本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥有效成分提取及純化方法，特別是涉及一種從馬錢子中提取、分離馬錢子總生物堿的方法。

背景技術(shù)：

馬錢子又名番木鱉，是常用的劇毒中藥，始載于《本草綱目》，藥典記載其具有“通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫”之功效，對癌性疼痛、三叉神經(jīng)痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等各種疼痛癥狀有良好的臨床療效。馬錢子的主要活性成分是吲哚類生物堿，其中士的寧與馬錢子堿兩者含量超過馬錢子生物堿總量的80%。士的寧含量最高，藥典規(guī)定含12-22mg/g，約占生物堿總量的40-50%；其次是馬錢子堿，藥典規(guī)定不少于8mg/g，約占生物堿總量30-40%。馬錢子堿具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，能抑制血小板的凝聚與抗血栓形成，是馬錢子通絡(luò)止痛主要活性成分；而士的寧卻并無明顯鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，且其為劇毒藥物?？诜康膶?-10mg即可出現(xiàn)肌肉痙攣等中毒癥狀；超過30mg患者可能因肌肉強直痙攣而窒息死亡。即使臨床患者按規(guī)定服用馬錢子0.3-0.6g，士的寧攝入量已高達3.6-13.2mg，故臨床服藥過程中易出現(xiàn)中毒癥狀，過量服用馬錢子則易導(dǎo)致患者死亡。

去除馬錢子總生物堿所含部分士的寧，有助于降低其毒性，且能保留其鎮(zhèn)痛、抗炎的藥理活性，實現(xiàn)馬錢子安全用藥。專利申請?zhí)?01110300527.2采用酸水熱回流提取、減壓濃縮、甲醇攪拌醇沉后制干膏、干膏用堿液溶解，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯即得馬錢子總堿。專利申請?zhí)?01110294731.8采用5-12倍量酸水熱回流提取、提取液調(diào)ph、過濾，濾液直接加到大孔吸附樹脂上，去離子水、酸液洗脫后再用乙醇洗脫，濃縮洗脫液中的乙醇，調(diào)ph至8-11，加入硅藻土，蒸干，得固體物；固體物采用氯仿回流提取，過濾，回收有機溶劑，干燥，粉碎成藥粉；藥粉用甲醇處理，過濾，濾液減壓濃縮，干燥，粉碎即得馬錢子總生物堿。上述專利方法均采用酸水熱回流提取從馬錢子中提取馬錢子總生物堿，生產(chǎn)時間長，能耗高，且酸易損傷大生產(chǎn)設(shè)備，提取液中水溶性雜質(zhì)多，不利于后續(xù)純化馬錢子總生物堿；同時上述工藝需使用氯仿、甲醇等強毒的有機溶劑，總生物堿易出現(xiàn)有毒有機溶劑的殘留。本發(fā)明擬采用閃式提取法提取馬錢子，馬錢子提取液濃縮后調(diào)ph至堿性，濾除沉淀，濾液經(jīng)大孔吸附樹脂純化，由此獲得純度較高的去除大量士的寧的馬錢子總生物堿。

閃式提取技術(shù)是一種用于植物軟、硬組織破碎的新型提取技術(shù)，它能在室溫下將溶劑中的藥材粉碎至細(xì)微顆粒，有效成分在數(shù)秒鐘或數(shù)分鐘內(nèi)擴散到溶劑中，能避免藥材中活性成分受熱破壞，提取時間短，效率高、安全可靠。近年閃式提取法受到了研究者的青睞，已有文獻報道應(yīng)用該技術(shù)提取白芍、龍膽、丹參、辣椒等多種中藥的活性成分。從馬錢子中提取馬錢子生物堿的方法通常為熱回流提取法，目前未見采用閃式提取法從馬錢子中提取馬錢子生物堿。大孔吸附樹脂是一種新型非離子型高分子聚合物吸附劑，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，吸附性能強，其特點是吸附容量大，再生簡單，效果可靠。大孔吸附樹脂近年來廣泛運用于中藥制劑的純化精制領(lǐng)域，尤其適合于從中藥提取液中分離活性成分。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種節(jié)能環(huán)保、高效迅速地從馬錢子中提取、分離去除大部分士的寧的馬錢子總生物堿的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種快速提取分離馬錢子總生物堿的方法，包括下列步驟：

