(fā)癥，已成為創(chuàng)面修復及術(shù)后美容領(lǐng)域研究的重點。其主要病理學特征是大量成纖維細胞增生和膠原的過度沉積及無序排列。目前主要以手術(shù)和非手術(shù)治療為主，但仍然缺乏足夠的認識和特效的治療手段及藥物。微納米纖維敷料因具有仿生皮膚細胞外基質(zhì)及高的比表面積和三維結(jié)構(gòu)等諸多優(yōu)點，在皮膚組織修復及功能重建領(lǐng)域得到了廣泛的研究。然而，目前微納米纖維敷料主要采用靜電紡絲方法制得，其無序非取向誘導皮膚成纖維細胞生長的特性使得術(shù)后皮膚增生性瘢痕問題仍未得到有效解決。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，提供一種抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，該纖維敷料定向有序排布結(jié)構(gòu)誘導傷口皮膚成纖維細胞取向遷移和增值，實現(xiàn)膠原蛋白纖維取向形成，不僅高效誘導創(chuàng)面皮膚再生修復，同時有效抑制皮膚傷口愈合過程增生性瘢痕形成的問題，增強敷料功效。本發(fā)明的另一個目的是提供所述傷口敷料的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供所述傷口敷料在促進創(chuàng)面修復及誘導組織再生并抑制創(chuàng)面瘢痕形成中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，其以γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸為紡絲原料，通過微流體紡絲方法制備得到。進一步地，所述γ-聚谷氨酸(γ-pga)分子量范圍為10萬～200萬道爾頓，優(yōu)選100萬道爾頓；所述透明質(zhì)酸(ha)分子量為50萬～200萬道爾頓，優(yōu)選70萬～100萬道爾頓。進一步地，所述γ-聚谷氨酸與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為1∶1～5∶1，優(yōu)選3∶1～5∶1。進一步地，所述敷料還包括助紡高分子，所述助紡高分子為聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的一種或兩種的混合物；γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸的總質(zhì)量與助紡高分子的質(zhì)量比為3∶1～10∶1，優(yōu)選5∶1～10∶1。一種抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將γ-聚谷氨酸、透明質(zhì)酸和助紡高分子溶解在溶劑中得到聚合物溶液；(2)將步驟(1)制備得到的聚合物溶液置入微流體紡絲裝置紡絲；(3)將步驟(2)得到的纖維敷料干燥。步驟(1)中，所述溶劑為水、乙醇、乙酸水溶液，或乙醇和水的混合溶劑；γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸和助紡高分子的總質(zhì)量濃度為2wt％～10wt％，優(yōu)選5wt％。步驟(1)中，將天然高分子γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸，以及助紡高分子溶解在溶劑中，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液。步驟(2)中，將步驟(1)制備得到的聚合物溶液置入微流體紡絲裝置的注射器中，設(shè)置推進速率和旋轉(zhuǎn)電機旋轉(zhuǎn)速率后啟動紡絲，先挑出一根纖維連在纖維接收器上，由接收器上的接收板旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲，同時設(shè)置步進平移臺的步進平移速率，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列。進一步地，所述溶液推速為0.1～1ml/h，優(yōu)選0.4～0.7ml/h；旋轉(zhuǎn)電機轉(zhuǎn)速設(shè)置為800～1500rad/min，優(yōu)選1000～1200rad/min；步進平移臺步進平移速率為20～50mm/min，優(yōu)選30～40mm/min。進一步地，所述操作溫度和壓力為常溫常壓。步驟(3)所述的干燥為30～50℃真空干燥，優(yōu)選40℃真空干燥；干燥時間為12～24h。按照上述所有的制備方法制得的敷料都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。按照上述所有的制備方法制得的敷料在制備促進創(chuàng)面修復、誘導組織再生或抑制創(chuàng)面瘢痕形成的藥品或美容品中的應(yīng)用也都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。