本發(fā)明涉及一種銀杏葉復方免疫增強劑。

背景技術(shù)：

近年來，免疫抑制性疾病、病毒感染性疾病的發(fā)病率正逐年上升，工業(yè)環(huán)境污染、生態(tài)失衡引發(fā)的多因子、多屬性、多層次代謝性疾病、慢性疾病也日漸增多。某些西藥作用單一，常顧此失彼，毒副作用明顯，易殘留，且對于免疫抑制性疾病、病毒感染性疾病及多因子多層次的慢性病沒有特異療法。而中藥是天然藥，對機體可宏觀調(diào)整平衡；中藥配伍講究君臣佐使，統(tǒng)籌兼顧，多種成分協(xié)調(diào)配合，標本兼治，毒副作用小。研究表明，許多中藥及復方能明顯促進機體的非特異性免疫和特異性免疫，提高機體抵抗力，而且能改善畜禽食欲，提高增重，對許多疾病有較好的防治效果。在大力提倡綠色食品的今天，中草藥以其天然性、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢是抗生素和化學合成藥物無法比擬的。它來源廣泛，原料價格低廉，安全環(huán)保，有些甚至可人工培育，所以開發(fā)天然植物免疫增強劑以逐步代替抗生素，可達到保護環(huán)境和增進健康的目的，故天然植物性的免疫增強劑以其獨特的優(yōu)勢而備受關(guān)注。

國內(nèi)外都紛紛研究開發(fā)各種植物性免疫增強劑。目前對植物藥研究較多的國家除了中國，主要有美國、日本、德國、俄羅斯、法國等國。各國開發(fā)利用的資源主要有貓爪草、鋸葉棕、銀杏、銀杏葉、狹葉紫錐菊、人參、大蒜、月見草油和側(cè)柏葉靛藍等。中國使用中草藥歷史悠久，而且我國草藥資源豐富，與國外單一制劑不同，我國主要是復方中草藥制劑。在這樣的環(huán)境下，中國傳統(tǒng)的中藥免疫增強劑以其高效性、安全性、穩(wěn)定性以及成本的低廉而成為國內(nèi)外科研工作者注意的焦點。

銀杏(ginkgobiloba，j．)是世界上最古老的孑遺植物，為我國特有樹種，資源豐富，擁有量占世界總量的70％以上。中國銀杏葉產(chǎn)品開發(fā)創(chuàng)新還十分滯后，銀杏葉提取物的開發(fā)仍然上不了規(guī)模。目前，我國銀杏葉提取物在保健品、飲料、化妝品、飼料等領(lǐng)域的開發(fā)剛剛起步，可以算是一片空白。如果在這些領(lǐng)域充分開發(fā)，顯然會進一步帶動銀杏葉提取物的發(fā)展，提高銀杏葉提取物的總體經(jīng)濟效益。銀杏葉的食用安全性較高，目前臨床上銀杏葉制劑和復方銀杏葉制劑多用于治療心血管疾病，有關(guān)銀杏葉及其復方制劑對畜禽疾病防治的報道，不僅十分少見，并且只停留在單方制劑（銀杏葉提取物）這個小范圍內(nèi)探討，還很缺乏在銀杏葉復方制劑這方面的深入研究。復方中藥是單味藥物治病的進一步發(fā)展，既能發(fā)揮單味藥的特長，又能彌補單味藥的不足，更能增強效力。

機體的免疫系統(tǒng)，不僅能抵御外來細菌、病毒和其他有害物質(zhì)的侵襲，還能清除體內(nèi)衰老、突變、惡化或死亡的細胞，保衛(wèi)機體的健康。古方四君子湯臨床上運用相當廣泛，是補氣健脾的重要方劑之一。臨床研究表明，四君子湯對正常小鼠有促進細胞免疫、抑制體液免疫作用，表現(xiàn)在升高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，降低血清凝集素和溶血素，能對抗d一半乳糖誘導小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及紅細胞免疫吸附能力低下，增強淋巴細胞轉(zhuǎn)化及紅細胞的免疫吸附能力。溫慶祥等證實，服用四君子湯可以預防脾虛證大鼠t細胞轉(zhuǎn)化率和b細胞分泌的igg水平降低。四君子湯能拮抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，提高機體的免疫功能。