（1）閃式提取法提取馬錢子粗粉；

（2）將步驟（1）所得馬錢子提取液濃縮；

（3）將步驟（2）馬錢子濃縮液加堿至堿性，濾除沉淀；

（4）將步驟（3）濾液用大孔吸附樹脂上樣，純水洗脫雜質(zhì)；

（5）將步驟（4）中純水洗雜質(zhì)后的大孔吸附樹脂用乙醇洗脫，回收洗脫液中的乙醇，干燥，即得馬錢子總生物堿。

本發(fā)明進一步提供上述技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案。

步驟（1）中乙醇濃度為30%～80%（v/v），溶劑用量為6～20倍馬錢子粗粉（v/m），電機轉(zhuǎn)速為3000～5000r/min，提取次數(shù)為1～3次，提取時間為1～2min；

步驟（2）中所述的濃縮可為常溫或減壓濃縮，優(yōu)選為減壓濃縮，藥液濃縮至每100ml含馬錢子20～100g；

步驟（3）中所用的ph調(diào)節(jié)劑為20%naoh，調(diào)ph值至10～13，濾除沉淀；

步驟（4）中所述的大孔吸附樹脂型號為ab-8，d101，d3520，優(yōu)選非極性大孔吸附樹脂d101，所用吸附樹脂的干重量為辣椒粗粉的1/12～1/6，純水的用量為2～6倍柱體積；

步驟（5）中乙醇濃度為40%～95%，乙醇用量為4～10倍柱體積；

本發(fā)明采用閃式提取法提取，再應(yīng)用大孔吸附樹脂純化。閃式提取法在常溫下進行，提取時間僅需1～2min，具生產(chǎn)周期短、經(jīng)濟節(jié)能等優(yōu)勢；與回流提取法、超聲提取法相比，采用閃式提取法時士的寧和馬錢子堿的提取率更高。大孔吸收樹脂分離純化具有成本低廉、收率高、可再生等優(yōu)點；經(jīng)大孔吸附樹脂分離純化后的馬錢子總生物堿中馬錢子堿含量可高達75.0%，而此時總堿中士的寧含量僅為10.6%，且在制備過程中僅用乙醇為溶劑，產(chǎn)品無有毒溶劑的殘留。因此，本發(fā)明采用閃式提取法提取馬錢子，調(diào)ph后的馬錢子濃縮液應(yīng)用大孔吸附樹脂純化馬錢子堿，本發(fā)明作為一個全新、整體的技術(shù)方案，具有制備工藝操作簡便、生產(chǎn)周期短、成本低，節(jié)能環(huán)保等諸多優(yōu)勢。

具體實施方式

下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。本發(fā)明各實施例所得的提取液均采用高效液相色譜法測定馬錢子堿、士的寧的含量，色譜條件如下：色譜柱inertsustainc18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：甲醇～水（含1%甲酸和0.3%三乙胺）溶液(17：83)；流速：1ml·min^-1；檢測波長：馬錢子堿254nm、士的寧264nm；柱溫：40℃；進樣量：50μl。

實施例1：

稱取馬錢子粗粉50.0g，置于圓底燒瓶中，第一次加50%乙醇400ml，熱回流法提取2h，過濾，第二次加50%乙醇300ml，熱回流法提取1.5h，過濾第三次加50%乙醇200ml，熱回流法提取0.5h，過濾，合并三次濾液，用高效液相檢測濾液中提取物濃度并計算提取率，濾液濃縮至恒重，計算浸膏率。

實施例2：

稱取馬錢子粗粉50.0g，置于圓底燒瓶中，第一次加50%乙醇400ml，超聲波輔助提取法提取1h，過濾，第二次加50%乙醇300ml，超聲波輔助提取法提取0.5h，過濾，第三次加50%乙醇200ml，超聲波輔助提取法提取0.5h，過濾，合并三次濾液，用高效液相檢測濾液中提取物濃度并計算提取率，濾液濃縮至恒重，計算浸膏率。

實施例3：

稱取馬錢子粗粉50.0g，置于閃式提取器中，第一次加50%乙醇400ml，閃提2min，過濾，第二次加50%乙醇300ml，閃提1min，過濾，第三次加50%乙醇200ml，閃提1min，過濾，合并三次濾液，用高效液相檢測濾液中提取物濃度并計算提取率，濾液濃縮至恒重，計算浸膏率。

