本發(fā)明涉及自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)：

正常關(guān)節(jié)軟骨為透明質(zhì)軟骨，是一種具有很強(qiáng)耐受力且結(jié)構(gòu)單一的組織。由各種不同類型的病因所致的骨關(guān)節(jié)損傷或軟骨缺損為骨傷科常見病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬和功能障礙，并可逐漸發(fā)生退行性變。其中膝關(guān)節(jié)軟骨損傷為骨關(guān)節(jié)損傷中的常見病。膝關(guān)節(jié)軟骨損傷在世界范圍內(nèi)是相當(dāng)普遍的，有外國學(xué)者統(tǒng)計(jì)，在做膝關(guān)節(jié)鏡檢查的患者中，有60％以上存在關(guān)節(jié)軟骨損傷。由于沒有神經(jīng)及血管組織，軟骨的營養(yǎng)主要依靠從滑膜分泌的滑液中攝取。但由于蛋白多糖合成受到抑制，膠原纖維受到破壞，使軟骨喪失其彈關(guān)節(jié)軟骨損傷機(jī)制性，增加了液壓滲透性而使軟骨細(xì)胞承受的壓應(yīng)力增高，導(dǎo)致分解酶增加，滑潤作用下降而致關(guān)節(jié)軟骨表面破壞。損傷后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞因?yàn)槠浯x緩慢，很難自行修復(fù)，即使比較小的軟骨損傷也可能產(chǎn)生比較顯著的癥狀，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)的退行性改變。

關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)受患者年齡、受損部位、缺損范圍、深度、關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性、受傷的程度等多方面影響。自體軟骨細(xì)胞移植適合于急性或慢性創(chuàng)傷導(dǎo)致的僅涉及到軟骨面而軟骨下骨完整的損傷。該方法對于中小面積軟骨損傷患者在緩解疼痛和改善功能方面具有較好療效。與其他方法如微骨折法相比，自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)可以產(chǎn)生較多的透明軟骨樣修復(fù)組織，且具有更好的臨床效果，該技術(shù)已經(jīng)成為治療膝關(guān)節(jié)軟骨病變的最重要的手術(shù)方法之一。但此手術(shù)涉及到包被和粘縫，增加了手術(shù)的復(fù)雜性；第三代自體軟骨細(xì)胞移植具有支架材料，外源材料會出現(xiàn)生物相容性的問題；會出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥；同時(shí)由于自體軟骨細(xì)胞會貼壁，導(dǎo)致部分軟骨細(xì)胞的去分化從而生成纖維軟骨，但仍未能理想的對軟骨缺損區(qū)以持續(xù)穩(wěn)定的方式行透明軟骨修復(fù)，從而無法較好地恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨良好的生物力學(xué)性能。

并且，自體透明軟骨(lhcg)之所以能夠治療膝關(guān)節(jié)損傷主要是自體透明軟骨填充了膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，在向動物體內(nèi)移植時(shí)，只有活細(xì)胞及其分泌的蛋白多糖鈣和ii型膠原。機(jī)械強(qiáng)度介于目前產(chǎn)品與天然軟骨之間，是一個(gè)相對軟的、海綿狀的狀態(tài)，能夠和周圍的軟骨組織很好的共同生長，移植動物體內(nèi)2個(gè)月左右時(shí)，就可以像真正的軟骨一樣硬。但是成熟的自體軟骨細(xì)胞擴(kuò)增困難，自體軟骨組織來源有限，取材不方便，體外培養(yǎng)易發(fā)生去分化現(xiàn)象，失去軟骨形成能力。且其活性隨年齡增長而明顯下降，使得細(xì)胞擴(kuò)增受到限制，達(dá)不到組織構(gòu)建的要求。這些問題限制了組織工程產(chǎn)品自體透明軟骨(lhcg)很難推廣到臨床上。

