本發(fā)明屬于中藥制劑領(lǐng)域，具體地說，涉及一種中藥復(fù)方制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤和“三高”如今已是威脅人類生命健康的常見疾病。多年來,惡性腫瘤的治療手段保持著以手術(shù)為主、輔以全身的化療和局部放療的綜合治療模式，但往往不能完全有效地治愈腫瘤?！叭摺笔歉哐?、高血壓、高血糖的總稱，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱之為代謝綜合癥，屬于高發(fā)慢性非傳染性疾病。在我國，“三高”更是以其高患病率、高危險性、高醫(yī)療費(fèi)用著稱。醫(yī)學(xué)界眾多專家指出，提高自身免疫力是防治腫瘤、預(yù)防“三高”等疾病發(fā)生發(fā)展的最佳方法。
近些年來,中藥及其復(fù)方制劑已經(jīng)通過多種不同途徑、多種方式應(yīng)用于抗腫瘤和治療“三高”臨床中,并起到了獨(dú)特的作用。中藥復(fù)方制劑內(nèi)包括數(shù)種、甚至是幾十種生物活性的成分,因而可達(dá)到比較全面、廣泛的治療和預(yù)防作用。
天麻、酸棗仁、蛹蟲草和破壁靈芝孢子粉都是常見的中藥材原料，天麻是蘭科天麻屬多年生草本植物天麻(gastrodiaelatabl.)的干燥根莖。酸棗仁為鼠李科植物酸棗(ziziphusjujubamill)的干燥成熟種子。蛹蟲草是麥角菌科蟲草屬的模式種，學(xué)名為cordycepsmilitaris，又名北冬蟲夏草、北蟲草等。靈芝是多孔菌科真菌靈芝(ganodermalucidumkarst)的子實(shí)體，破壁靈芝孢子粉是靈芝的破壁孢子粉。天麻、酸棗仁、蛹蟲草和破壁靈芝孢子粉單獨(dú)使用時分別具備不同的性味、歸經(jīng)，同時也被使用于不同的中藥復(fù)方制劑中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種中藥復(fù)方制劑，該復(fù)方制劑具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)三高、增強(qiáng)免疫力、改善睡眠的功效。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述中藥復(fù)方制劑的制備方法。該方法對中藥材中的有效成分進(jìn)行有針對性的提取純化，從而實(shí)現(xiàn)較高的提取率和較佳功效。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種中藥復(fù)方制劑，由下列重量份的中藥原料藥制成：天麻1～3份，酸棗仁5～7份，蛹蟲草1～3份，破壁靈芝孢子粉1～2份。
優(yōu)選地，本發(fā)明所提供的中藥復(fù)方制劑，由下列重量份的中藥原料藥制成：天麻2份，酸棗仁5份，蛹蟲草2份，破壁靈芝孢子粉1份。
一種中藥復(fù)方制劑的制備方法，包含如下步驟：(1)稱取下列重量份的中藥原料藥：天麻1～3份、酸棗仁5～7份、蛹蟲草1～3份和破壁靈芝孢子粉1～2份，分別粉碎至粉末狀；(2)取天麻粉末，以60～90％的乙醇加熱回流提取，過濾取上清液，冷凍干燥得到天麻提取物粉末；(3)取酸棗仁粉末，以30～50％的乙醇加熱回流提取，將提取液趁熱過濾后加入60～80％的乙醇加熱回流提取，再次將提取液趁熱過濾后加入60～80％的乙醇加熱回流提取，過濾，將三次提取液合并濃縮，依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯的萃取物濃縮后經(jīng)大孔樹脂柱分離純化，冷凍干燥得到酸棗仁提取物粉末；(4)取蛹蟲草粉末，以水加熱回流提取，過濾后取上清液，冷凍干燥得到蛹蟲草提取物粉末；(5)將破壁靈芝孢子粉與制得的天麻提取物粉末、酸棗仁提取物粉末、蛹蟲草提取物粉末混合，加入適量淀粉和硬脂酸鎂裝入膠囊。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，步驟(2)中在50±2℃下加熱回流3次，每次2小時。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，步驟(3)中三次加熱回流的溫度和時間依次分別為：75±2℃下加熱回流提取2小時；60±2℃下加熱回流提取1小時；50±2℃下加熱回流提取1小時。