本發(fā)明涉及生物制劑，具體地，涉及一種多功能仿溶瘤病毒納米藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、黑色素瘤是侵襲性和致死性最強(qiáng)的惡性腫瘤之一。近年來，我國(guó)黑色素瘤年發(fā)病率以3～6％的速度迅速增長(zhǎng)。由于黑色素瘤生長(zhǎng)快難以遏制，一旦病情惡化極易發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者錯(cuò)過最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法可以在一定程度上改善晚期黑色素瘤的生存預(yù)后，但其高達(dá)55％的無應(yīng)答率極大地限制了免疫療法的臨床受益率。因此，尋找新的黑色素瘤免疫治療策略具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

2、焦亡是一種新定義的程序性細(xì)胞死亡模式，由gasdermin家族觸發(fā)，其特點(diǎn)是細(xì)胞發(fā)生吐泡、破裂。與凋亡相比，焦亡發(fā)生得更快，其裂解特性使其更有利于釋放腫瘤相關(guān)抗原。此外，焦亡的促炎性質(zhì)有可能重塑免疫微環(huán)境。這些特點(diǎn)提示焦亡是一種可取的免疫原性細(xì)胞死亡方式，觸發(fā)癌細(xì)胞焦亡有望成為一種有前途的癌癥治療策略。在現(xiàn)有技術(shù)已有的研究表明，feso4可以增強(qiáng)由cccp啟動(dòng)的活性氧(ros)信號(hào)，并誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的焦亡。然而，feso4在腫瘤中的藥物積累是不穩(wěn)定和不可控的。由于gasdermin在各種組織中廣泛表達(dá)，非靶向誘導(dǎo)焦亡將不可避免地導(dǎo)發(fā)全身性毒性。此外，腫瘤的異質(zhì)性、免疫抑制性腫瘤微環(huán)境和復(fù)雜的免疫逃避機(jī)制，使得有效地誘導(dǎo)腫瘤焦亡變得較為困難。因此，建立有效的靶向性焦亡誘導(dǎo)策略和聯(lián)合治療方案是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。

3、基于病毒的免疫療法是一種新興的、有前景的腫瘤治療策略。新城疫病毒(ndv)是一種優(yōu)異的溶瘤病毒(ov)，它對(duì)腫瘤細(xì)胞具有天然的靶向感染特性。溶瘤病毒在感染、復(fù)制和從癌細(xì)胞釋放的過程中，與癌癥的特定基因、蛋白質(zhì)或組織環(huán)境相互作用，從而可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和存活，這使得ovs與靶向治療協(xié)同作用成為可能，靶向治療通過干擾致癌和腫瘤生長(zhǎng)所需的特定分子來阻止腫瘤生長(zhǎng)。這一過程得益于病毒囊膜蛋白血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hn)與腫瘤表面高表達(dá)的唾液酸的特異性結(jié)合，然后由融合蛋白(f)介導(dǎo)病毒囊膜與腫瘤細(xì)胞膜的融合，從而將病毒基因組送入宿主細(xì)胞。與此同時(shí)，ndv囊膜蛋白具有免疫佐劑的特性，特別是hn蛋白，已被證明具有良好的抗腫瘤效果，它能介導(dǎo)高效的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)活性和強(qiáng)烈的i型干擾素反應(yīng)。這將有望進(jìn)一步放大焦亡的治療效果，從而克服腫瘤復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制。

4、綜上，由于天然病毒復(fù)制不可控并且遺傳物質(zhì)存在插入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)，因此，如何保留溶瘤病毒的靶向侵染能力和佐劑功能，同時(shí)避免天然病毒的安全問題是解決問題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種多功能仿溶瘤病毒納米藥物及其制備方法和應(yīng)用，通過協(xié)同焦亡和溶瘤病毒的特性來實(shí)現(xiàn)高效的抗腫瘤作用并重塑免疫微環(huán)境，本發(fā)明提供的仿病毒囊泡既能保留溶瘤病毒的靶向侵染能力和佐劑功能，同時(shí)又能夠避免天然病毒的安全問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案，一種多功能仿溶瘤病毒納米藥物，包括囊泡和具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)；所述囊泡為多功能仿溶瘤病毒納米藥物的外殼；具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)負(fù)載在所述外殼的內(nèi)部；所述囊泡為模仿新城疫病毒囊膜的工程化細(xì)胞膜與巨噬細(xì)胞膜雜化形成的；所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物通過協(xié)同焦亡和溶瘤病毒的特性來實(shí)現(xiàn)高效的抗腫瘤作用。

3、作用機(jī)理包括：

4、cccp介導(dǎo)線粒體功能障礙促使癌細(xì)胞釋放ros，esionps-adps提供鐵離子進(jìn)而放大cccp誘導(dǎo)的ros升高，最終通過ros-tom20-caspase3-gsdme信號(hào)通路誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡。

5、優(yōu)選地，所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物通過將所述仿溶瘤病毒細(xì)胞膜和所述巨噬細(xì)胞膜進(jìn)行雜化，將兩種細(xì)胞膜融合在一起形成囊泡，所述具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)(cccp和esionps)在過膜擠壓的過程中負(fù)載在囊泡內(nèi)得到所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物。

6、優(yōu)選地，所述雜化包括將所述仿溶瘤病毒細(xì)胞膜和所述巨噬細(xì)胞膜混合后通過多次反復(fù)過膜擠壓。

7、優(yōu)選地，所述具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)包括極小氧化鐵納米顆粒(esionps-adps)和氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。

