本發(fā)明涉及一種包括以解毒的大腸桿菌(escherichia?coli)不穩(wěn)定毒素(lt)為佐劑的粘膜病毒抗原的鼻內(nèi)疫苗組合物，以及使用所述鼻內(nèi)疫苗組合物來預(yù)防粘膜病毒感染的方法。具體地，所述鼻內(nèi)疫苗組合物是預(yù)防冠狀病毒或流感病毒感染的增強劑。

背景技術(shù)：

1、sars-cov-2病毒引起了全球大流行。幾種不同機制的用于sars-cov-2的新型疫苗已經(jīng)進入iii期試驗或已經(jīng)獲得eua批準(zhǔn)。這些疫苗包含經(jīng)核苷修飾mrna疫苗、基于腺病毒的疫苗和重組亞基疫苗。用于sars-cov-2的疫苗的快速開發(fā)是生物技術(shù)領(lǐng)域的前所未有的成就。然而，如奧密克戎(omicron)等sars-cov-2變體表現(xiàn)出免疫逃避增加，疫苗有效性降低(科恩ba(cohn?ba),西里洛pm(cirillo?pm),墨菲cc(murphy?cc),克里格勃姆ny(krigbaum?ny),華萊士aw(wallace?aw)：2021年美國老兵的sars-cov-2疫苗保護和死亡(sars-cov-2vaccine?protection?and?deaths?among?us?veterans?during?2021).科學(xué)(science)2022,375(6578):331-336；盧卡斯c(lucas?c),威格爾cbf(vogels?cbf),耶爾德勒姆i(yildirim?i),羅特曼je(rothman?je),盧p(lu?p),蒙泰羅v(monteiro?v),格爾豪斯曼jr(gehlhausen?jr),坎貝爾m(campbell?m),希爾瓦j(silva?j),泰巴克瓦a(tabachnikova?a)等人：循環(huán)的sars-cov-2變體對mrna疫苗誘導(dǎo)的免疫的影響(impact?ofcirculating?sars-cov-2variants?on?mrna?vaccine-induced?immunity).自然(nature)2021,600(7889):523-529；施密特f(schmidt?f),穆克斯福f(muecksch?f),威斯布勒姆y(weisblum?y),達席爾瓦j(da?silva?j),貝德納爾斯基e(bednarski?e),曹a(cho?a),王z(wang?z),蓋布勒c(gaebler?c),卡斯基m(caskey?m),努森微格mc(nussenzweig?mc)等人：對sars-cov-2奧密克戎變體的血漿中和(plasma?neutralization?of?the?sars-cov-2omicron?variant).新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(n?engl?j?med)2022,386(6):599-601)。目前，除了巴拉特公司(bharat)的一種基于腺病毒載體的鼻內(nèi)疫苗(incovacc)之外，所有其它sars-cov-2疫苗都需要肌內(nèi)(im)施用。通過im途徑接種的疫苗的跟蹤記錄安全性良好并且提供強大的體液免疫；然而，im增強劑后四個月，功效通常會減弱(科恩ba,西里洛pm,墨菲cc,克里格勃姆ny,華萊士aw：2021年美國老兵的sars-cov-2疫苗保護和死亡.科學(xué)2022,375(6578):331-336；采萊c(cele?s),杰克遜l(jackson?l),庫利ds(khoury?ds),卡恩k(khan?k),莫耶格威特t(moyo-gwete?t),特格力h(tegally?h),莎安je(san?je),克羅莫d(cromer?d),舍佩斯c(scheepers?c),阿莫克dg(amoako?dg)等人：奧密克戎廣泛地但不完全地逃避輝瑞公司bnt162b2中和(omicron?extensively?but?incompletely?escapespfizer?bnt162b2?neutralization).自然2022,602(7898):654-656；開莫特利h(chemaitelly?h),唐p(tang?p),哈桑mr(hasan?mr),阿爾穆克達s(almukdad?s),亞辛hm(yassine?hm),本蘇萊曼fm(benslimane?fm),哈蒂布ha(al?khatib?ha),科伊爾p(coylep),阿尤布hh(ayoub?hh),阿爾卡納尼z(al?kanaani?z)等人：bnt162b2疫苗在卡塔爾對sars-cov-2感染的保護減弱(waning?of?bnt162b2?vaccine?protection?against?sars-cov-2infection?in?qatar).新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(n?engl?j?med)2021,385(24):e83)。im疫苗接種的另一個關(guān)鍵問題在于粘膜免疫差，所述粘膜免疫可能是破壞sars-cov-2感染和防止傳播所必需的(莫羅v(mouro?v),費徹爾a(fischer?a)：應(yīng)對粘膜病毒大流行：來自covid-19疫苗的教訓(xùn)(dealing?with?a?mucosal?viral?pandemic:lessons?from?covid-19vaccines).粘膜免疫學(xué)(mucosal?immunol)2022,15(4):584-594；李m(li?m),王h(wangh),田l(tian?l),龐z(pang?z),楊q(yang?q),黃t(huang?t),范j(fan?j),宋l(song?l),佟y(tong?y),范h(fan?h)：covid-19疫苗開發(fā)：里程碑、教訓(xùn)和前景(covid-19vaccinedevelopment:milestones,lessons?and?prospects).信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與目標(biāo)療法(signaltransduct?target?ther)2022,7(1):146；拉塞爾mw(russell?mw),摩爾多瓦奴z(moldoveanu?z),奧格拉pl(ogra?pl),梅斯特茨基j(mestecky?j)：covid-19的粘膜免疫：sars-cov-2感染的忽略但重要的方面(mucosal?immunity?in?covid-19:a?neglected?butcritical?aspect?of?sars-cov-2infection).免疫學(xué)前沿(front?immunol)2020,11:611337；拉塞爾mw,梅斯特茨基j：粘膜免疫：了解sars-cov-2感染和傳播的缺失環(huán)節(jié)(mucosal?immunity:the?missing?link?in?comprehending?sars-cov-2infection?andtransmission).免疫學(xué)前沿2022,13:957107；黃m(huang?m),張m(zhang?m),朱h(zhu?h),杜x(du?x),王j(wang?j)：粘膜疫苗遞送：關(guān)注于突破具體障礙(mucosal?vaccinedelivery:a?focus?on?the?breakthrough?of?specific?barriers).藥物學(xué)報b(actapharm?sin?b)2022,12(9):3456-3474)。