目前，較有前途的之勞關(guān)節(jié)軟骨疾病的方法就是關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量注射間充質(zhì)干細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞可以作為營養(yǎng)的生物活性因子啟動再生活動導(dǎo)致缺陷的修復(fù)。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)條件和移植后的固定問題限制了軟骨細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用。有研究首先將軟骨細(xì)胞種植于人工合成多聚物和膠原凝膠支架上，成功的在體外再生了軟骨組織，用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，獲得了滿意的效果。然而在細(xì)胞支架復(fù)合物移植入體內(nèi)后，支架將可能引起受者的免疫排斥反應(yīng)；原有組織和支架材料整合困難，復(fù)合物的機(jī)械強(qiáng)度較低。

脫細(xì)胞基質(zhì)(acellularmatrix，acm)一般指異體組織經(jīng)細(xì)胞滅活處理后，制備成無活體細(xì)胞存在的ecm成分和結(jié)構(gòu)。因其無抗原性，以及有良好的生物相容性，成為組織工程支架材料的選擇之一。脫細(xì)胞處理的真皮、心包、角膜、血管、膀胱、食管、小腸粘膜基質(zhì)、骨、肝臟等作為相應(yīng)組織的替代物已相繼開發(fā)成功，顯示出良好的應(yīng)用前景。將軟骨組織中的細(xì)胞脫除作為細(xì)胞支架，可以解決排斥反應(yīng)的問題，成為具有良好生物相容性的組織工程支架材料。然而由于自體軟骨組織來源有限，且細(xì)胞的脫除難度較大，故而自體軟骨脫除細(xì)胞制成的支架材料十分稀缺。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，本發(fā)明提供的方法對組織工程軟骨進(jìn)行脫細(xì)胞，所獲得的脫細(xì)胞軟骨與自體軟骨脫細(xì)胞后的性能一致。

本發(fā)明提供的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，為將組織工程軟骨依次經(jīng)a液、b液處理后，以rnasea和dnasei酶解，然后經(jīng)c液處理，獲得脫細(xì)胞軟骨；

所述a液為含有蛋白酶抑制劑的tris-hcl緩沖液，其中蛋白酶抑制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％～1％；

所述b液為含有sds和蛋白酶抑制劑的tris-hcl緩沖液，其中蛋白酶抑制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％～1％；sds的體積分?jǐn)?shù)為2％；

所述c液為含有tritonx-100的tris-hcl緩沖液，其中tritonx-100的體積分?jǐn)?shù)為1％。

所述a液的tris-hcl緩沖液中，tris-hcl的濃度為1～100mm；ph值為5.0～8。

所述b液的tris-hcl緩沖液中，tris-hcl的濃度為1～100mm；ph值為5.0～8。

所述c液的tris-hcl緩沖液中，tris-hcl的濃度為1～100mm；ph值為5.0～8。

一些實(shí)施例中，a液處理的條件為0～4℃，震蕩處理48h。

一些實(shí)施例中，b液處理的條件為0～4℃，震蕩處理48h，然后以蒸餾水沖洗24h。

一些實(shí)施例中，rnasea和dnasei酶解酶解中，rnasea的量為1g/l；dnasei的量為500u/ml。

一些實(shí)施例中，c液處理的條件為0～4℃，消化24h，然后以蒸餾水沖洗24h。

由于天然組織(自體軟骨)結(jié)構(gòu)致密，因此對于自體軟骨的脫細(xì)胞的方法是將自體軟骨破碎成小塊之后粘連碎塊，破壞了組織的完整性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)；而采用組織工程軟骨脫細(xì)胞可以在不破壞移植物完整性的前提下徹底地進(jìn)行。

并且，由于其生物結(jié)構(gòu)已被破壞，且無法恢復(fù)，自體軟骨脫細(xì)胞后，需經(jīng)將組織碎塊進(jìn)行粘連，以形成的移植物；但這種粘連形成的移植物相較于人工合成材料支架不具有明顯優(yōu)勢。而組織工程軟骨脫細(xì)胞可以保持組織工程軟骨原有的生物結(jié)構(gòu)，不需進(jìn)行粘連，性能也優(yōu)于人工合成材料。