課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏葉與黃芪、白術(shù)、黨參、茯苓組成的銀杏葉基礎(chǔ)方劑對脾虛證小鼠的消化酶活性有保護作用，并能通過降低血清中mda含量，提高sod和gsh-px含量，達到清除自由基、維持膜功能穩(wěn)定的作用。因此，本發(fā)明在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以現(xiàn)代中醫(yī)藥理論為依據(jù)，利用銀杏葉與中草藥（黃芪、白術(shù)、黨參、茯苓、山藥、白扁豆、山楂、薏苡仁、砂仁、陳皮等）配制成三種銀杏葉復方制劑，采用免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（cy）制作免疫抑制動物模型，以四君子湯為對照，對三種銀杏葉復方進行了初步的免疫學研究，從中選出一個有效的中藥免疫增強劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種銀杏葉復方免疫增強劑，以確實有效地利用中藥增強免疫。

為了達成上述目的，本發(fā)明的銀杏葉復方免疫增強劑，由銀杏葉、黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、砂仁和陳皮，按質(zhì)量比為10:15:15:12:15:6:9的比例，配制而成。

其中，銀杏葉粉購自長沙博鍵生物科技有限公司，產(chǎn)品標準號：q/adpg001-2008；其余藥物均購自龍巖市第一醫(yī)院，質(zhì)量符合中華人民共和國獸藥典標準。

上述方劑按比例配比，采用傳統(tǒng)水煎法：蒸餾水預行浸泡2小時，加熱煎煮2次，第1次保持微沸30min，濾出藥液；藥渣加溫水再煮沸，仍保持微沸30分鐘，濾出藥液；合并兩次濾液，小火濃縮至1g/ml（按照生藥量計算）。

本發(fā)明采用飲水方式給藥，每只小鼠的日飲藥量（g）根據(jù)體表面積折算動物的等效劑量的2倍計算，即飲藥量為1.8ml/只*天。

實驗表明，本發(fā)明的銀杏葉復方免疫增強劑，對正常小鼠的血液學指標無不良影響，對健康小鼠的肝臟指數(shù)無不良影響，對免疫抑制小鼠部分血液學指標有恢復作用，對環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠體重增重率及臟器指數(shù)變化優(yōu)于四君子湯，組織形態(tài)學的變化進一步佐證了本發(fā)明對肝脾的損傷具有較好的保護作用。

附圖說明

圖1是空白組對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖2是空白組對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖3是空白+cy組對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖4是空白+cy組對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖5是四君子湯對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖6是四君子湯對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖7是四君子湯+cy對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖8是四君子湯+cy對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖9是本發(fā)明（復方?。Ω危?00×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖10是本發(fā)明對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖11是本發(fā)明+cy對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖12是本發(fā)明+cy對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖13是復方ⅱ對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖14是復方ⅱ對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖15是復方ⅱ+cy對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖16是復方ⅱ+cy對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖17是復方ⅲ對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖18是復方ⅲ對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖19是復方ⅲ+cy對肝（400×）的組織病理學檢查結(jié)果圖；

圖20是復方ⅲ+cy對脾（40×）的組織病理學檢查結(jié)果圖。

具體實施方式

1、材料和方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗動物

試驗選用30克左右的清潔級km小鼠200只，雌性，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證編號2007000502350。

1.1.2試驗藥品

環(huán)磷酰胺cy(粉劑，0.2g/支)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號：10030921。每支cy用10ml生理鹽水溶解，以75mg/kg的劑量進行腹腔注射。

中藥的組成：

四君子湯：黨參，白術(shù)，茯苓，炙甘草，質(zhì)量比例為3:3:3:1；

本發(fā)明（銀杏葉復方制劑ⅰ，后面簡稱復方?。恒y杏葉，黃芪，黨參，白術(shù)，茯苓，砂仁，陳皮，質(zhì)量比例為10:15:15:12:15:6:9；

銀杏葉復方制劑ⅱ（后面簡稱復方ⅱ）：銀杏葉，黃芪，黨參，白術(shù)，茯苓，山藥，白扁豆，質(zhì)量比例為10:15:15:12:12:15:10；

銀杏葉復方制劑ⅲ（后面簡稱復方ⅲ）：銀杏葉，黃芪，黨參，白術(shù)，茯苓，山楂，薏苡仁，質(zhì)量比例為10:10:15:12:12：10:15。

銀杏葉粉購自長沙博鍵生物科技有限公司，產(chǎn)品標準號：q/adpg001-2008；其余藥物均購自龍巖市第一醫(yī)院，質(zhì)量符合中華人民共和國獸藥典標準。以上4味方劑按比例配比，采用傳統(tǒng)水煎法：蒸餾水預行浸泡2小時，加熱煎煮2次，第1次保持微沸30min，濾出藥液；藥渣加溫水再煮沸，仍保持微沸30分鐘，濾出藥液；合并兩次濾液，小火濃縮至1g/ml（按照生藥量計算）。