根據(jù)本發(fā)明的采用不同溫度梯度的三次加熱回流提取步驟，可在較短時間(共4小時)和較低溫度下實(shí)現(xiàn)對酸棗仁中的有效成分酸棗仁皂苷a的高提取率。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，步驟(3)中先將酸棗仁粉末過80目篩后再進(jìn)行提取，以達(dá)到進(jìn)一步提高酸棗仁中酸棗仁皂苷a的提取率的目的。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，步驟(3)中將三次提取液合并后，放置于0-4℃的環(huán)境中冷卻。在三次加熱回流提取操作中，某些皂苷成分已在熱醇中溶解，在0-4℃的環(huán)境中，這些溶解在醇提液中的其他皂苷析出，而酸棗仁皂苷a不會在此溫度下析出，借此達(dá)到了分離作用，提高了酸棗仁提取物以及中藥復(fù)方制劑中酸棗仁皂苷a的含量。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，步驟(3)中的大孔樹脂為d101大孔樹脂。文獻(xiàn)中多用硅膠柱分離純化酸棗仁有效成分，本發(fā)明沒有使用硅膠柱，而是選擇了d101大孔樹脂，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用d101大孔樹脂對酸棗仁醇提物進(jìn)行分離純化，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脫，選擇收集50％的乙醇洗脫流分，減壓蒸餾濃縮，能夠高選擇性地提高酸棗仁提取物及中藥復(fù)方制劑中酸棗仁皂苷a的純度，減小其他皂苷類物質(zhì)對藥效作用的影響。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法的步驟(3)中，經(jīng)大孔樹脂柱分離純化后，還可以進(jìn)一步進(jìn)行反相柱層析，丙酮-水梯度洗脫，收集50％和70％丙酮-水洗脫的流分，減壓蒸餾濃縮，由此可以進(jìn)一步提高酸棗仁提取物及中藥復(fù)方制劑中酸棗仁皂苷a的純度。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法的步驟(3)中，反相柱層析后，還可以進(jìn)一步用葡聚糖凝膠柱分離，由此可以進(jìn)一步提高酸棗仁提取物及中藥復(fù)方制劑中酸棗仁皂苷a的純度。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，步驟(4)中在60±2℃下加熱回流提取3次，每次4小時。
在上述中藥復(fù)方制劑的制備方法中，將破壁靈芝孢子粉與制得的天麻提取物、酸棗仁提取物、蛹蟲草提取物混合后，裝入膠囊，制得中藥復(fù)方制劑膠囊劑。
本發(fā)明通過將天麻、酸棗仁、蛹蟲草的提取物粉末與破壁靈芝孢子粉混合，獲得了一種同時具有抗腫瘤、抑制“三高”、提高免疫力、改善睡眠功效的中藥復(fù)方制劑。此外，本發(fā)明還提供了該種中藥復(fù)方制劑的制備方法，該方法通過對天麻、酸棗仁和蛹蟲草提取工藝的優(yōu)化和改進(jìn)，有效提高了酸棗仁皂苷a的提取率和含量，且利用酸棗仁皂苷a與破壁靈芝孢子粉、以及天麻提取物、蛹蟲草提取物之間的協(xié)同作用，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了抗腫瘤、抑制“三高”、提高免疫力、改善睡眠的藥用功效的提高。
具體實(shí)施方式
本說明書中，如無特殊說明，“份”指重量份；“％”為重量百分比。
(一)中藥復(fù)方制劑實(shí)施例
1.1中藥復(fù)方制劑1
由下列重量份的中藥原料藥制成：天麻300克，酸棗仁700克，蛹蟲草300克，破壁靈芝孢子粉180克。(天麻購自云南昭通；酸棗仁購自河南禹州；蛹蟲草購自安徽金寨；破壁靈芝孢子粉購自安徽金寨；以下各實(shí)施例中相同)
制備方法：將天麻、酸棗仁和蛹蟲草分別按照2.1、2.2.1、2.3提取試驗(yàn)例中的步驟進(jìn)行提取，然后將得到的天麻提取物、酸棗仁提取物、蛹蟲草提取物與破壁靈芝孢子粉混合，裝入膠囊，即制得中藥復(fù)方膠囊劑。
1.2中藥復(fù)方制劑2
由下列重量份的中藥原料藥制成：天麻100克，酸棗仁500克，蛹蟲草200克，破壁靈芝孢子粉100克。