采用組織工程軟骨進(jìn)行脫細(xì)胞處理，可以解決自體軟骨來源有限的問題，且由于脫除細(xì)胞后，避免了免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，在臨床上可實(shí)現(xiàn)同種異體甚至異種移植。異體/異種移植可以減少病人的手術(shù)次數(shù)。目前一般膝關(guān)節(jié)修復(fù)手術(shù)需手術(shù)兩次，第一次手術(shù)收集細(xì)胞，第二次手術(shù)植入同體移植物。異體/異種移植可以將手術(shù)減少到一次。同時(shí)可以避免供體部位壞死或者繼發(fā)性感染的問題。

但是常規(guī)培養(yǎng)的組織工程軟骨與自體軟骨存在區(qū)別，脫除細(xì)胞后作為支架使用效果不佳，故而優(yōu)選采用本申請?zhí)峁┑慕M織工程軟骨的制備方法。

本發(fā)明采用的組織工程軟骨為豬源組織工程軟骨，其為豬源軟骨組織經(jīng)培養(yǎng)獲得。

優(yōu)選的，組織工程軟骨的制備方法為：

步驟1：將自體軟骨以ii型膠原酶解后，以cm培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)；

步驟2：原代培養(yǎng)后的細(xì)胞以胰蛋白酶消化后，以海藻酸鈉溶液重懸；

步驟3：將重懸的細(xì)胞接至明膠包被的培養(yǎng)容器，0～4℃放置4min后，添加cacl2溶液，0～4℃放置4min，形成細(xì)胞凝膠；

步驟4：將細(xì)胞凝膠轉(zhuǎn)移至瓊脂糖包被的培養(yǎng)容器，以cc培養(yǎng)基培養(yǎng)15～25天，培養(yǎng)過程中每2～3天更換新鮮培養(yǎng)基；獲得組織工程軟骨。

自體軟骨的原代培養(yǎng)方法為：將軟骨組織經(jīng)消毒后置于cm培養(yǎng)基中，切碎后，棄除cm培養(yǎng)基，以1mg/mlii型膠原酶溶液，37℃，50rpm，消化14h；然后將消化軟骨組織的消化液1100rpm離心5min，去除上清；沉淀以cm培養(yǎng)基重懸，37℃，5％co2，飽和濕度培養(yǎng)8天，培養(yǎng)過程中每天更換新鮮cm培養(yǎng)基。更換新鮮培養(yǎng)基前以pbs緩沖液清洗細(xì)胞。培養(yǎng)至第8天，軟骨細(xì)胞融合度達(dá)到95％，傳代。

所述傳代指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞以胰蛋白酶消化后，轉(zhuǎn)接繼續(xù)培養(yǎng)的過程。

胰蛋白酶消化具體為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％胰蛋白酶，37℃，消化4min。

消化后，以cm培養(yǎng)基種質(zhì)消化，1100rpm，5min離心細(xì)胞，去上清。沉淀為軟骨細(xì)胞。

將軟骨細(xì)胞以海藻酸鈉溶液重懸。培養(yǎng)容器優(yōu)選24孔板。以濃度為1％～50％的明膠包被的24孔板；以濃度為0.1％～12％的瓊脂糖包被24孔板。

本發(fā)明實(shí)施例中，海藻酸鈉溶液的中海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％～20％。

作為優(yōu)選，海藻酸鈉溶液的中海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％。

本發(fā)明實(shí)施例中，重懸至海藻酸鈉溶液的中細(xì)胞的密度為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。

海藻酸鈉重懸細(xì)胞后，加入明膠包被的24孔板中，每孔400μl細(xì)胞懸液，往培養(yǎng)板孔中間加入，避免產(chǎn)生氣泡，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，使得細(xì)胞懸液鋪滿孔。

本發(fā)明實(shí)施例中，cacl2溶液的濃度為200mmol/l；cacl2溶液與海藻酸鈉溶液的體積比為1：1。

cacl2溶液加入方式為在孔壁上輕緩旋轉(zhuǎn)地加入。

提前向包被瓊脂糖的24孔板中每孔加入1mlcc培養(yǎng)基。用小勺子將凝固的細(xì)胞凝膠塊轉(zhuǎn)移到瓊脂糖包被的24孔板中培養(yǎng)。每隔2～3天換液，共培養(yǎng)20天，可以得到透明軟骨。