1.1.3試驗儀器

光學顯微鏡te2000-u。

1.2試驗方法

1.2.1給藥方法及給藥量

采用飲水方式給藥，每只小鼠的日飲藥量（g）根據(jù)體表面積折算動物的等效劑量的2倍計算，即飲藥量為1.8ml/只*天。

1.2.2動物分組

將200只小鼠隨機分成10組，每組4個重復，每個重復5只。1～5組用于研究3個銀杏葉復方制劑對正常小鼠血液學指標、臟器指數(shù)等影響，其中組1和組2分別為空白組和四君子湯組，其余3組分別為3種銀杏葉復方制劑組；6～10組用于研究中藥對cy所致免疫抑制小鼠的血液學指標、臟器指數(shù)的影響，其中組6和組7分別為cy組和四君子湯＋cy組，其余3組分別為3種不同的銀杏葉復方制劑＋cy組。第2-5組每晚給予相應的中藥，1.8ml/只，第1組則給予等量的蒸餾水，連續(xù)15天；第7-10組小鼠給藥方式及給藥量同前，從飲藥的第2天開始，以75mg/kg的劑量進行腹腔注射環(huán)磷酰胺，隔日1次，共注射7次，期間正常給中藥至停止注射cy第2天，第6組飲服蒸餾水，腹腔注射cy。

1.3測定指標與方法

1.3.1體重增重率的測定

開始試驗時，先對每1只小鼠進行空腹（禁食禁水12小時）稱重；實驗結(jié)束后（第15天）再對每1只小鼠進行空腹稱重。

1.3.2血常規(guī)的測定

第15天對小鼠禁食禁水12小時，次日上午從每個重復組隨機取5只小鼠，眼眶采血，保存于edta抗凝管中，暫時存放于4℃冰箱中，當日送檢，檢測血常規(guī)。

1.3.3肝脾指數(shù)的測定

第15天對小鼠禁食禁水12小時，次日上午對每只小鼠進行解剖，取肝臟、脾臟。肝臟、脾臟上的脂肪要完全剝離，稱重。對應其體重，用此公式進行計算：脾臟指數(shù)=脾臟重量/體重；肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重。

1.3.4切片的制作和觀察

將采血后的小鼠的肝和脾用10%甲醛固定，光鏡下進行組織病理學檢查。

1.4數(shù)據(jù)處理

應用統(tǒng)計軟件spss16.0進行單因素方差分析（one-wayanova)和duncan氏多重比較，所有數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。

2、結(jié)果與分析

2.1銀杏葉復方對正常小鼠血液學指標的影響

銀杏葉復方對正常小鼠血液學指標的影響見表1。結(jié)果顯示，與空白組相比，3種復方對健康小鼠的血液學指標無顯著影響（p＞0.05）；除了wbc，四君子湯對正常小鼠其余的血液學指標亦無顯著影響（p＞0.05），說明3種復方對正常小鼠的血液學指標無不良影響，優(yōu)于四君子湯。

表1銀杏葉復方對正常小鼠血液學指標的影響

注：表中同列上標不同小寫字母表示差異顯著（p＜0.05），上標不同大寫字母表示差異極顯著（p＜0.01），上標字母相同或無上標表示差異不顯著（p＞0.05）。

2.2銀杏葉復方對正常小鼠體重增重率及臟器指數(shù)的影響

從表2可以看出，各組小鼠的體重增重率差異均不顯著（p＞0.05）；就小鼠的脾臟指數(shù)而言，復方ⅰ、復方ⅱ與四君子湯組和空白組無顯著差異；而對于肝臟指數(shù)，四君子湯組顯著低于空白組（p＜0.05），極顯著或顯著低于各復方組（p＜0.01或p＜0.05），復方ⅰ和復方ⅲ則與空白組相比無顯著差異（p＞0.05）。以上結(jié)果表明四君子湯組和3種銀杏葉復方制劑對健康小鼠的體重變化和脾臟指數(shù)無不良影響，復方ⅰ和復方ⅲ對健康小鼠的肝臟指數(shù)無不良影響，四君子湯組能引起健康小鼠的肝臟指數(shù)發(fā)生變化。