制備方法：將天麻、酸棗仁和蛹蟲草分別按照2.1、2.2.2、2.3提取試驗(yàn)例中的步驟進(jìn)行提取，然后將得到的天麻提取物、酸棗仁提取物、蛹蟲草提取物與破壁靈芝孢子粉混合，制成片劑，即制得中藥復(fù)方片劑。
1.3中藥保健復(fù)方制劑3
由下列重量份的中藥原料藥制成：天麻200克，酸棗仁600克，蛹蟲草100克，破壁靈芝孢子粉200克。
制備方法：將天麻、酸棗仁和蛹蟲草分別按照2.1、2.2.3、2.3提取試驗(yàn)例中的步驟進(jìn)行提取，然后將得到的天麻提取物、酸棗仁提取物、蛹蟲草提取物與破壁靈芝孢子粉混合，制成顆粒劑，即制得中藥復(fù)方顆粒劑。
(二)提取試驗(yàn)例
提取中采用的儀器均為中藥材提取分析實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器；所用試劑均為分析純。
2.1天麻提取
天麻藥材粉碎后過80目篩，置于具塞錐形瓶中，加入6倍量的70％乙醇，在50℃下加熱回流提取3次，每次2小時。合并提取液，濃縮，冷凍干燥后得到天麻提取物。
2.2酸棗仁提取
2.2.1提取方法1
取酸棗仁進(jìn)行機(jī)械破碎后再過80目篩成粉，加入7倍量的40％乙醇，在75℃下加熱回流提取2小時；將提取液趁熱過濾后加入5倍量的80％乙醇，60℃下加熱回流提取1小時；將提取液趁熱過濾，再次加入5倍量的80％乙醇，在50℃下加熱回流提取1小時；將三次的提取液合并、放置于0-4℃的環(huán)境中冷卻。過濾除去沉淀，將上清液濃縮后用少量水混懸，加入石油醚萃取，除去石油醚萃取液，接著用乙酸乙酯萃取，得到酸棗仁的乙酸乙酯萃取物。將酸棗仁的乙酸乙酯萃取物濃縮后經(jīng)d101大孔樹脂進(jìn)行層析，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脫，收集50％的乙醇洗脫部分得酸棗仁提取物，將酸棗仁提取物冷凍干燥制得粉末。
2.2.2提取方法2
取酸棗仁進(jìn)行機(jī)械破碎后再過80目篩成粉，加入5倍量的30％乙醇，在75℃下加熱回流提取2小時；將提取液趁熱過濾后加入5倍量的60％乙醇，60℃下加熱回流提取1小時；將提取液趁熱過濾，再次加入5倍量的60％乙醇，在50℃下加熱回流提取1小時；將三次的提取液合并、放置于0-4℃的環(huán)境中冷卻。過濾除去沉淀，將上清液濃縮后用少量水混懸，加入石油醚萃取，除去石油醚萃取液，接著用乙酸乙酯萃取，得到酸棗仁的乙酸乙酯萃取物。將酸棗仁的乙酸乙酯萃取物濃縮后經(jīng)d101大孔樹脂進(jìn)行層析，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脫，收集50％的乙醇洗脫部分得酸棗仁提取物，將酸棗仁提取物冷凍干燥制得粉末。
2.2.3提取方法3
取酸棗仁進(jìn)行機(jī)械破碎后再過80目篩成粉，加入5倍量的30％乙醇，在75℃下加熱回流提取2小時；將提取液趁熱過濾后加入5倍量的60％乙醇，60℃下加熱回流提取1小時；將提取液趁熱過濾，再次加入5倍量的60％乙醇，在50℃下加熱回流提取1小時；將三次的提取液合并、放置于0-4℃的環(huán)境中冷卻。過濾除去沉淀，將上清液濃縮后用少量水混懸，加入石油醚萃取，除去石油醚萃取液，接著用乙酸乙酯萃取，得到酸棗仁的乙酸乙酯萃取物。將酸棗仁的乙酸乙酯萃取物濃縮后經(jīng)d101大孔樹脂進(jìn)行層析，依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇梯度洗脫，收集50％的乙醇洗脫部分。
接著，將收集的50％的乙醇洗脫部分濃縮，進(jìn)行反相柱層析，依次用30％、50％、70％丙酮-水梯度洗脫，收集50％丙酮-水洗脫的流分，減壓蒸餾進(jìn)行濃縮。然后，將濃縮物通過葡聚糖凝膠柱(sephadexlh-20)分離，甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，收集50％甲醇-水洗脫液，冷凍干燥制得酸棗仁提取物粉末。
2.3蛹蟲草提取
將蛹蟲草子實(shí)體用中藥粉碎機(jī)粉碎后過80目篩成粉，加入14倍量水，在60℃下加熱回流提取3次，每次4小時。合并提取液，濃縮，冷凍干燥后得到蛹蟲草提取物粉末。
(三)酸棗仁皂苷a含量測定
3.1儀器與試藥