采用本發(fā)明提供的方法，軟骨細(xì)胞包裹于海藻酸鈉水凝膠中三維培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天，細(xì)胞生長不明顯，如圖2。但當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第20天時(shí)，可以看到細(xì)胞不斷增殖以及分泌基質(zhì)，呈組織樣的形態(tài)，如圖3。

實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供方法制備的基質(zhì)與未脫細(xì)胞的透明質(zhì)軟骨相比，未脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨和脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨的ii型膠原含量一致，但是脫細(xì)胞組中軟骨陷窩里面看不到細(xì)胞核的存在，而脫細(xì)胞組可以明顯的看到細(xì)胞核的存在，即脫細(xì)胞組的透明質(zhì)軟骨細(xì)胞被脫掉。另從dna定量和甲苯藍(lán)染色液可看出，細(xì)胞脫除的十分完全。

本發(fā)明所述制備方法制得的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)。

本發(fā)明提供的制備方法以組織工程化軟骨為原料，進(jìn)行細(xì)胞脫除，所獲得的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中無細(xì)胞存在，dna含量極低，而膠原蛋白的含量則不受影響。保持了良好的軟骨組織的完整性，生物結(jié)構(gòu)良好，作為支架使用能夠具有更加良好的的性能。

附圖說明

圖1示豬源軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)至第8天100×；

圖2示實(shí)施例2豬源軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)至第3天100×；

圖3示實(shí)施例2豬源軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)至第20天100×；

圖4示組織工程透明質(zhì)軟骨ii型膠原染色200×；

圖5示組織工程透明質(zhì)軟骨甲苯胺藍(lán)染色200×；

圖6示組織工程透明質(zhì)軟骨he染色200×；

圖7示組織工程透明質(zhì)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)ii型膠原染色200×；

圖8示組織工程透明質(zhì)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)甲苯胺藍(lán)染色200×；

圖9示組織工程透明質(zhì)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)he染色200×；

圖10示組織工程軟骨、組織工程脫細(xì)胞基質(zhì)、天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的dna含量測定；

圖11示對比例1天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)ii型膠原染色200×；

圖12示對比例1天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)甲苯胺藍(lán)染色200×；

圖13示對比例1天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)he染色200×；

圖14示對比例2常規(guī)組織工程軟骨i型膠原染色200×；

圖15示對比例2常規(guī)組織工程軟骨ii型膠原染色200×。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1軟骨原代培養(yǎng)

用手術(shù)刀將新鮮豬軟骨劃成多個(gè)小塊，從下往上將一塊塊軟骨撬出來，置于1×雙抗的pbs溶液中。稱重后迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺中。

將1×雙抗的pbs替換成10×雙抗的pbs溶液，用力搖晃裝有軟骨的離心管，持續(xù)10s。將軟骨轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到100mm的培養(yǎng)皿中。用1ml槍頭棄掉溶液，添加新的1×雙抗的pbs，用一個(gè)干凈的手術(shù)刀以及鑷子將軟骨片的內(nèi)表面刮干凈，棄掉pbs。

向處理干凈的軟骨片中加入10mlcm培養(yǎng)基，將軟骨片切成米粒大小的碎片，置于培養(yǎng)箱中待消化。棄掉cm培養(yǎng)基，添加15ml的1mg/mlii型膠原酶溶液。放在孵箱中搖床上，37℃消化14h(50rpm)。

消化結(jié)束，用1ml槍頭將消化軟骨組織的消化液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1100rpm離心5min，去除上清，添加cm培養(yǎng)基。接種在培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種的第2天，棄掉軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，用pbs沖洗一遍，添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至第8天，軟骨細(xì)胞融合度達(dá)到95％，如圖1所示。