表2銀杏葉復方對正常小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

2.3銀杏葉復方對環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠血液學指標的影響

表3銀杏葉復方對環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠血液學指標的影響

銀杏葉復方對免疫抑制小鼠血液學指標的影響見表3。結(jié)果顯示，3種銀杏葉復方制劑+cy組的wbc極顯著低于空白組（p＜0.01）；3種銀杏葉復方制劑+cy組的rbc、mch、mcv三項指標與空白組相比差異不顯著（p＞0.05）；復方ⅲ+cy組的hgb、hct兩項指標顯著低于空白組（p＜0.05），復方ⅰ+cy組、復方ⅱ+cy組與空白組相比差異不顯著（p＞0.05）；四君子湯+cy組的wbc、rbc兩項指標極顯著低于空白組（p＜0.01），hct顯著低于空白組（p＜0.05），mcv顯著高于空白組（p＜0.05），rbc、mch兩項與空白組相比顯示差異不顯著（p＞0.05）。以上結(jié)果表明，6項血液指標中，除wbc外，復方ⅰ和復方ⅱ對免疫抑制小鼠部分血液學指標有恢復作用，四君子湯組對免疫抑制小鼠的血液學指標無明顯恢復作用。

2.4銀杏葉復方對環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠體重增重率及臟器指數(shù)的影響

從表4可以看出，注射cy后，各組小鼠體重增重率較空白組均顯著下降（p＜0.01），但3種復方制劑中以復方ⅰ的體重增重率最高，與四君子湯效果相當。就肝、脾指數(shù)而言，各組的肝臟指數(shù)差異不顯著（p＞0.05），四君子湯組和3種復方組的脾臟指數(shù)極顯著低于空白組（p＜0.01），但復方ⅱ+cy的脾臟指數(shù)較四君子湯+cy組顯著提高（p＜0.01），復方ⅰ與四君子湯組之間差異不顯著（p＞0.05）。以上結(jié)果顯示復方ⅰ和復方ⅱ在恢復對cy所致的免疫抑制小鼠體重下降率及臟器的指數(shù)變化方面優(yōu)于或與四君子湯相當。

表4銀杏葉復方對環(huán)磷酰胺所致的免疫抑制小鼠體重增重率及臟器指數(shù)的影響

2.5銀杏葉復方對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠肝脾組織病理學的影響

經(jīng)采血后的小鼠進行處死解剖取肝臟、脾臟，可明顯觀察到凡注射過cy的小鼠，脾臟均有不同程度的萎縮，肝臟及其他臟器未見明顯肉眼可見病變。對肝和脾進行組織病理學檢查可見，空白組小鼠肝細胞板完整，排列規(guī)則，細胞核大而深染，未見明顯病變（見圖1），脾組織中的白髓大而明顯（見圖2）；空白+cy組的肝細胞核濃染（核濃縮），有的細胞核已消失（見圖3），紅白髓界限不明顯，脾小梁密集（見圖4）；四君子湯組肝臟細胞個別出現(xiàn)核濃縮甚至核消失（見圖5），脾臟白髓小（見圖6）；四君子湯+cy組的肝細胞出現(xiàn)細胞腫脹（見圖7），脾臟紅白髓界限不明顯，脾小梁密集（見圖8）；復方ⅰ組與復方ⅰ+cy組小鼠肝細胞板完整，排列規(guī)則，細胞核大而深染，胞質(zhì)染色均勻，肝組織未見明顯病變（分別見圖9、圖11）；脾組織中的白髓大而明顯（分別見圖10、圖12）。復方ⅱ組肝細胞板完整，排列規(guī)則，細胞核大而深染，胞質(zhì)染色均勻，肝組織未見明顯病變（見圖13），脾臟白髓界限不明顯且小，脾小梁密集（見圖14）；復方ⅱ+cy組肝臟，細胞核較正常細胞核不同（核內(nèi)物質(zhì)附著于核膜上），局部有輕微的細胞腫脹（見圖15）；脾臟白髓大但界限不明顯（見圖16）。復方ⅲ組肝細胞板完整，排列規(guī)則，細胞核大而深染，胞質(zhì)染色均勻，肝組織未見明顯病變（見圖17），脾臟白髓大小不一且界限不明顯（見圖18）；復方ⅲ+cy組肝臟可見輕微的細胞腫脹（見圖19）；白髓界限明顯但?。ㄒ妶D20）。

3、討論

3.1藥理研究的意義在于觀察藥物對病理過程的干預，因此首先需要造模。cy是一種細胞毒性藥物，同時也屬于烷化劑類免疫抑制劑，其作用主要是破壞dna的結(jié)構(gòu)，它能殺死有絲分裂和進入循環(huán)周期的細胞，具有較強的免疫抑制作用，故在免疫學研究中，常以cy作為細胞免疫、體液免疫中的免疫抑制模型的制備藥物。