dionex-u3000高效液相色譜儀；dionex-vw3100紫外檢測器；advantage系列超純水機(jī)(美國pall)；bs124s電子分析天平(德國sartorius)；sb-12dt超聲波清洗儀(寧波新芝生物儀器廠產(chǎn)品)。酸棗仁皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,供含量測定用)。其他所用試劑均為分析純。
3.2方法與結(jié)果
3.2.1酸棗仁皂苷a的含量測定
3.2.1.1色譜條件色譜柱為
3.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取酸棗仁皂苷a對照品5.1mg,置10ml量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,備用。精密移取該溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分別置2ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成不同濃度的對照品系列溶液,用0.45μm微孔濾膜過濾,進(jìn)樣20μl。以峰面積a對濃度c(mg/ml)進(jìn)行線性回歸,線性方程為a＝15.937c-0.237,r＝0.9999(n＝5),結(jié)果表明,在0.049～0.311mg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
3.2.1.3樣品溶液的制備將2.2中制備得到的酸棗仁提取物用甲醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中,定容,搖勻后作為測試液,進(jìn)行含量測定。
3.2.1.4酸棗仁顆粒中酸棗仁皂苷a提取率的計(jì)算用高效液相色譜法測定樣品溶液中酸棗仁皂苷a的含量,并計(jì)算酸棗仁顆粒中酸棗仁皂苷a的提取率。
酸棗仁皂苷a提取率＝(藥液中酸棗仁皂苷a的量×總藥液量/總藥材量)×100％
根據(jù)上述計(jì)算方法，對1.1-1.3中制備的中藥復(fù)方制劑1-3中酸棗仁皂苷a的提取率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如下：
表1中藥復(fù)方制劑1-3的酸棗仁皂苷a提取率
由上表可以看出，通過酸棗仁提取工藝的改進(jìn)和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對酸棗仁皂苷a較高的提取率，從而有助于提高酸棗仁皂苷a與該中藥復(fù)方制劑中其他提取物成分之間的協(xié)同藥效作用。
(四)中藥復(fù)方制劑的藥效研究
4.1抗腫瘤活性
采用mtt法研究1.1-1.3中制備得到的中藥復(fù)方制劑對人體hepg2，mcf-7和hela癌細(xì)胞株系的細(xì)胞毒性。
4.1.1、實(shí)驗(yàn)材料
4.1.1.1儀器及設(shè)備
超凈工作臺(吳縣實(shí)驗(yàn)動物器材廠)恒溫co2培養(yǎng)箱(德國heraeus)96孔培養(yǎng)板(nunclon)酶標(biāo)儀(tecansunrise)倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)全自動雙蒸水機(jī)(上海玻璃儀器一廠)超速離心機(jī)optimaxl-100k(貝克曼公司)。
4.1.1.2試劑
rpmi1640培養(yǎng)基(gibco)；胰蛋白酶(sigma)；胎牛血清(hyclone)；mtt(sigma)；dmso(sigma)。
4.1.1.3細(xì)胞株及培養(yǎng)
人乳腺癌細(xì)胞株(mcf-7)、人子宮癌細(xì)胞株(hela)和人肝癌細(xì)胞株(hepg2)(均由北京協(xié)和藥物所提供)培養(yǎng)于rpmi1640培養(yǎng)基中，含10％小牛血清，37℃，5％co2。
4.1.2、實(shí)驗(yàn)部分
4.1.2.1實(shí)驗(yàn)原理
mtt比色法是一種經(jīng)典的檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞礬(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法己廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。