2、粘膜免疫是一種隔室化的免疫應(yīng)答，在防御通過粘膜進行的感染中起著關(guān)鍵作用(mucosal?immunity?is?a?compartmentalized?immune?response?playing?a?criticalrole?in?defending?against?infection?via?mucosa).粘膜疫苗接種升高了對感染部位的感染特異性粘膜免疫(mucosal?vaccination?elevates?infection-specific?mucosalimmunity?to?infecting?sites)米克爾-克魯普斯a(miquel-clopes?a),本特利eg(bentley?eg),斯圖爾特jp(stewart?jp),卡丁sr(carding?sr)：粘膜疫苗和技術(shù)(mucosalvaccines?and?technology).臨床和實驗免疫學(xué)(clin?exp?immunol)2019,196(2):205-214)。分泌性iga(siga)是粘膜免疫的一個標(biāo)志物。與igg在防止疾病癥狀進展方面的關(guān)鍵作用不同，siga對受感染部位的感染性微生物作出應(yīng)答。盡管粘膜免疫對sars-cov-2起著關(guān)鍵作用，但只有印度巴拉特公司開發(fā)的一種粘膜疫苗獲得批準(zhǔn)(瓦爾特茲e(waltz?e)：中國和印度批準(zhǔn)了鼻covid疫苗-這些疫苗是游戲改變者嗎？(china?and?india?approvenasal?covid?vaccines–are?they?a?game?changer？)自然2022,609(7927):450)。延遲開發(fā)粘膜疫苗可能是由于上皮軌跡的耐受原性質(zhì)和對由鼻內(nèi)佐劑誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)不良事件的擔(dān)憂。

3、目前針對covid-19的疫苗包括用于誘導(dǎo)細胞和體液免疫的sars-cov-2編碼性核苷酸或重組刺突抗原(s-2p)的im施用。盡管im疫苗會誘導(dǎo)強效刺突特異性igg，但臨床證據(jù)顯示，通過im途徑致敏和增強不足以停止sars-cov-2傳播。為了克服所述缺陷，迫切需要一種有效的粘膜疫苗來終止病毒的感染和傳播。