本試驗采用cy作為免疫抑制劑，對四君子湯及3個銀杏葉復方對小鼠肝脾指數(shù)、體重增重率、血細胞變化情況進行了研究。研究顯示3種銀杏葉復方對正常小鼠的血液學指標無不良影響，優(yōu)于四君子湯；四君子湯和3種銀杏葉復方制劑對健康小鼠的體重變化和脾臟指數(shù)沒有不良影響，復方ⅰ和復方ⅲ對健康小鼠的肝臟指數(shù)沒有不良影響，四君子湯組能引起健康小鼠的肝臟指數(shù)發(fā)生變化；復方ⅰ和復方ⅱ對免疫抑制小鼠部分血液學指標有恢復作用，四君子湯組對免疫抑制小鼠的血液學指標無明顯恢復作用；復方ⅰ和復方ⅱ在恢復對cy所致的免疫抑制小鼠體重下降率及臟器的指數(shù)變化方面優(yōu)于或與四君子湯相當。體重是一個直觀、易考察的指標，且與多種因素密切相關(guān)，加之組織病理切片的佐證，我們認為，本試驗中復方ⅰ的免疫增強作用最好，可用于進一步的分析研究。

3.2對采血后的小鼠進行剖檢，凡注射過cy的小鼠脾臟大都有不同程度的萎縮，但肝臟及其他臟器未見明顯肉眼可見病變。與空白組相比，空白組+cy的肝臟指數(shù)與之差異不顯著，脾臟指數(shù)差異極顯著，數(shù)值上顯示空白+cy組小鼠脾臟萎縮（切片觀察顯示脾小梁密集）；就四君子湯+cy組，肝臟指數(shù)與空白組差異不顯著，脾臟指數(shù)極顯著低于空白組（切片觀察顯示肝臟細胞腫脹，脾臟脾小梁密集）；復方ⅰ+cy組與空白組比較，肝臟指數(shù)之間差異顯示不顯著，脾臟指數(shù)之間顯示差異極顯著（切片觀察未見明顯異常）；復方ⅱ+cy與空白組相比較，肝臟指數(shù)之間差異顯示不顯著，脾臟指數(shù)之間顯示差異極顯著（切片觀察顯示肝細胞出現(xiàn)腫脹）；復方ⅲ+cy與空白組相比較，肝臟指數(shù)顯示差異不顯著，脾臟指數(shù)顯示差異極顯著（切片觀察可見肝細胞出現(xiàn)腫脹，脾臟白髓?。?。組織形態(tài)學的變化進一步佐證了復方ⅰ對肝脾的損傷具有較好的保護作用。

3.3給小鼠喂藥傳統(tǒng)的方法是灌胃，試驗中小鼠會因人為操作不慎受傷，另反復捉拿刺激，造成精神狀態(tài)不佳，加之藥液黏稠更增加了灌胃難度。本試驗參考劉翠艷等提出的飲水中加藥的方法，即根據(jù)小鼠“晝伏夜出”的特點，選擇晚上活動時間，在小鼠干渴狀態(tài)下飲藥。這種給藥方式需預先摸索小鼠的全天飲水量，然后斷水4h后給藥，小鼠飲完藥液后再及時補充足夠的清水。用此方法，飲藥組除了第1d需要適應藥液的口味外，不會出現(xiàn)意外傷亡。該方法不但能減少人力和操作時間，而且可以避免應激和對消化道造成的機械性損傷。

4、結(jié)論

試驗結(jié)果顯示，3種銀杏葉復方對正常小鼠的血液學指標無不良影響，優(yōu)于四君子湯；四君子湯和3種銀杏葉復方制劑對健康小鼠的體重變化和脾臟指數(shù)無不良影響，復方ⅰ和復方ⅲ對健康小鼠的肝臟指數(shù)沒有不良影響；復方ⅰ和復方ⅱ對免疫抑制小鼠部分血液學指標有恢復作用；復方ⅰ和復方ⅱ在恢復對cy所致的免疫抑制小鼠體重下降率及臟器的指數(shù)變化方面優(yōu)于或與四君子湯相當。病理組織切片顯示，復方ⅰ組與復方ⅰ+cy組的肝脾都未見明顯病變，而四君子湯組、四君子湯+cy組肝脾都有不同程度的病變，復方ⅱ組、復方ⅱ+cy組的脾臟都有不同程度的病變，復方ⅲ次之。綜合血液學指標變化、體重增重率、臟器指數(shù)及組織病理學變化等各項指標認為，復方ⅰ較優(yōu)，甚至優(yōu)于四君子湯，可選定為后續(xù)試驗的研究對象。