有益效果：(1)本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過微流體紡絲技術(shù)制備新型纖維敷料，從模擬皮膚細胞外基質(zhì)(ecm)主要成分-膠原蛋白/多糖結(jié)構(gòu)出發(fā)，以天然高分子γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸為原始材料，通過調(diào)節(jié)微流體紡絲參數(shù)制備定向有序排布的纖維敷料，該纖維敷料定向有序排布結(jié)構(gòu)誘導傷口皮膚成纖維細胞取向生長和遷移，實現(xiàn)膠原蛋白纖維定向有序分布，從而抑制皮膚傷口愈合過程增生性瘢痕形成的問題，增強敷料功效。(2)本發(fā)明制備過程簡單易行，無高電壓流、安全、節(jié)能、便捷，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，在傷口敷料領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛力。附圖說明圖1為微流體紡絲裝置示意圖；圖2為實施例1制備得到γ-pga/ha納米纖維掃描電鏡圖譜：(a)微流體紡絲方法制得的纖維微觀形貌，(b)商業(yè)化靜電紡絲纖維微觀形貌；圖3為實施例1制備得到γ-pga/ha纖維敷料生物相容性評價結(jié)果；圖4為實施例1制備得到γ-pga/ha纖維敷料在第七天時促進大鼠創(chuàng)面皮膚修復再生和抑制瘢痕效果評價效果圖：(a)空白對照組，(b)商業(yè)化靜電紡絲敷料，(c)微流體紡絲纖維敷料；上層為皮膚創(chuàng)面愈合宏觀照片，下層為膠原蛋白纖維馬松染色圖片。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實驗所用的儀器和材料1.微流體紡絲裝置本發(fā)明實施例所用的微流體紡絲裝置購自于南京捷納思新材料有限公司，見圖1。電源：ac：220v，50hz；額度功率：300w；使用環(huán)境：常溫常壓，靜態(tài)環(huán)境；可選注射器規(guī)格：0.5-200ml；進樣速度范圍：0.1ul/h-150ul/h；旋轉(zhuǎn)速度：0-1440rad/min；平移速度：0-1000mm/min。2.商業(yè)化靜電紡絲纖維敷料本發(fā)明實施例所用的商業(yè)化靜電紡絲纖維敷料由海藻酸鈣無紡布組成，成分為海藻酸鈣纖維，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后應(yīng)無菌，一次性使用。實施例1：(1)將γ-pga、ha和pva粉末溶解在水中，其中γ-pga分子量為100萬道爾頓，ha分子量為100萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為3∶1，γ-pga/ha和pva的質(zhì)量比為10∶1，γ-pga/ha和pva的總質(zhì)量濃度為5wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.4ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為1200rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為35mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為40℃，時間為24h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料。實驗結(jié)果：(1)圖2為實施例1制備得到γ-pga/ha納米纖維掃描電鏡圖譜：(a)微流體紡絲方法制得的纖維微觀形貌，(b)商業(yè)化靜電紡絲纖維微觀形貌。從圖2中可以看出，該實施例條件下制得的纖維絲較商業(yè)化靜電紡絲纖維具有定向有序性。(2)圖3為實施例1制備得到γ-pga/ha纖維敷料生物相容性評價結(jié)果。本發(fā)明采用的生物相容性評價實驗詳見實施例8。從圖3可以看出，實驗組γ-pga/ha纖維敷料處理的細胞增值率超過空白對照組，可以促進l929皮膚成纖維細胞的增殖和黏附，具有良好的生物相容性。(3)圖4為實施例1制備得到γ-pga/ha纖維敷料在第七天時促進大鼠創(chuàng)面皮膚修復再生和抑制瘢痕效果評價效果圖：(a)空白對照組，(b)商業(yè)化靜電紡絲敷料，(c)微流體紡絲纖維敷料；上層為皮膚創(chuàng)面愈合宏觀照片，下層為膠原蛋白纖維馬松染色圖片。本發(fā)明采用的促進創(chuàng)面愈合及抑制瘢痕形成能力評價實驗詳見實施例9。從圖4創(chuàng)面修復宏觀照片可以看出，本發(fā)明微流體紡絲法制得的γ-pga/ha纖維敷料的創(chuàng)面愈合率優(yōu)于商業(yè)化靜電紡絲組和空白對照組，且無明顯增生瘢痕，而商業(yè)化靜電紡絲組和空白對照組瘢痕嚴重。重要的是，圖4中馬松染色結(jié)果顯示，γ-pga/ha纖維敷料處理組創(chuàng)面新生膠原厚度明顯大于對照組，且膠原纖維有序排列，說明γ-pga/ha纖維敷料的有序陣列排布可以較好的誘導創(chuàng)面成纖維細胞趨向遷移排布進而表達膠原蛋白，同時在抑制瘢痕形成的同時高效促進創(chuàng)面修復重建和誘導皮膚組織再生。