實(shí)施例2組織工程軟骨的制備與檢測

一、軟骨細(xì)胞三維培養(yǎng)

(1)瓊脂糖包被培養(yǎng)板

瓊脂糖用前加熱溶解，鋪24孔板，置于4℃保存，凝固使用后使用。

(2)明膠基質(zhì)包被培養(yǎng)皿

明膠基質(zhì)用前加熱溶解，鋪24孔板，置于4℃保存。凝固后使用。

(3)消化軟骨細(xì)胞

胰蛋白酶提前置于37℃預(yù)熱，消化軟骨細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化4min。用cm培養(yǎng)基與胰蛋白酶1：1的比例終止消化。細(xì)胞用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，1100rpm，5min離心細(xì)胞，去上清。

(4)細(xì)胞用海藻酸鈉溶液重懸

以2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml海藻酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％，粘稠度為20～500cps)的比例，向細(xì)胞中加入海藻酸鈉溶液，重懸細(xì)胞。

(5)將細(xì)胞懸液加入到明膠基質(zhì)包被的24孔板中，每孔400μl細(xì)胞懸液，往培養(yǎng)板孔中間加入，避免產(chǎn)生氣泡，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，使得細(xì)胞懸液鋪滿孔。置于4℃，4min。

(6)4min后取出培養(yǎng)板，向有細(xì)胞的孔壁上輕緩旋轉(zhuǎn)地加入400μl200mmcacl2溶液/每孔。置于4℃，4min。

(7)提前向包被瓊脂糖的24孔板中每孔加入1mlcc培養(yǎng)基。用小勺子將凝固的細(xì)胞凝膠塊轉(zhuǎn)移到瓊脂糖包被的24孔板中培養(yǎng)。每隔2～3天換液，共培養(yǎng)20天，可以得到透明軟骨。如圖2和圖3所示。

二、透明軟骨的鑒定

①ii型膠原免疫組化檢測軟骨中細(xì)胞核的含量以及ii型膠原的情況：

1.4μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；2.pbs洗3×3min；3.3％h2o2室溫20min，pbs洗3×3min；4.消化4％胃蛋白醇60min，pbs洗3×3min；5.一抗1:50，4℃過夜，pbs洗3×3min；6.生物素化豬抗羊igg1:200，37℃，30min；7.pbs洗3×3min；8.streptavidin-hrp，1:20037℃，30min；9.pbs洗3×3min；

10.0.05％dab+0.03％h2o2顯色8～12min，水洗；11.蘇木素襯染，水洗；12.吹干，樹脂封片；13.結(jié)果觀察：陽性呈棕褐色，背景為紫藍(lán)色。結(jié)果如圖4。

②甲苯胺藍(lán)染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量以及軟骨基質(zhì)粘多糖(gag)的含量：

1、石蠟切片脫蠟至水；2、蒸餾水浸洗3次；3、0.1％甲苯胺藍(lán)液浸染10min；4、水洗，洗去多余染液；5、各級酒精脫水；6、二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果如圖5

③he染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-無水乙醇ⅰ10min-無水乙醇ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸餾水洗。2、蘇木素染細(xì)胞核：切片入harris蘇木素染3-8min，自來水洗，1％的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6％氨水返藍(lán)，流水沖洗。3、伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色1-3min。4、脫水封片：將切片依次放入95％酒精i5min-95％酒精ii5min-無水乙醇ⅰ5min-無水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。結(jié)果如圖6。

實(shí)施例3脫細(xì)胞處理

對軟骨行如下處理:①將軟骨置入tris-hcl(ph7.4)緩沖液中,緩沖液內(nèi)含蛋白酶抑制劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.035％的pmsf),4℃恒溫震蕩48小時(shí)；②2％sds的低滲tris–hcl緩沖溶液(體積/體積)內(nèi)加蛋白酶抑制劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.035％的pmsf),4℃恒溫震蕩48小時(shí)后取出，以蒸餾水連續(xù)沖洗24小時(shí)；③1g/lrnasea、500u/mldnasei混合消化酶液37℃消化4小時(shí)；④置入含1％tritonx-100的低滲tris–hcl緩沖溶液中，4℃消化24小時(shí)，取出后蒸餾水連續(xù)沖洗48小時(shí)，完成對軟骨的脫細(xì)胞處理，即成為軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)(cartilageacellularmatrix；cacm)。