4、30年來已經(jīng)將大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(lt)作為有效的鼻內(nèi)(in)佐劑進行了廣泛研究(克萊門茨jd(clements?jd),哈佐格nm(hartzog?nm),利昂fl(lyon?fl)：大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的佐劑活性和誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)對不相關(guān)的蛋白抗原的口服抗性的影響(adjuvant?activity?of?escherichia?coli?heat-labile?enterotoxin?and?effect?onthe?induction?of?oral?tolerance?in?mice?to?unrelated?protein?antigens).疫苗(vaccine)1988,6(3):269-277；哈什古茨k(hashigucci?k),奧格瓦h(ogawa?h),愛仕達特t(ishidate?t),亞馬世特r(yamashita?r),卡米亞h(kamiya?h),瓦特納布k(watanabe?k),哈特利n(hattori?n),薩特t(sato?t),鈴木y(suzuki?y),納格麥t(nagamine?t)等人：在志愿者體內(nèi)由與含有痕量的全毒素的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素b亞基組合的鼻流感疫苗誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答(antibody?responses?in?volunteers?induced?by?nasal?influenzavaccine?combined?with?escherichia?coli?heat-labile?enterotoxin?b?subunitcontaining?a?trace?amount?of?the?holotoxin).疫苗1996,14(2):113-119；史蒂芬森i(stephenson?i),贊邦mc(zambon?mc),魯丁a(rudin?a),科爾戈特a(colegate?a),波達a(podda?a),布加尼r(bugarini?r),德爾朱迪切g(shù)(del?giudice?g),米努特魯a(minutelloa),博寧頓s(bonnington?s),霍姆格倫j(holmgren?j)等人：對使用成人志愿者以非產(chǎn)毒性大腸桿菌腸毒素和新型生物載體作為粘膜佐劑的鼻內(nèi)三價滅活流感疫苗的i期評估(phasei?evaluation?of?intranasal?trivalent?inactivated?influenza?vaccine?withnontoxigenic?escherichia?coli?enterotoxin?and?novel?biovector?as?mucosaladjuvants,using?adult?volunteers).病毒學(xué)期刊(j?virol)2006；80(10):4962-4970；沃克爾ri(walker?ri)：使用粘膜疫苗接種以實現(xiàn)更有效的免疫處理的新策略(newstrategies?for?using?mucosal?vaccination?to?achieve?more?effectiveimmunization).疫苗1994,12(5):387-400)。lth(αk)是來自人類分離物的完全解毒的大腸桿菌lt蛋白。在兩個in流感疫苗臨床試驗中，lth(αk)為佐劑的滅活鼻內(nèi)疫苗(iiv)引發(fā)了抵抗血凝的血清igg和siga兩者(潘sc(pan?sc),謝sm(hsieh?sm),林cf(lin?cf),許ys(hsuys),常m(chang?m),常sc(chang?sc)：一項用于評估具有佐劑lth(αk)的鼻內(nèi)施用的三價滅活流感疫苗的安全性和免疫原性的隨機化雙盲對照的臨床試驗：i期研究(a?randomized,double-blind,controlled?clinical?trial?to?evaluate?the?safety?andimmunogenicity?of?an?intranasally?administered?trivalent?inactivatedinfluenza?vaccine?with?adjuvant?lth(alphak):a?phase?i?study).疫苗2019,37(14):1994-2003；潘sc,許wt(hsu?wt),李ws(lee?ws),王nc(wang?nc),陳tj(chen?tj),劉mc(liumc),派hc(pai?hc),許ys,常m,謝sm：一項用于評估具有佐劑lth(αk)的鼻內(nèi)施用的三價滅活流感疫苗的安全性和免疫原性的雙盲隨機化的對照試驗：ii期研究(a?double-blind,randomized?controlled?trial?to?evaluate?the?safety?and?immunogenicity?of?anintranasally?administered?trivalent?inactivated?influenza?vaccine?with?theadjuvant?lth(alphak):a?phase?ii?study).疫苗2020,38(5):1048-1056)。然而，尚未報告lth(αk)為佐劑的滅活鼻內(nèi)疫苗(iiv)應(yīng)用于sars-cov-2大流行。