實施例2：(1)將γ-pga、ha和pva粉末溶解在水中，其中γ-pga分子量為100萬道爾頓，ha分子量為50萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為3∶1，γ-pga/ha和pva的質(zhì)量比為5∶1，γ-pga/ha和pva的總質(zhì)量濃度為5wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.4ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為1000rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為30mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為30℃，時間為12h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，得到纖維絲排列有序性較好。實施例3：(1)將γ-聚谷氨酸(γ-pga)、透明質(zhì)酸(ha)和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)粉末溶解在水中，其中γ-pga分子量為200萬道爾頓，ha分子量為100萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為5∶1，γ-pga/ha和pva的質(zhì)量比為5∶1，γ-pga/ha和pvp的總質(zhì)量濃度為5wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.7ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為1000rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為30mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為40℃，時間為24h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，得到纖維絲排列有序性較好。實施例4：(1)將γ-pga、ha和pva粉末溶解在水中，其中γ-pga分子量為100萬道爾頓，ha分子量為200萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為1∶1，γ-pga/ha和pva的質(zhì)量比為10∶1，γ-pga/ha和pva的總質(zhì)量濃度為5wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.1ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為1200rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為40mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為40℃，時間為24h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，得到纖維絲排列有序性較好。實施例5：(1)將γ-pga、ha和pvp粉末溶解在水中，其中γ-pga分子量為200萬道爾頓，ha分子量為70萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為5∶1，γ-pga/ha和pvp的質(zhì)量比為10∶1，γ-pga/ha和pvp的總質(zhì)量濃度為10wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.1ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為1500rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為50mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為50℃，時間為24h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，得到纖維絲排列有序性較好。實施例6：(1)將γ-pga、ha和pva粉末溶解在水中，其中γ-聚谷氨酸分子量為100萬道爾頓，ha分子量為150萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為3∶1，γ-pga/ha和pva的質(zhì)量比為5∶1，γ-pga/ha和pva的總質(zhì)量濃度為10wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.1ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為1500rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為50mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為40℃，時間為24h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，得到纖維絲排列有序性較好。