①ii型膠原免疫組化檢測軟骨中ii型膠原的情況，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖7，未脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨和脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨進(jìn)行ii型膠原，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，未脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨和脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨的ii型膠原含量差不多，但是脫細(xì)胞組中軟骨陷窩里面看不到細(xì)胞核的存在，而脫細(xì)胞組可以明顯的看到細(xì)胞核的存在，即脫細(xì)胞組的透明質(zhì)軟骨細(xì)胞被脫掉。

②甲苯胺藍(lán)染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖8；從甲苯胺藍(lán)染色可以看出，未脫細(xì)胞的透明質(zhì)軟骨比脫細(xì)胞組甲苯胺藍(lán)含量要多，但是脫細(xì)胞組軟骨陷窩里看不到細(xì)胞核的存在，即無細(xì)胞的存在，代表透明質(zhì)軟骨中的細(xì)胞被脫掉。

③he染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖9；

從he染色可以看出，未脫細(xì)胞的透明質(zhì)軟骨陷窩里看能夠看到細(xì)胞核的存在，而脫細(xì)胞的透明質(zhì)軟骨無細(xì)胞的存在，代表透明質(zhì)軟骨中的細(xì)胞被脫掉。

④將制備的脫細(xì)胞透明質(zhì)軟骨基質(zhì)(ecm)(n＝3)以及未脫細(xì)胞的透明質(zhì)軟骨(n＝3)，經(jīng)50mm檸檬酸鈉溶液溶解，2000r/min，離心10min，棄上清，加入乙二胺四乙酸和木瓜蛋白酶在65℃水浴中裂解72小時(shí)，10000r/min，5min離心取上清，樣本加入等量hoechst33258，以小牛胸腺提取的dna作為標(biāo)準(zhǔn)品，熒光比色定量檢測樣本中dna的含量，如圖10，表1。

對比例1

將豬膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行反復(fù)沖洗，并放粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，然后放入ph7.5、溫度為4℃無菌pbs中浸泡，離心5min，速度2000rpm，去除沉淀。將上層軟骨碎片再次進(jìn)行5min離心，速度為8000rpm，篩選出直徑在100-154μm的軟骨粒，根據(jù)改進(jìn)的courtman改良法進(jìn)行脫細(xì)胞處理。①向獲得的軟骨粒中加入含濃度為0.25％胰蛋白酶和0.03％edta的pbs，震蕩1h，離心3次，速度為7000rpm，采用pbs進(jìn)行沖洗。②在4℃下加入濃度為1％的tritonx-100及10mm的tris-hcl(ph＝7.5)和濃度為0.035％的pmsf，震蕩24-72h，離心后采用pbs沖洗。③在37℃下放入濃度為50u/mldna酶及1u/mlrna酶，消化12h，離心后采用pbs沖洗。④在溫度4℃下加入濃度為1％的tritonx-100的10mm的tris-hcl(ph＝7.5)，震蕩24h、沖洗后獲得白色粉末狀沉淀。將其放入磨具中，冷凍、烘干后獲得脫細(xì)胞基質(zhì)。

①ii型膠原免疫組化檢測軟骨中ii型膠原的情況，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖11，天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)和組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行ii型膠原檢測，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)比組織工程軟骨脫細(xì)胞的ii型膠原含量要少，且組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中的軟骨陷窩里面看不到細(xì)胞核的存在，而天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組可以明顯的看到細(xì)胞核的存在，即組織工程軟骨比透明質(zhì)軟骨更易脫掉細(xì)胞。

②甲苯胺藍(lán)染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量

甲苯胺藍(lán)染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖12；從甲苯胺藍(lán)染色可以看出，組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)種的gag含量比天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中的含量多。且組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中的軟骨陷窩里面看不到細(xì)胞核的存在，而天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組可以明顯的看到細(xì)胞核的存在，即組織工程軟骨比透明質(zhì)軟骨更易脫掉細(xì)胞。