4.1.2.2實(shí)驗(yàn)過程
分別取處于對數(shù)生長期的貼壁人乳腺癌細(xì)胞株(mcf-7)、人子宮癌細(xì)胞株(hela)、人肝癌細(xì)胞株(hepg2)，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基配成5000個/ml的細(xì)胞懸液，以8×103個/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種200μl，37℃，5％co2培養(yǎng)24小時。設(shè)置一系列不同濃度，同時對照組換含有等體積的pbs培養(yǎng)基，每組設(shè)3平行孔，37℃，5％co2培養(yǎng)2天。1500r/min離心，棄去上清液，每孔加入5mg/ml新鮮配置的含mtt工作液20μl，37℃，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。小心棄去上清液，用胰酶消化后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲臜沉淀，用微型超聲震蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長為490nm測定光密度值。按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率＝(1-藥物組a490值/對照組a490)×100％。然后求得該化合物的半數(shù)殺傷濃度ic50。
4.1.3、結(jié)果
經(jīng)過初步的細(xì)胞毒活性測試，計(jì)算得1.1-1.3中制備的中藥復(fù)方制劑對人乳腺癌細(xì)胞株(mcf-7)、人子宮癌細(xì)胞株(hela)、人肝癌細(xì)胞株(hepg2)的ic50分別如下。提示本發(fā)明的中藥復(fù)方制劑對人乳腺癌細(xì)胞株(mcf-7)、人子宮癌細(xì)胞株(hela)、人肝癌細(xì)胞株(hepg2)具有良好的抑制活性，可用于乳腺癌、子宮癌、肝癌的防治。
表2中藥復(fù)方制劑1-3的抗腫瘤活性(n＝8)
4.2糖、脂代謝信號通路影響
4.2.1.材料與方法：
4.2.1.1實(shí)驗(yàn)藥物：本發(fā)明中藥復(fù)方制劑1-3(1.1-1.3中制備)。
4.2.1.2實(shí)驗(yàn)動物：wistar大鼠購自上海斯萊克動物有限公司。
4.2.1.3造模方法：健康雄性wistar大鼠(2周齡)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取20只大鼠作為nor組(正常對照)，其余大鼠喂養(yǎng)高脂飼料和基礎(chǔ)飼料的混合料，2周后改為完全高脂飼料，喂養(yǎng)6周后，腹腔注射鏈脲佐菌素(25mg/kg體重)，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，4周后斷尾采血測血糖，選血糖異常者(血糖>16.7mmol/l)繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料2周，復(fù)核血糖后進(jìn)入分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物，基礎(chǔ)飼料及定制的高脂飼料均由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
4.2.1.4實(shí)驗(yàn)步驟：①2型糖尿病大鼠造模成功后，選擇體重相近的大鼠開始實(shí)驗(yàn)。整個實(shí)驗(yàn)期間，所有糖尿病大鼠均給予高脂飼料。②將大鼠分為4組(中藥復(fù)方制劑組1-3/糖尿病模型對照)，灌胃，每日一次；給藥組大鼠每日藥量按每公斤體重以人體每日用藥量為基數(shù)，根據(jù)換算系數(shù)進(jìn)行計(jì)算(換算系數(shù)確定為15)。③每周記錄大鼠生長情況一次。④干預(yù)時間為4周。⑤每組隨機(jī)選取大鼠20只，禁食12h后，用3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。⑥分別在大鼠0min和灌服葡萄糖負(fù)荷(2g/kg)后5min，10min,15min時間點(diǎn)取全血各1ml，按照試劑盒要求采集樣本，分離血清，-70℃低溫冰箱保存，統(tǒng)一檢測相關(guān)指標(biāo)。