8、優(yōu)選地，所述極小氧化鐵納米顆粒具有親水性。

9、優(yōu)選地，所述的極小氧化鐵納米顆粒的尺寸范圍為3～5nm；

10、優(yōu)選地，所述氧化磷酸化解偶聯(lián)劑為羰基氰化氯苯腙(cccp)。

11、優(yōu)選地，所述模仿新城疫病毒囊膜的工程化細(xì)胞膜包括表達(dá)新城疫病毒的血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(hn)和融合蛋白(f)的293t細(xì)胞膜；

12、優(yōu)選地，所述巨噬細(xì)胞膜包括raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞膜。

13、為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明還提供了另一個(gè)技術(shù)方案，包括上述多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，具體包括以下步驟：

14、s1.構(gòu)建表達(dá)溶瘤病毒囊膜蛋白的工程化細(xì)胞系，收集并裂解細(xì)胞，獲得仿溶瘤病毒細(xì)胞膜；

15、s2.培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，收集并裂解細(xì)胞，獲得巨噬細(xì)胞膜；

16、s3.合成極小氧化鐵納米顆粒(esionps-adps)；

17、s4.將所述仿溶瘤病毒細(xì)胞膜、所述巨噬細(xì)胞膜與具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)混合，通過擠壓過膜的方式，獲得多功能仿溶瘤病毒納米藥物。通過所述仿溶瘤病毒細(xì)胞膜和所述巨噬細(xì)胞膜的雜化作用，也就是將上述的兩種細(xì)胞膜混合在一起之后通過反復(fù)擠壓(50次以上的過膜擠壓)，將兩種細(xì)胞膜融合在一起形成囊泡，具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)(cccp和esionps)在過膜擠壓的過程中負(fù)載在囊泡內(nèi)。

18、本發(fā)明技術(shù)方案的技術(shù)效果：

19、1.通過采用本發(fā)明的技術(shù)方案，利用構(gòu)建的雜化仿溶瘤病毒細(xì)胞膜模擬溶瘤病毒囊膜，提高了負(fù)載藥物的腫瘤靶向能力和細(xì)胞攝取效率；尤其地，本發(fā)明通過將仿溶瘤病毒細(xì)胞膜與巨噬細(xì)胞膜進(jìn)行雜化形成囊泡，作為藥物的外殼將具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)負(fù)載在其內(nèi)部，從而延長(zhǎng)了納米顆粒的在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，避免病毒蛋白修飾引起的免疫清除，從而進(jìn)一步提高了納米顆粒在腫瘤中的富集度。

20、2.通過采用本發(fā)明的技術(shù)方案，構(gòu)建的多功能仿溶瘤病毒納米藥物，是一種兼具溶瘤病毒的腫瘤靶向特性和免疫佐劑功能，以及焦亡的裂解性和促炎性功能的納米藥物，通過協(xié)同焦亡和溶瘤病毒介導(dǎo)的免疫激活和促炎癥反應(yīng)來重塑免疫微環(huán)境，從而有效地抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，本發(fā)明為靶向性焦亡誘導(dǎo)策略和聯(lián)合治療提供了一種新的組合策略。

技術(shù)特征：

1.一種多功能仿溶瘤病毒納米藥物，其特征在于，包括囊泡和具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)形成的hvmnv@fe-c形態(tài)；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物，其特征在于，所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物通過將所述仿溶瘤病毒細(xì)胞膜和所述巨噬細(xì)胞膜進(jìn)行雜化，將兩種細(xì)胞膜經(jīng)擠出過膜的方法融合在一起形成囊泡；所述具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)(cccp和esionps)在擠出過膜的過程中負(fù)載在囊泡內(nèi)得到所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物，其特征在于，

4.一種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，其特征在于，s1中，所述仿溶瘤病毒細(xì)胞膜的制備方法，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，其特征在于，s2中，所述巨噬細(xì)胞膜的制備方法，具體包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，其特征在于，s3中，所述極小氧化鐵納米顆粒的制備方法，具體包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，其特征在于，s4中，所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，具體包括：將仿病毒細(xì)胞膜與巨噬細(xì)胞膜混合在pbs溶液中；邊超聲邊加入羰基氰化氯苯腙，離心去除藥物沉淀；最后在離心后的上清液中加入極小氧化鐵納米顆粒，混合均勻后通過多孔膜進(jìn)行過膜擠出，最后采用離心法收集棕色沉淀物即為多功能仿溶瘤病毒納米藥物；

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物的制備方法，其特征在于，

10.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的多功能仿溶瘤病毒納米藥物在抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)中的應(yīng)用；通過仿病毒修飾提高納米藥物對(duì)腫瘤的靶向性，并協(xié)同焦亡和溶瘤病毒介導(dǎo)的免疫激活和促炎癥反應(yīng)來重塑免疫微環(huán)境。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種多功能仿溶瘤病毒納米藥物及其制備方法和應(yīng)用，多功能仿溶瘤病毒納米藥物包括囊泡和具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)；所述囊泡為多功能仿溶瘤病毒納米藥物的外殼；具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)負(fù)載在所述外殼的內(nèi)部；所述囊泡為模仿新城疫病毒囊膜的工程化細(xì)胞膜與巨噬細(xì)胞膜雜化形成的；所述多功能仿溶瘤病毒納米藥物通過協(xié)同焦亡和溶瘤病毒的特性來實(shí)現(xiàn)腫瘤殺傷、免疫激活和腫瘤靶向性。本發(fā)明通過將仿溶瘤病毒細(xì)胞膜與巨噬細(xì)胞膜進(jìn)行雜化形成囊泡，作為藥物的外殼將具有焦亡誘導(dǎo)功能的物質(zhì)負(fù)載在其內(nèi)部，從而延長(zhǎng)了納米顆粒的在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，避免病毒蛋白修飾引起的免疫清除，從而進(jìn)一步提高了納米顆粒在腫瘤中的富集度。

技術(shù)研發(fā)人員：裴仁軍,馬凡舒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2