③he染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量

甲苯胺藍(lán)染色檢測軟骨中細(xì)胞核的含量，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖13；從he染色結(jié)果中看出，組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中的軟骨陷窩里面看不到細(xì)胞核的存在，而天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組可以明顯的看到細(xì)胞核的存在，即進(jìn)一步說明組織工程軟骨比透明質(zhì)軟骨更易脫掉細(xì)胞。

④dna含量測定

dna含量測定檢測軟骨中細(xì)胞核(或者dna的含量)的含量，方法同實(shí)施例2，結(jié)果如圖10，表1。從結(jié)果中可以看出，與組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)相比，天然軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中含較多的dna。即天然軟骨脫細(xì)胞不徹底。

對比例2軟骨細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)法(常規(guī)組織工程軟骨培養(yǎng)方法)

1、消化軟骨細(xì)胞

原代豬軟骨細(xì)胞培養(yǎng)至第8天，軟骨細(xì)胞融合度達(dá)到95％。胰蛋白酶提前置于37℃預(yù)熱，消化軟骨細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化4min。用cm培養(yǎng)基與胰蛋白酶1：1的比例終止消化。細(xì)胞用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，1100rpm，5min離心細(xì)胞，去上清。

2、軟骨細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)

取3×10⁵個(gè)/團(tuán)于錐形管中，120g離心，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)(開蓋，置于培養(yǎng)箱中)。2天后，團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到未包被的24孔板中，進(jìn)一步使其分化。

其中培養(yǎng)基為dmem/f12，1％雙抗，1％neaa，1％(its)，1％維生素c，10ng/mltgf-β3。培養(yǎng)至第20天，細(xì)胞團(tuán)塊形成組織。

3、脫細(xì)胞處理

實(shí)驗(yàn)步驟如本實(shí)施例3。

試驗(yàn)效果：

表1軟骨dna含量的測定

表1中數(shù)據(jù)來自以實(shí)施例2制備的組織工程軟骨，經(jīng)實(shí)施例3的脫細(xì)胞處理；天然軟骨來自實(shí)施例1獲取的豬天然軟骨；常規(guī)組織工程軟骨來自對比例2中的細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)方法獲得的組織工程軟骨。

結(jié)果可以看出，未脫細(xì)胞組(untreated)的組織工程軟骨可以檢測到dna(100％，濃度為400ng/mg)。而脫細(xì)胞組的組織工程軟骨并未檢測到dna的存在(0％，濃度為0ng/mg)，即不存在細(xì)胞。常規(guī)組織工程軟骨脫細(xì)胞之后檢測dna殘余37.5％，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于本實(shí)施例2中的組織工程軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)dna含量。即本實(shí)施例2中的組織工程軟骨較常規(guī)組織工程軟骨易于脫細(xì)胞處理。

并且，實(shí)施例3制備的組織工程軟骨組織結(jié)構(gòu)良好，細(xì)胞分布均勻。與天然軟骨相比，實(shí)施例3的組織工程軟骨呈現(xiàn)海綿狀的疏松狀態(tài)。能夠和周圍的軟骨組織很好的接觸，并且細(xì)胞易于脫去；且可以根據(jù)需要裁剪成相應(yīng)規(guī)格的軟骨；更重要的是，實(shí)施例3制得的是透明質(zhì)軟骨，分泌的ii型膠原含量高，即主要形成透明質(zhì)軟骨(成分與天然軟骨相似)。而常規(guī)組織工程軟骨(對比例2)則細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞不易脫去。形狀不規(guī)則，與周圍組織不能形成很好的接觸。團(tuán)塊中的i型膠原含量高，即形成了含量較高的纖維軟骨。與實(shí)施例3比較，以相同細(xì)胞接種量、相同的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行三維培養(yǎng)，對比例2中的細(xì)胞生長較慢，形成的團(tuán)塊較小。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。