⑦每組隨機(jī)選取大鼠10只，禁食12h后，用3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，分離胰腺，液氮罐保存。勻漿后檢測pdx-1表達(dá)。⑧隨機(jī)選取每組大鼠5只進(jìn)行葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。⑨sgnfm-01組和模型組每組隨機(jī)選取大鼠3只，選取血液和肝臟組織，提取總rna，進(jìn)行affymetrix230基因表達(dá)譜芯片檢測。
4.2.1.5觀察指標(biāo)：大鼠血糖檢測(羅氏advandge)，胰島細(xì)胞內(nèi)pdx-1因子檢測(rt-pcr法)，血清胰島素、glp-1檢測(elisa法)，基因表達(dá)譜芯片檢測。
4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
表3中藥復(fù)方制劑1-3影響的信號通路
通過對糖尿病大鼠肝臟組織和血液組織的基因表達(dá)譜檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)本發(fā)明的中藥復(fù)方制劑治療后，肝臟組織和血液組織的基因表達(dá)譜中共520個基因表達(dá)發(fā)生變化，其中302個基因表達(dá)上調(diào)，218個基因表達(dá)下調(diào)。通過go分析，發(fā)現(xiàn)差異基因重點(diǎn)參與代謝過程。通過基因芯片信號通路的分析可以看出，共有89條信號通路與影響糖、脂代謝機(jī)制有關(guān)，其中胰島素分泌、脂肪酸代謝通路、tnf信號通路等均參與“三高”疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。由此可見，本發(fā)明的中藥復(fù)方制劑能顯著影響多個差異基因的表達(dá)和多條通路的調(diào)節(jié)，有效提高自身免疫力、抑制“三高”疾病。
4.3改善睡眠活性試驗(yàn)
4.3.1.材料與方法
4.3.1.1樣品：本發(fā)明的中藥復(fù)方制劑1-3(1.1-1.3中制備)。
4.3.1.2實(shí)驗(yàn)動物：spf級ci/f1代健康雌性小鼠，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。
4.3.1.3造模方法：40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組，每組10只，進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)。
4.3.1.4實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
四組動物連續(xù)灌胃一個月，在末次給藥15min后，各組動物按40mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射量為10mg/kg，以小鼠翻正消失1min為睡眠指標(biāo)，觀察樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時間。比較對照組與實(shí)驗(yàn)組睡眠時間延長之間的差異，睡眠時間延長有顯著性，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。
4.3.2試驗(yàn)結(jié)果
本發(fā)明中藥復(fù)方制劑對延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響
經(jīng)口給予小鼠不同劑量的本發(fā)明中藥復(fù)方制劑一個月，腹腔注射戊巴比妥鈉，觀察小鼠的睡眠時間。由表4結(jié)果可見，本發(fā)明的三個試驗(yàn)組小鼠睡眠時間顯著長于對照組(p＜0.05)。
表4中藥復(fù)方制劑對延長戊巴比妥納誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響(n＝10)
由以上結(jié)果可知，本發(fā)明的中藥復(fù)方制劑1-3與對照組相比，均能顯著改善睡眠。