表1不同提取方法對活性成分提取率和浸膏率的影響

結(jié)論：由表1知三種方法中閃式提取法浸膏率最低，熱回流提取4.5h和超聲波2h提取的士的寧和馬錢子堿有相近的提取率，而閃式提取法4min的提取率高于前兩種方法，士的寧和馬錢子堿的提取率均能達到百分之八十以上，體現(xiàn)了閃式提取高效、快速等優(yōu)勢。

實施例4：

稱取馬錢子粗粉50.0g，置于閃式提取器中，第一次加60%乙醇400ml，閃提2min，過濾，第二次加60%乙醇300ml，閃提1min，過濾，第三次加60%乙醇200ml，閃提1min，過濾，合并三次濾液，用高效液相檢測濾液的濃度并計算提取率。

實施例5：

稱稱取馬錢子粗粉50.0g，置于閃式提取器中，第一次加70%乙醇400ml，閃提2min，過濾，第二次加70%乙醇300ml，閃提1min，過濾，第三次加70%乙醇200ml，閃提1min，過濾，合并三次濾液，用高效液相檢測濾液的濃度并計算提取率。

表2不同乙醇濃度提取對活性成分提取率的影響

結(jié)論：表2中60%乙醇提取效果最好，故選用60%乙醇作為提取溶劑。

實施例6

根據(jù)上述實施例4中的提取方法提取1000.0g馬錢子，得濾液后將濾液減壓濃縮至原體積的1/3，濃縮液平均分成三分，分別加入到預(yù)先處理好的非極性d3520、非極性d101、弱極性ab-8樹脂中，吸附12h，過濾，吸附液分別取樣，再分別將70%的乙醇加入到吸附飽和的樹脂中，解吸12h，解吸液分別取樣，高效液相色譜分別檢測吸附液和解吸液，根據(jù)吸附液和解析液濃度計算吸附率、解析率。

表3三種樹脂對馬錢子堿的靜態(tài)吸附和解吸性能

結(jié)論：由表3可以看出d101和ab-8大孔吸附樹脂對士的寧和馬錢子堿的吸附作用較好，強于d3520大孔吸附樹脂的吸附。雖然d101和ab-8樹脂對士的寧與馬錢子堿的吸附率十分接近，但d101大孔吸附樹脂中的馬錢子堿解吸率明顯高于ab-8樹脂。綜上，選擇d101樹脂分離純化馬錢子提取液。

實施例7

稱取馬錢子粗粉250.0g，置于閃式提取器中，第一次加60%乙醇2000ml，閃提2min，過濾，第二次加60%乙醇1500ml，閃提1min，過濾。合并兩次濾液，濾液減壓濃縮回收乙醇。濃縮液中加20%naoh，調(diào)ph值至13，過濾，濾液加入到預(yù)先處理好的d101型大孔吸附樹脂上，先用純水洗脫至無色；接著用10倍柱體積50%的乙醇進行洗脫，洗脫液回收乙醇，干燥，得馬錢子總生物堿。

實施例8

稱取馬錢子粗粉250.0g，置于閃式提取器中，第一次加60%乙醇2000ml，閃提2min，過濾，第二次加60%乙醇1500ml，閃提1min，過濾。合并兩次濾液，濾液減壓濃縮回收乙醇。濃縮液中加20%naoh，調(diào)ph值至13，過濾，濾液加入到預(yù)先處理好的d101型大孔吸附樹脂上，先用純水洗脫至無色；接著用8倍柱體積70%的乙醇進行洗脫，洗脫液回收乙醇，干燥，得馬錢子總生物堿。

實施例9

稱取馬錢子粗粉250.0g，置于閃式提取器中，第一次加60%乙醇2000ml，閃提2min，過濾，第二次加60%乙醇1500ml，閃提1min，過濾。合并兩次濾液，濾液減壓濃縮回收乙醇。濃縮液中加20%naoh，調(diào)ph值至13，過濾，濾液加入到預(yù)先處理好的d101型大孔吸附樹脂上，先用純水洗脫至無色；接著用6倍柱體積95%的乙醇進行洗脫，洗脫液回收乙醇，干燥，得馬錢子總生物堿。

表4不同濃度乙醇的馬錢子總生物堿洗脫量及其士的寧和馬錢子堿含量