實施例7：(1)將γ-聚谷氨酸(γ-pga)、透明質(zhì)酸(ha)和聚乙烯醇(pva)粉末溶解在水中，其中γ-pga分子量為10萬道爾頓，ha分子量為50萬道爾頓，γ-pga與ha的質(zhì)量比為1∶1，γ-pga/ha和pva的質(zhì)量比為3∶1，γ-pga/ha和pva的總質(zhì)量濃度為2wt％，機械攪拌得到均勻的聚合物紡絲液；(2)常溫常壓下，將聚合物溶液置入注射器中，設(shè)置推進速率為0.1ml/h。旋轉(zhuǎn)電機速率設(shè)置為800rad/min，先挑出一根纖維連在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋轉(zhuǎn)卷繞出連續(xù)均一的絲。步進平移臺設(shè)置步進平移速率為20mm/min，使得卷出的絲位置隨之偏移，理論等間距收集使之可以不重疊，得到等間距平行微絲正列；(3)將收集到的纖維敷料真空干燥處理，真空干燥溫度為30℃，時間為12h。得到γ-聚谷氨酸和透明質(zhì)酸纖維傷口敷料，得到纖維絲排列有序性較好。實施例8：將上述實施例1-7制得的纖維敷料分別按照下述實驗過程進行生物相容性評價。(1)γ-pga/ha纖維敷料的準備。首先將纖維材料剪成直徑為1cm的圓形，超凈工作臺上紫外線照射2h，用75％酒精浸泡1h，然后用pbs沖洗3遍，不少于1h，將支架材料浸泡在dmem細胞培養(yǎng)液中過夜，備用。(2)細胞在材料上的增殖情況(mtt實驗)。將l929細胞按1×106每孔接種于12孔培養(yǎng)板中，在其中6孔中細胞液加入纖維敷料材料，另外6孔為空白對照組。分別在培養(yǎng)1，3，5d時加入100μlmtt試劑并在37℃下孵育4h，然后加入150μldmso溶解甲瓚沉淀，通過酶標儀測定培養(yǎng)液在570nm和630nm波長下的吸收值，計算細胞增值率，計算公式為：實驗每組進行6個平行實驗，取平均值減小系統(tǒng)誤差。實驗結(jié)果顯示，實施例1-7制得的纖維敷料均具有良好的生物相容性。實施例9：將上述實施例1-7制得的γ-pga/ha纖維敷料分別按照下述實驗過程進行促進創(chuàng)面愈合及抑制瘢痕形成能力評價。(1)γ-pga/ha纖維敷料的準備。首先將纖維材料剪成直徑為1cm的圓形，超凈工作臺上紫外線照射2h，用75％酒精浸泡1h，然后用0.9％的生理鹽水沖洗3遍后備用。(2)動物模型的制備和創(chuàng)面處理通過建立大鼠全層皮膚切口模型評價γ-pga/ha纖維敷料促進創(chuàng)面愈合及抑制瘢痕形成的能力。所有動物實驗操作均符合國際動物保護和倫理道德規(guī)范。實驗對象選取15只雄性sprague-dawley大鼠(180-250g，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)，首先在老鼠腹腔注射氯胺酮(50mg/kg體重)對其進行麻醉處理，然后用剃刀除去老鼠背部毛發(fā)，再用碘伏對皮膚進行消毒。在肩胛骨兩側(cè)位置各建立1個圓形皮膚全層缺損(半徑1cm)。隨后，所有實驗動物隨機分為3組，分別為陽性對照組(商業(yè)化靜電紡絲組)、陰性對照組(空白對照組)、實驗組，每組5只：在老鼠背部缺損處分別用無菌pbs、紗布和γ-pga/ha纖維敷料進行處理。(3)創(chuàng)面的觀察和創(chuàng)面愈合率的計算于手術(shù)后1，3，5，7d打開敷料，觀察創(chuàng)面愈合的情況，數(shù)碼相機照相后，用optimas顯微圖象分析系統(tǒng)計算創(chuàng)面面積，留取創(chuàng)面及創(chuàng)周組織做病理切片，進行masson染色，按下面公式計算創(chuàng)面愈合率：γ-pga/ha纖維敷料處理的傷口7天后創(chuàng)面愈合率評價見表1。表1實施例1實施例2實施例3實施例4實施例5實施例6實施例7實驗組97849087928382陽性對照組72727272727272陰性對照組46464646464646表1顯示，在第七天時，商業(yè)化靜電紡絲組和空白對照組處理的創(chuàng)面愈合率分別為72％和46％，而由本發(fā)明微流體紡絲法制得的γ-pga/ha纖維敷料均優(yōu)于對照組，最高愈合率可達97％。觀察創(chuàng)面愈合的情況，本發(fā)明微流體紡絲法制得的γ-pga/ha纖維敷料無明顯增生性瘢痕，商業(yè)化靜電紡絲組和空白對照組瘢痕嚴重。γ-pga/ha纖維敷料處理組創(chuàng)面新生膠原厚度明顯大于對照組，且膠原纖維有序排列，說明γ-pga/ha纖維敷料的有序陣列排布可以較好的誘導創(chuàng)面成纖維細胞趨向遷移排布進而表達膠原蛋白，同時在抑制瘢痕形成的同時高效促進創(chuàng)面修復重建和誘導皮膚組織再生。當前第1頁12