5、本領(lǐng)域已經(jīng)描述了混合疫苗接種，其還被稱為異源疫苗接種。例如，科恩ba,西里洛pm,墨菲cc,克里格勃姆ny,華萊士aw：2021年美國老兵的sars-cov-2疫苗保護和死亡.科學(xué)2022,375(6578):331-336描述了一項對混合疫苗接種的研究，所述研究包括用ltb亞基進行以增強疫苗的免疫原性的全身皮下致敏以及之后的口服增強。在研究中，將充當(dāng)t細胞抗原的sars-cov-2核衣殼與ltb共價連接。核衣殼是激活th-1并誘發(fā)il-2表達所需要的。

6、另一項研究(盧卡斯c,威格爾cbf,耶爾德勒姆i,羅特曼je,盧p,蒙泰羅v,格爾豪斯曼jr,坎貝爾m,希爾瓦j,泰巴克瓦a等人：循環(huán)的sars-cov-2變體對mrna疫苗誘導(dǎo)的免疫的影響.自然2021,600(7889):523-529)揭示了通過全身致敏-粘膜增強免疫處理得到的保護性免疫提高。在此研究中，對動物通過mrna疫苗進行致敏，并且用腺病毒載體疫苗通過粘膜途徑進行增強。腺病毒載體是一種具有插入的靶抗原的復(fù)制缺陷病毒。施用后，腺病毒載體感染細胞，并且將其病毒dna基因組傾入到細胞核中，以進行轉(zhuǎn)錄。腺病毒載體侵襲到宿主細胞中還誘導(dǎo)先天免疫介導(dǎo)的炎癥，并且促炎性il-1、il-6、tnf-α的突然出現(xiàn)驅(qū)動抗插入免疫。另外，復(fù)雜性促進免疫原性。除了插入是免疫所靶向的，整個腺病毒病毒粒子復(fù)合體也是疫苗接種所靶向的。

7、疫苗在傳染病的預(yù)防中發(fā)揮了重要作用。鑒于如sars-cov-2和季節(jié)性流感等粘膜病毒的持續(xù)大流行，仍需要有效的且患者依從的(如非侵入性)增強劑用于常規(guī)疫苗接種。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、腸外疫苗介導(dǎo)針對sars-cov-2的強全身免疫，但顯示出對分泌性iga(siga)、組織駐留記憶b(brm)和記憶t(trm)細胞激活的影響最小。大流行發(fā)生后三年，全球71％以上的群體已經(jīng)接受了通過腸外途徑接種的至少一個劑量的針對sars-cov-2感染的疫苗。然而，由于病毒的高突變率和目前疫苗接種對上呼吸道上皮細胞的保護不足，此疾病的傳播仍在持續(xù)。因此，上呼吸道疾病尚未得到有效預(yù)防。由于粘膜免疫是當(dāng)前大流行的一種潛在解決方案，因此開發(fā)了一種有效誘導(dǎo)抵抗病毒的血清igg、血清iga和粘膜iga的鼻內(nèi)增強劑。所述增強劑可以應(yīng)用于利用鼻內(nèi)致敏或肌內(nèi)致敏進行治療的受試者，所述鼻內(nèi)致敏被稱為混合疫苗接種方案。鼻內(nèi)致敏-鼻內(nèi)增強方案和涉及肌內(nèi)致敏和鼻內(nèi)增強的混合疫苗接種方案兩者會增強血清中和活性，并引發(fā)強大的粘膜中和活性。發(fā)現(xiàn)lth(αk)為佐劑的sars-cov-2刺突蛋白鼻內(nèi)(in)增強劑可顯著增強血清和鼻沖洗液樣品中的中和抗體滴度。這種lth(αk)為佐劑的in增強劑會增強小鼠模型中的th1/th2平衡的體液和粘膜免疫。會增強粘膜和循環(huán)免疫原性的in增強劑為疫苗接種帶來了具有臨床意義的粘膜防御。

2、除了誘導(dǎo)針對sars-cov-2的免疫外，本發(fā)明的in增強劑在使用以lth(αk)為佐劑的流感抗原來誘導(dǎo)針對流感病毒的體液免疫和粘膜免疫兩者方面也是有效的。發(fā)現(xiàn)lth(αk)在增強劑中是引發(fā)針對粘膜病毒的全身免疫和粘膜免疫的一種有效佐劑。相比于常規(guī)im增強劑，lth(αk)in增強劑在預(yù)防粘膜病毒感染和阻斷病毒傳播方面更有效。

3、本發(fā)明在以下章節(jié)中進行了詳細描述。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點可以在本發(fā)明的詳細說明和權(quán)利要求書中容易地找到。